頭發(fā)中氯硝西泮的分段分析在藥物輔助犯罪案件中的作用

陳航，向平，沈敏

（司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063）

頭發(fā)中氯硝西泮的分段分析在藥物輔助犯罪案件中的作用

陳航，向平，沈敏

（司法部司法鑒定科學(xué)技術(shù)研究所上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺，上海 200063）

目的通過分段分析頭發(fā)中的氯硝西泮，對藥物輔助犯罪案件中受害人的攝藥頻度及攝藥史進(jìn)行推斷。方法采用液氮冷凍研磨技術(shù)聯(lián)合超聲浴技術(shù)，以液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，對6名不同案件中受害人的頭發(fā)分段分析，并測定各頭發(fā)段中的氯硝西泮及7-氨基氯硝西泮的含量。結(jié)果6名受害人的部分頭發(fā)段中均檢出氯硝西泮及其代謝物7-氨基氯硝西泮，且頭發(fā)中藥物峰值濃度的出現(xiàn)時(shí)間與受害人自述攝藥時(shí)間相一致。結(jié)論頭發(fā)分段分析可提供攝藥頻度與攝藥時(shí)間信息，在藥物輔助犯罪案件中具有獨(dú)特的證據(jù)價(jià)值。

法醫(yī)毒理學(xué)；氯硝西泮；頭發(fā)；化學(xué)，分析；藥物輔助犯罪

藥物輔助犯罪是指利用藥物損傷受害人的行為能力而實(shí)施的麻醉搶劫、性侵犯等不法行為，其中以藥物輔助性侵犯（drug facilitated sexual assault，DFSA，又稱迷奸）為主[1]。當(dāng)前，國內(nèi)外的藥物輔助犯罪案件均呈上升趨勢，此類案件除對受害人造成人身傷害和財(cái)產(chǎn)損失、引發(fā)中毒或死亡外，還會引發(fā)社會公眾恐慌，對公共安全造成極大的威脅[2，3]。

藥物輔助犯罪案件中，由于用藥劑量小，體液檢材獲取不及時(shí)等問題，一直是法醫(yī)毒物鑒定的難點(diǎn)。頭發(fā)檢材具有易獲取、易保存、檢出時(shí)限長（數(shù)周至數(shù)月）、能反映長程用藥信息等優(yōu)點(diǎn)[4]，已成為國際法醫(yī)學(xué)界廣泛接受和使用的新型生物檢材[5，6]。現(xiàn)代分析技術(shù)的飛速發(fā)展使單次攝藥的頭發(fā)分段分析成為可能。本實(shí)驗(yàn)室在多年毛發(fā)分析研究[7-9]的基礎(chǔ)上，將高靈敏度的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS）技術(shù)結(jié)合液氮冷凍研磨技術(shù)，在保證化學(xué)性質(zhì)不穩(wěn)定目標(biāo)物不降解的同時(shí)，快速將富角蛋白的硬質(zhì)毛發(fā)粉碎為微米級顆粒，成倍擴(kuò)展比表面積，使用超聲浴等純物理手段大幅提高目標(biāo)物的釋放效率，使微量取樣下的毛發(fā)分析變?yōu)楝F(xiàn)實(shí)。

本研究利用所建的冷凍研磨聯(lián)合LC-MS/MS分析方法[8]，對4起迷奸案件中的6名受害人頭發(fā)進(jìn)行分段分析，討論頭發(fā)檢材在藥物輔助犯罪案件中的作用。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

API 4000 QTRAP三重四極桿線性離子阱質(zhì)譜儀（美國Applied Biosystems公司），AcquityTMUltra Performance LC超高壓液相色譜儀（美國Waters公司），Minspin高速離心機(jī)（德國Eppendorf公司），6700冷凍研磨機(jī)（美國SPEX CertiPrep公司），Milli-Q超純水制備系統(tǒng)（美國Millipore公司）。氯硝西泮、7-氨基氯硝西泮、氯硝西泮-d4均購自美國Cerilliant公司；乙腈（HPLC級）購自美國Sigma-Aldrich公司；乙酸銨（HPLC級）購自瑞士Fluka化學(xué)公司；其他化學(xué)試劑及藥品均為分析純。

1.2 分析方法

采用已建方法[8]進(jìn)行分析。貼頭皮剪取頭發(fā)，根部對齊，以2cm為一段進(jìn)行分段。取各段頭發(fā)，分別以水、二氯甲烷清洗。自然晾干后液氮冷凍研磨，稱取研磨所得頭發(fā)粉末20 mg，加入2 mL pH=8.4硼砂緩沖液，超聲浴處理1h。加入2.5mL乙醚渦旋，充分混合后離心，取有機(jī)層60℃水浴中揮干。殘余物中加入100μL流動相復(fù)溶，取5μL進(jìn)樣測定。

色譜條件：液相柱為Restek Allure PFP丙基柱（100 mm×2.1 mm，5 μm），前接Phenomenex保護(hù)柱（12.5mm×2.1mm，5μm）。流動相為V（乙腈）∶V（緩沖液）=70∶30，緩沖液為20 mmol/L乙酸胺-0.1%甲酸溶液。恒流200μL/min。

質(zhì)譜條件：電噴霧電離-正離子模式（ESI+）。碰撞氣（CAD）：7 psi。氣簾氣（CUR）：30 psi。離子噴射電壓（IS）：5500V。霧化氣（GS1）：35psi。輔助氣（GS2）：35psi。離子源溫度（TEM）：500℃。

1.3 案例

6名受害人，均為女性，在不同時(shí)間遭受性侵害，自述案發(fā)前均飲用過已開封或他人遞送的可疑飲料，案發(fā)時(shí)均出現(xiàn)不同程度的意識模糊、四肢無力、無法反抗等癥狀，個(gè)別受害人案發(fā)后對部分過程不能回憶。一段時(shí)間后采集其頭發(fā)，頭發(fā)及相關(guān)信息詳見表1。取6名受害人頭發(fā)，以2cm為一段進(jìn)行分段，按已建立的方法[8]對各發(fā)段進(jìn)行分析。

表1 6名受害人的基本信息

2 結(jié)果

在每名受害人頭發(fā)中，均有部分頭發(fā)段檢出氯硝西泮及其代謝物7-氨基氯硝西泮（圖1），部分頭發(fā)段則未檢出氯硝西泮及其代謝物。

對6名受害人各段頭發(fā)中的氯硝西泮及其代謝物進(jìn)行定量分析（表2）。分析結(jié)果顯示，氯硝西泮及其主要代謝物7-氨基氯硝西泮在受害人頭發(fā)中均存在峰值；氯硝西泮在6名受害人陽性頭發(fā)段中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在4.1～34.2pg/mg；除2號受害人外，7-氨基氯硝西泮在其余5名受害人陽性頭發(fā)段中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在6.3～192.1pg/mg。

另取1號受害人、4號受害人頭發(fā)，自發(fā)根起以0.5 cm為一段進(jìn)行分段，重點(diǎn)分析近發(fā)根部0～5 cm段。分析結(jié)果顯示（圖2），1號受害人、4號受害人頭發(fā)中氯硝西泮及7-氨基氯硝西泮的峰值均出現(xiàn)在1.5～2.0cm段。其中，1號受害人頭發(fā)中氯硝西泮峰值質(zhì)量分?jǐn)?shù)為32.3pg/mg，7-氨基氯硝西泮峰值質(zhì)量分?jǐn)?shù)為117.3pg/mg；4號受害人頭發(fā)中氯硝西泮峰值質(zhì)量分?jǐn)?shù)為29.6pg/mg，7-氨基氯硝西泮峰值質(zhì)量分?jǐn)?shù)為192.0pg/mg。

圖1 6名受害人陽性頭發(fā)段的MRM色譜圖

表2 6名受害人頭發(fā)中氯硝西泮及其代謝物的分布情況（pg/mg）

圖2 1號和4號受害人近發(fā)根部頭發(fā)中氯硝西泮及其代謝物的分布情況

3 討論

藥物輔助犯罪案件中所涉藥物包括中樞神經(jīng)抑制劑、興奮劑、致幻劑等精神活性物質(zhì)[10，11]。近年來，鑒定中發(fā)現(xiàn)氯硝西泮在藥物輔助犯罪案件中的出現(xiàn)率有增多趨勢，其藥物多制成乳劑并賦予誘惑性名稱（如“彌漫之夜”“惡魔丘比特”“聽話水”）或英文代號。此類案件常為單次攝藥，且藥物使用劑量小、代謝快、體內(nèi)含量低。另一方面，待受害人清醒并發(fā)現(xiàn)有財(cái)物損失或遭受性侵犯時(shí)，通常距攝藥已過去數(shù)小時(shí)，甚至更長時(shí)間，部分受害人限于心理壓力和社會因素等，報(bào)案不及時(shí)，此時(shí)其體液檢材往往已無法提供有效的攝藥證據(jù)。頭發(fā)檢材獨(dú)有的易獲取保存、檢出時(shí)限長（數(shù)周至數(shù)月）、能反映長程的用藥信息等優(yōu)勢[4]，使其在此類案件中往往能提供其他渠道無法獲得的關(guān)鍵信息。

3.1 攝藥頻度的區(qū)分

頭發(fā)中目標(biāo)物的含量范圍可用于初步區(qū)分?jǐn)z藥頻度。正常情況下，頭發(fā)中的目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)與攝入總量存在正相關(guān)性，偶爾或單次攝藥后，藥物進(jìn)入頭發(fā)呈一過性趨勢，長期或持續(xù)攝藥后，藥物隨攝藥頻度反復(fù)多次進(jìn)入頭發(fā)，并在頭發(fā)中積蓄存在。如John等[12]分析了11名服用氯硝西泮6～60d的患者頭發(fā)，其目標(biāo)物質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍為1 156～10400pg/mg。而單次攝藥者頭發(fā)中氯硝西泮水平普遍較低。在Negrusz等[13]的研究中，10名單次攝入氯硝西泮志愿者在服藥后第28天被采集頭發(fā)，其中0～2cm頭發(fā)段氯硝西泮<23pg/mg。本實(shí)驗(yàn)室曾在兩名單次攝入氯硝西泮女性的頭發(fā)中，測得氯硝西泮的峰值質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為11.9pg/mg和15.5pg/mg[14]。本研究中，6名受害人陽性頭發(fā)段內(nèi)的氯硝西泮質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍在4.1～34.2pg/mg，與文獻(xiàn)報(bào)道的單次攝藥后頭發(fā)中氯硝西泮質(zhì)量分?jǐn)?shù)范圍相近，同時(shí)遠(yuǎn)小于長期服用氯硝西泮患者頭發(fā)中目標(biāo)物的質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

通過頭發(fā)分段分析并對各頭發(fā)段中目標(biāo)物的分布情況進(jìn)行分析，是進(jìn)一步辨明攝藥頻度的關(guān)鍵。當(dāng)藥物由血液循環(huán)進(jìn)入頭發(fā)毛囊并固化于毛干后，會隨頭發(fā)的生長從發(fā)根向發(fā)梢移動。通過分段分析，可以相對準(zhǔn)確地反映被鑒定個(gè)體的涉藥史和用藥變化[15]，其分析結(jié)果成為用藥史調(diào)查的最優(yōu)表現(xiàn)形式[9]。理論上，自發(fā)根起的每1cm頭發(fā)的分析結(jié)果，都恰好反映所對應(yīng)月的攝藥情況。本研究團(tuán)隊(duì)通過對涉艾司唑侖、氯硝西泮和氯胺酮等目標(biāo)物的頭發(fā)進(jìn)行分段分析，發(fā)現(xiàn)由于頭發(fā)存在生長速度和周期差異、汗液污染、主動擴(kuò)散、頭發(fā)采樣及分段誤差等影響因素，使陽性點(diǎn)分散，在對成束頭發(fā)分析時(shí)，多段中均可呈陽性結(jié)果[8，16]。綜合這些因素，國際毛發(fā)分析協(xié)會前主席Kintz等[5]近期提出建議，如果屬單次攝藥的藥物輔助犯罪案件，那么對應(yīng)案發(fā)時(shí)間的頭發(fā)段中藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)應(yīng)最高，且與之前、之后的相鄰頭發(fā)段中質(zhì)量分?jǐn)?shù)相比，至少高3倍以上。本研究中6名受害人頭發(fā)中氯硝西泮呈單一峰值，4號、5號、6號受害人頭發(fā)中氯硝西泮分析結(jié)果以及2號和3號受害人頭發(fā)中代謝物分析結(jié)果符合此單次攝藥判斷建議，1號受害人頭發(fā)重新按0.5 cm分段分析后也符合此建議（峰值1～3cm段）。由于藥物在毛干上易擴(kuò)散，必要時(shí)可進(jìn)行更為細(xì)致的分段分析（如0.5 cm）和增加分析目標(biāo)物（如代謝物），以利于更好地觀察藥物在毛干上的分布。

3.2 攝藥時(shí)間的推斷

頭發(fā)生長速率約為1cm/月（范圍0.7～1.4cm/月）[17-19]，在頭頂枕部區(qū)域（圖3）該生長速率尤為穩(wěn)定。剪取該區(qū)域的頭發(fā)檢材，通過分段分析考察峰值質(zhì)量分?jǐn)?shù)段的出現(xiàn)位置，以對攝藥時(shí)間進(jìn)行回推。本研究中6名受害人的頭發(fā)檢材均取自該區(qū)域，采集距案發(fā)時(shí)長分別約為2個(gè)月、6個(gè)月、6個(gè)月、2個(gè)月、1個(gè)月和7個(gè)月，其對應(yīng)的頭發(fā)中氯硝西泮出現(xiàn)峰值質(zhì)量分?jǐn)?shù)的頭發(fā)段分別為0～2cm段、6～8 cm段、6～8 cm段、0～2 cm段、0～2cm段和6～8cm段，與頭發(fā)采集距案發(fā)時(shí)長間互相吻合。通過對1號受害人和4號受害人頭發(fā)進(jìn)一步更為精確的分段分析，頭發(fā)中氯硝西泮質(zhì)量分?jǐn)?shù)峰值出現(xiàn)的頭發(fā)段約為1.5～2.0cm段，和受害人自述的被侵犯時(shí)間相符（約60d）。

圖3 頭頂枕部區(qū)域位置

3.3 頭發(fā)分段分析的影響因素

除毛發(fā)本身、生長周期等內(nèi)部因素影響，燙染發(fā)、環(huán)境干擾等外部條件也影響著毛發(fā)分析結(jié)果的法醫(yī)學(xué)解釋。目標(biāo)物在頭發(fā)中穩(wěn)定存在，然而部分洗發(fā)產(chǎn)品、紫外線照射、燙染等均有可能影響頭發(fā)結(jié)構(gòu)，一方面可能造成頭發(fā)中目標(biāo)物的流失，另一方面也可能會加速由汗液及皮脂腺帶來的藥物侵入。在本研究中，1號受害人和5號受害人有染發(fā)習(xí)慣，其中5號受害人于受侵害后一周內(nèi)曾再次染發(fā)，2號受害人時(shí)常改變發(fā)型及發(fā)色，其發(fā)質(zhì)干枯，有較多分叉，3號、4號、6號受害人無燙染發(fā)習(xí)慣。通過比較6人頭發(fā)中目標(biāo)物含量及比例可知，頭發(fā)未經(jīng)燙染的三名受害人頭發(fā)中，氯硝西泮與7-氨基氯硝西泮的峰值質(zhì)量分?jǐn)?shù)比為0.18～0.22，染過色的兩名受害人頭發(fā)中，氯硝西泮與7-氨基氯硝西泮的峰值質(zhì)量分?jǐn)?shù)比超過了0.38，燙染頻度較高的2號受害人頭發(fā)段中，7-氨基氯硝西泮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)顯著降低。由于7-氨基氯硝西泮的穩(wěn)定性不如氯硝西泮，很可能在因燙染而受到損傷的頭發(fā)中發(fā)生分解和流失。故實(shí)踐中應(yīng)記錄頭發(fā)顏色、燙染等美發(fā)處理情況。

運(yùn)用頭發(fā)分段分析推斷攝藥時(shí)間可能存在一定的誤差。對攝藥時(shí)間推斷的主要影響因素包括以下幾個(gè)方面：（1）頭發(fā)生長速度存在個(gè)體差異，在0.7～1.4cm/月范圍。（2）藥物隨血液循環(huán)進(jìn)入毛囊，隨毛囊的生長露于皮膚表面，成為毛干，再生長到剪刀可采集的程度，至少需要兩周的時(shí)間。（3）停藥后毛發(fā)周圍的皮脂腺等周圍附屬結(jié)構(gòu)中存在的藥物仍在逐漸釋放。（4）個(gè)體的每根頭發(fā)處于不同的生長周期。在生長期的頭發(fā)中藥物隨毛干生長而向發(fā)梢方向移動，而在休止期的頭發(fā)中藥物隨頭發(fā)仍停留在原位。（5）對頭發(fā)進(jìn)行采樣、分段分析時(shí)均采用手工、剪刀進(jìn)行，亦存在差異[9，20]。大部分藥物輔助犯罪案件并不能按照案發(fā)后1個(gè)月采集頭發(fā)，有的間隔時(shí)間較長。隨著采樣間隔時(shí)間的增長，上述影響因素更為突出，頭發(fā)中藥物質(zhì)量分?jǐn)?shù)高峰與攝藥時(shí)間的對應(yīng)上可能更為模糊。

藥物輔助犯罪案件的認(rèn)定較為復(fù)雜，多種檢材的聯(lián)合分析有利于分析結(jié)果的解釋。頭發(fā)分段分析的陽性結(jié)果并不能區(qū)分主動與被動攝藥，并且難以區(qū)分兩周時(shí)間內(nèi)的攝藥。在上述案例中，4號受害人在前一日晚遭受性侵害，次日凌晨清醒后及時(shí)報(bào)案，警方即刻帶領(lǐng)4號受害人至就近醫(yī)院抽血，經(jīng)檢測，該血液中檢出氯硝西泮成分。通過將血液與頭發(fā)的分析結(jié)果相結(jié)合，將受害人的攝藥時(shí)間精確至“天”。警方通過調(diào)取監(jiān)控等技術(shù)手段，進(jìn)一步將攝藥時(shí)間鎖定至“小時(shí)”，形成了完整充分的證據(jù)鏈，使得嫌疑人從一開始的拒不認(rèn)罪轉(zhuǎn)變?yōu)橥暾淮赴高^程。

頭發(fā)中代謝物的檢出可排除外污染干擾，提供攝入信息。本研究所涉的6名受害人頭發(fā)中均檢出7-氨基氯硝西泮，質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于氯硝西泮。藥物進(jìn)入毛發(fā)與其物理化學(xué)性質(zhì)、特征官能團(tuán)相關(guān)，苯環(huán)上的氨基可增強(qiáng)藥物進(jìn)入毛發(fā)而羥基則是相反作用。如Cirimele等[21]研究發(fā)現(xiàn)，26名因藥物濫用致死的死者頭發(fā)中7-氨基氟硝西泮質(zhì)量分?jǐn)?shù)明顯高于氟硝西泮。毛發(fā)中更高質(zhì)量分?jǐn)?shù)的代謝物不僅降低了對檢測技術(shù)靈敏度的要求，也有利于排除外污染造成的假陽性結(jié)果。

3.4 結(jié)論

本研究利用液氮冷凍研磨技術(shù)聯(lián)合LC-MS/MS法分段分析頭發(fā)中的氯硝西泮及其代謝物7-氨基氯硝西泮，6名迷奸案受害女性的相應(yīng)頭發(fā)段中均檢出了氯硝西泮和7-氨基氯硝西泮，峰值發(fā)段與自述攝藥時(shí)間相吻合。頭發(fā)分段分析可在藥物輔助犯罪案件中發(fā)揮獨(dú)特的作用和價(jià)值，反映攝藥的長程信息（數(shù)周至數(shù)月），提供攝藥頻度與攝藥時(shí)間信息。值得關(guān)注的是，在藥物輔助犯罪案件中，需將頭發(fā)分段分析結(jié)果結(jié)合案情調(diào)查、現(xiàn)場勘驗(yàn)、其他檢驗(yàn)分析等，進(jìn)行綜合評定。此外在頭發(fā)分析結(jié)果評價(jià)中，應(yīng)充分考慮頭發(fā)生長速度、生長周期、頭發(fā)采樣、分段等差異以及藥物可經(jīng)汗腺、皮脂腺等分泌擴(kuò)散進(jìn)入毛干等因素的影響。

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The Role of Segmental Analysis of Clonazepam in Hair in Drug Facilitated Cases

CHEN Hang,XIANG Ping,SHEN Min
（Shanghai Key Laboratory of Forensic Medicine,Shanghai Forensic Service Platform,Institute of Forensic Science,Ministry of Justice,PRC,Shanghai 200063,China）

ObjectiveTo infer the frequency of dosage and medication history investigate of the victims in drug facilitated cases by the segmental analysis of clonazepam in hair.MethodsFreezing milling under liquid nitrogen environment combined with ultrasonic bath was used as sample pretreatment in this study,and liquid chromatography-tandem mass spectrometry was used for the segmental analysis of the hair samples collected from 6 victims in different cases.The concentrations of clonazepam and 7-aminoclonazepam were detected in each hair section.ResultsClonazepam and its metabolite 7-aminoclonazepam were detected in parts of hair sections from the 6 victims.The occurrence time of drug peak concentration was consistent with the intake timing provided by victims.ConclusionSegmental analysis of hair can provide the information of frequency of dosage and intake timing,which shows an unique evidential value in drug facilitated crimes.

forensic toxicology;clonazepam;hair;chemistry,analytic;drug facilitated crimes

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2017.03.008

1004-5619（2017）03-0252-06

2016-10-24）

（本文編輯：嚴(yán)慧）

“十三五”國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃資助項(xiàng)目（2016YFC080 0704）；上海市科委資助項(xiàng)目（15DZ1207500）；中央級科研院所基本科研業(yè)務(wù)資助項(xiàng)目（GY2017G-8）；上海市法醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目（17DZ2273200）；上海市司法鑒定專業(yè)技術(shù)服務(wù)平臺資助項(xiàng)目（16DZ2290900）

陳航（1988—），男，博士，助理研究員，主要從事法醫(yī)毒物化學(xué)研究；E-mail：chenh@ssfjd.cn

沈敏，女，研究員，博士研究生導(dǎo)師，主要從事法醫(yī)毒物化學(xué)研究；E-mail：shenm@ssfjd.cn