苦豆子內(nèi)生真菌對宿主培養(yǎng)物生長及喹諾里西啶類生物堿合成的影響

高 媛，孫牧笛，徐全智，呂 茜，張慶宸，顧沛雯

(1.寧夏大學農(nóng)學院， 寧夏 銀川 750021； 2.山東大學藥學院， 山東 濟南 250012; 3.淮安出入境檢驗檢疫局, 江蘇 淮安 223001)

苦豆子內(nèi)生真菌對宿主培養(yǎng)物生長及喹諾里西啶類生物堿合成的影響

高 媛1,3，孫牧笛1，徐全智1，呂 茜1，張慶宸2，顧沛雯1

(1.寧夏大學農(nóng)學院， 寧夏 銀川 750021； 2.山東大學藥學院， 山東 濟南 250012; 3.淮安出入境檢驗檢疫局, 江蘇 淮安 223001)

利用苦豆子健康植株中分離鑒定的8株內(nèi)生真菌菌株為真菌誘導子，分別制備滅活菌絲和菌液濃縮物，研究內(nèi)生真菌誘導子不同種類、濃度和誘導時間對苦豆子無菌苗和愈傷組織的生長以及喹諾里西啶生物堿含量的影響。結(jié)果表明：8株苦豆子內(nèi)生真菌誘導子中，菌液濃縮物的誘導效果要強于滅活菌絲。菌株HMGKDF1菌液濃縮物和滅活菌絲都能明顯促進愈傷組織的生長，凈生長率是對照的1.82和1.42倍；菌株NDZKDF13菌液濃縮物對愈傷組織生物堿的合成效果明顯，生物堿含量為0.5483 mg·g-1，是對照的23.8倍；在一定濃度范圍內(nèi)(0.01～1.0 mg·L-1)，苦豆子內(nèi)生真菌誘導子能夠促進宿主植物喹諾里西啶生物堿的合成。內(nèi)生真菌誘導子處理苦豆子無菌苗12 d時，喹諾里西啶生物堿含量最高，是對照的2.65倍。在苦豆子無菌苗或愈傷組織中添加一定量的苦豆子內(nèi)生真菌誘導子，對宿主的生長以及提高喹諾里西啶生物堿含量是一種有效的方法。

苦豆子；內(nèi)生真菌；真菌誘導子；植物培養(yǎng)物；喹諾里西啶生物堿

近年來，利用真菌誘導子刺激植物組織提高次生代謝物產(chǎn)量的研究一直是個熱點。真菌誘導子是來源于真菌的一種特定的化學信號[1]，具有誘導植物細胞中防衛(wèi)基因表達、誘發(fā)植物過敏反應和促進植物細胞中特定次生代謝產(chǎn)物的合成等多種功能[2]。大量研究結(jié)果表明，真菌誘導子能夠有效地促進植物和某些微生物次生代謝產(chǎn)物的合成和積累[3-4]，其作用效果與細胞的生長階段[5]、誘導子的濃度[6]和作用時間等多種因素有關[7]。為了有效提高植物次生代謝產(chǎn)物的含量，在栽培或組織培養(yǎng)過程中加入真菌誘導子被認為是一種有效的手段[8-9]。

植物內(nèi)生真菌是指在生活史的某段時期生活于植物組織內(nèi)部，對宿主沒有造成明顯病害癥狀的真菌。研究表明，內(nèi)生真菌與宿主植物在長期的生態(tài)系統(tǒng)演化過程中形成了互惠共生關系，內(nèi)生真菌可促進植物生長、增強抗病能力、提高抗逆性、促進宿主植物活性成分的積累等作用[10]。2009年，方芳等[11]通過添加內(nèi)生真菌誘導子，促進了茅蒼術懸浮細胞的生長及揮發(fā)油積累。2010年，張瑞芬等[12]發(fā)現(xiàn)在盾葉薯蕷無菌苗或細胞培養(yǎng)中添加一定量的內(nèi)生真菌滅活菌絲或菌液濃縮物對于提高薯蕷皂苷元含量和產(chǎn)量是一種有效的方法。2015年，王亞洲等[13]篩選得到一株產(chǎn)黃青霉代謝產(chǎn)物內(nèi)生真菌誘導子對納他霉素生物合成的促進效果最強，較原始產(chǎn)量提高231.6%。

苦豆子(SophoraalopecuroidesL.)豆科槐屬多年生草本植物，是我國西北荒漠化地區(qū)廣泛分布的一種重要沙生藥用植物，是我國傳統(tǒng)常用大宗中藥材品種之一，藥用歷史悠久，具有清熱解毒、祛風燥濕、止痛殺蟲、增強免疫等多種功效[14-15]。喹諾里西啶生物堿是其主要的活性成分，目前國內(nèi)外對于苦豆子品質(zhì)及其道地性的研究主要集中于化學成分、遺傳多樣性、藥理藥效分析以及外部環(huán)境(氣候因子、光照、土壤、水分)等方面，而忽視了苦豆子植物體內(nèi)環(huán)境的作用，特別是植物體內(nèi)生真菌的作用。2012年，顧沛雯等[16]從寧夏野生苦豆子中分離得到214株內(nèi)生真菌，篩選抑菌高活性菌株；2013年，余永濤等[17]從寧夏苦豆子中分離篩選得到產(chǎn)苦參堿的內(nèi)生真菌；周星辰等[18]初步篩選得到產(chǎn)喹諾里西啶生物堿的內(nèi)生真菌。但到目前為止，利用苦豆子內(nèi)生真菌為誘導子提高宿主植物中次生代謝物產(chǎn)量的研究還鮮見報道。本試驗以苦豆子內(nèi)生真菌滅活菌絲和菌液濃縮物為誘導子，研究其對宿主植物喹諾里西啶生物堿等活性成分積累的影響，從而有助于探索內(nèi)生真菌與苦豆子藥材道地性之間的相關性，為苦豆子的持續(xù)發(fā)展利用探索新的途徑。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

苦豆子無菌苗：挑選健康的苦豆子種子，經(jīng)嚴格消毒后，無菌水吸脹，置于鋪有無菌濾紙的培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)3～5 d進行催芽。再次消毒后，接種于MS基本培養(yǎng)基(即不添加任何激素)，用于無菌苗的繼代培養(yǎng)和相關的研究。培養(yǎng)條件為25℃，每天連續(xù)光照12 h，光強為1 000 lx，無菌苗每25天繼代1次。

苦豆子愈傷組織：以苦豆子子葉為外植體，經(jīng)嚴格消毒后，在培養(yǎng)基MS+NAA 0.5 mg·L-1+6-BA 1.0 mg·L-1+2,4-D 0.5 mg·L-1上誘導愈傷組織，在MS+NAA 1.0 mg·L-1+6-BA 4.0 mg·L-1+2,4-D 1.0 mg·L-1培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)。培養(yǎng)條件為25℃，每天連續(xù)光照12 h，光強為1 000 lx，愈傷組織每25天繼代培養(yǎng)1次。

苦豆子內(nèi)生真菌菌株：本實驗室2013—2014年從健康苦豆子植株中分離鑒定保存(表1)。內(nèi)生真菌的分離、保存和鑒定參照本研究小組的方法和相關文獻[19-21]。

氧化槐果堿(批號：13012907)、氧化苦參堿(批號：13021902)、槐定堿(批號：13032002)、槐果堿(批號：130827)、苦參堿(批號：1302194)對照品(純度>99%)均為上海融禾醫(yī)藥科技有限公司購置。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生真菌誘導子的制備 將苦豆子內(nèi)生真菌菌株接種到馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基中，25℃，150 r·min-1在搖床中暗培養(yǎng)，7 d后收獲，分別得到8株內(nèi)生真菌菌株的發(fā)酵液，發(fā)酵液進行高壓抽濾分離菌絲和菌液。收獲的菌絲冰凍干燥至恒重，研磨成粉，菌液減壓濃縮。稱量一定量的菌絲干粉或菌液濃縮物，加入到無菌苗或愈傷組織培養(yǎng)基中，終濃度為1.00 mg·L-1，121℃滅菌20 min，備用。

1.2.2 內(nèi)生真菌誘導子多糖含量測定 用蒽酮比色法測定制備的菌絲和菌液真菌誘導子中多糖的含量，單位為mg·L-1。

1.2.3 內(nèi)生真菌誘導子的篩選

(1) 內(nèi)生真菌滅活菌絲和菌液濃縮物的篩選

以苦豆子無菌苗和第2次繼代培養(yǎng)的愈傷組織為研究對象，添加濃度20%(v/v)的內(nèi)生真菌滅活菌絲和菌液濃縮物作為誘導子，使培養(yǎng)基中誘導子含量的終濃度為1.00 mg·L-1(多糖計)，培養(yǎng)條件為25℃，每天連續(xù)光照12 h，光強為1 000 lx，處理15 d后取樣。

表1 苦豆子內(nèi)生真菌菌株

(2) 誘導子添加濃度的篩選

以苦豆子無菌苗為研究對象，分別添加濃度5%，10%，15%，20%和25%(V/V)的內(nèi)生真菌NDZKDF13菌株菌液濃縮物作為真菌誘導子，使培養(yǎng)基中誘導子含量的終濃度依次為0.01 mg·L-1，0.02 mg·L-1，0.75 mg·L-1，1.00 mg·L-1和1.25 mg·L-1(多糖計)，25℃，每天連續(xù)光照12 h，光強為1 000 lx，處理15 d后取樣。

(3) 誘導時間的篩選

以苦豆子無菌苗為研究對象，添加20%(V/V)的內(nèi)生真菌NDZKDF13菌株的菌液濃縮物作為真菌誘導子，使培養(yǎng)基中誘導子含量的終濃度為1.00 mg·L-1(多糖計)，25℃，每天連續(xù)光照12 h，光強為1 000 lx，每3 d取樣1次，共取樣5次。

1.2.4 苦豆子培養(yǎng)物生長的測定 在組培瓶中加入50 mL MS基本培養(yǎng)基，每瓶接種1 g苦豆子無菌苗；在組培瓶中加入50 mL MS繼代培養(yǎng)基，每瓶接種1 g苦豆子愈傷組織，光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)15 d后收獲，用吸水紙吸干表面水分，分別稱量后計算平均值即得鮮重。

1.2.5 苦豆子無菌苗和愈傷組織中喹諾里西啶生物堿含量的測定

(1) 樣品與喹諾里西啶生物堿標品的制備

精確稱取1 g的苦豆子無菌苗和愈傷組織，加入4 mL無水乙醇于研缽中充分研磨，超聲震蕩處理30 min，置于4℃冰箱冷藏溶解24 h后，于10 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于新離心管并旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，溶解于1 mL甲醇(色譜級)，過0.45 μm濾膜后，即為樣品制備液，于4℃冰箱中保存。

分別精確稱取氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐定堿、苦參堿、槐果堿標品0.02 g，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋，制成含的2 mg·mL-1的混合標準溶液，備用。

(2) 色譜條件

色譜柱為：Ultimate ○RAQ-C18 (4.6×250 mm, 5μm)；流動相：0.01 mol·L-1磷酸緩沖液(K2HPO4=5.59 g·L-1，KH2PO4=0.41 g·L-1，pH為7.5)-甲醇(50∶50, V/V)；檢測波長：216 nm；柱溫：35℃；流速：1.0 mL·min-1。

(3) 線性關系的確定

利用氧化槐果堿、氧化苦參堿、槐定堿、苦參堿、槐果堿標準樣品作為對照(圖1)，并考察5種單堿標準品標準曲線的線性關系，R2值均在0.9999及以上(表2)。

1.氧化槐果堿；2.氧化苦參堿；3.槐定堿；4.槐果堿；5.苦參堿

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生真菌滅活菌絲和菌液濃縮物對苦豆子培養(yǎng)物的影響

2.1.1 內(nèi)生真菌滅活菌絲和菌液濃縮物對苦豆子愈傷組織的影響 由表3可知，8種菌液濃縮物中，HMGKDF1，NDZKDF13菌液濃縮物能促進愈傷組織的生長，凈生長率分別為182.48%和102.60%，是對照的1.82和1.02倍。其他6種菌液濃縮物對苦豆子愈傷組織的生長有一定的抑制作用，凈生長率均低于對照組。由表4可以看出，經(jīng)SAS方差分析(F=92.50，P<0.0001)，各處理組與對照組間差異極顯著，說明8種菌液濃縮物均能提高愈傷組織中喹諾里西啶生物堿的含量，其中NDZKDF13菌液濃縮物處理組與其他處理組間差異顯著，愈傷組織生物堿含量最高，為0.5483 mg·g-1，是對照的23.80倍。

表2 標準曲線

表3 內(nèi)生真菌滅活菌絲和菌液濃縮物對苦豆子愈傷組織生長的影響

此外，8種滅活菌絲中，HMGKDF1，NDZKDF13滅活菌絲對苦豆子愈傷組織的生長有一定的促進作用，凈生長率分別為141.93%和103.20%，是對照的1.41和1.03倍。其他6種滅活菌絲對愈傷組織的生長有抑制作用，凈生長率均低于對照組(表3)。經(jīng)SAS方差分析(F=25.63，P<0.0001)，各處理組與對照組間差異極顯著(表4)，說明8種滅活菌絲均能提高愈傷組織中喹諾里西啶生物堿的含量，其中NDZKDF13滅活菌絲處理組與其他處理組間差異顯著，苦豆子愈傷組織中生物堿含量增加較為明顯，為0.1931 mg·g-1，是對照的8.35倍；XKZKDF11，XKZKDF27，HMGKDF1和FJJKDF41菌液濃縮物處理組間差異不顯著。

2.1.2 內(nèi)生真菌菌液濃縮物對苦豆子無菌苗的影響 由表5可知，8種菌液濃縮物中，NDZKDF13菌液濃縮物能促進無菌苗的生長，凈生長率為102.82%，是對照的1.03倍，其他7種菌液濃縮物對無菌苗的生長有一定的抑制作用，凈生長率均低于對照。經(jīng)SAS方差分析(F=156.20，P<0.0001)，各處理組與對照組間差異極顯著(表6)，說明8種菌液濃縮物均能不同程度地提高苦豆子無菌苗中喹諾里西啶生物堿的含量，其中XKYKDF40菌液濃縮物處理組與其他處理組間差異顯著，苦豆子無菌苗中生物堿含量增加較為明顯，為2.8283 mg·g-1，是對照的2.01倍；NDZKDF13，XKZKDF11和XKZKDF27菌液濃縮物處理組間差異不顯著，喹諾里西啶生物堿含量分別為2.4928、2.4814和2.4542 mg·g-1，分別是對照的1.77、1.76和1.74倍。

表4 內(nèi)生真菌滅活菌絲和菌液濃縮物對苦豆子愈傷組織中喹諾里西啶生物堿合成的影響

注：大寫字母代表各菌液濃縮物處理組間的差異水平，同列中不同的大寫字母代表差異顯著(P<0.0001);小寫字母代表各滅活菌絲處理組間的差異水平，同列中不同的小寫字母代表差異顯著(P<0.0001)。

Note：Capital letter mean different level among concentrated filtrate groups, with the different letter mean significantly different in same column(P<0.0001); Lowercase letter mean different level among autoclaved mycelia groups, with the different letter mean significantly different in same column(P<0.0001).

表5 內(nèi)生真菌菌液濃縮物對苦豆子無菌苗生長的影響

2.2 添加不同濃度內(nèi)生真菌菌液濃縮物對苦豆子無菌苗的影響

如圖2可知，不同濃度真菌誘導子對苦豆子無菌苗生物堿含量有一定的影響，低濃度的真菌誘導子有利于苦豆子生物堿的合成，在一定范圍內(nèi)(誘導子含糖量0.01～1.00 mg·L-1)，苦豆子無菌苗中喹諾里西啶生物堿的含量與真菌誘導子的濃度呈正相關。當真菌誘導子的濃度超過1.00 mg·L-1時，抑制苦豆子無菌苗的生長，生物堿含量下降，可見誘導子濃度對苦豆子無菌苗喹諾里西啶生物堿合成的影響很大。

2.3 不同誘導時間對苦豆子無菌苗的影響

如圖3可知，不同的誘導處理時間對苦豆子無菌苗中喹諾里西啶生物堿合成的影響不同，其促進作用不同。在誘導處理9～12 d時，喹諾里西啶生物堿含量呈直線上升，處理12 d生物堿含量最高，為3.0721 mg·g-1，是對照的2.65倍。

表6 內(nèi)生真菌菌液濃縮物對苦豆子無菌苗中喹諾里西啶生物堿合成的影響

注：*大寫字母代表各組間的差異水平，同列中相同的大寫字母代表差異不顯著(P<0.0001)

Note：Capital letter means different level of groups, with the same letter are not significantly different in same column(P<0.0001)

圖2 不同濃度內(nèi)生真菌菌液濃縮物對苦豆子無菌苗喹諾里西啶生物堿類生物堿含量的影響

圖3 不同誘導時間對苦豆子無菌苗喹諾里西啶生物堿含量的影響

3 結(jié)論與討論

Zhao等[22]認為，在長期的協(xié)同進化過程中，內(nèi)生真菌能夠產(chǎn)生與宿主植物相同或相似的活性代謝產(chǎn)物。長期以來，真菌誘導子廣泛應用于植物細胞培養(yǎng)中，被認為是提高次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量最有效的途徑之一[23]。真菌誘導子可以對植物無菌苗、愈傷組織、毛狀根、懸浮細胞培養(yǎng)物生長產(chǎn)生明顯的影響，可以誘導培養(yǎng)物產(chǎn)生和積累次生代謝產(chǎn)物，其誘導效果與誘導子的種類、濃度、添加時間、處理時間、培養(yǎng)條件等因素有關[24]。到目前為止，已有大量關于經(jīng)高溫滅菌處理的真菌菌絲、菌液或孢子促進植物培養(yǎng)物次生代謝產(chǎn)物生產(chǎn)的例子。趙建娜等[25]發(fā)現(xiàn)野生春蘭和華石斛根部分離的內(nèi)生真菌菌絲提取物可以促進象牙白種子萌發(fā)形成的原球莖的生長和分化。袁亞菲等[26]人的研究表明，內(nèi)生青霉菌(Penicilliumsp.)的菌液和菌絲能較好的促進黃花蒿組培苗的生長，促進青蒿素的合成。在茅蒼術細胞懸浮培養(yǎng)體系中添加滅活菌絲和菌液混合物，可以提高蒼術素的產(chǎn)量[24]。

本研究發(fā)現(xiàn)8株內(nèi)生真菌誘導子均能提高宿主苦豆子喹諾里西啶生物堿的含量，與對照組相比差異極顯著。部分內(nèi)生真菌如菌株NDZKDF13(Alternariatenuissima)和菌株XKYKDF40(Exophialasp.)能有效地提高宿主植物培養(yǎng)物(愈傷組織和無菌苗)的生長和喹諾里西啶生物堿的含量。由于無菌苗中的生物堿含量明顯高于愈傷組織細胞，內(nèi)生真菌對無菌苗中生物堿的提高也更明顯。菌株XKYKDF40中的菌液濃縮物的生理效應要明顯強于滅活菌絲，推測活性成分主要存在于菌液濃縮物中，具體是哪些成分起作用值得深入研究。研究表明，大部分內(nèi)生真菌的滅活菌絲和菌液濃縮物對苦豆子無菌苗和愈傷組織細胞的生長有抑制作用，說明內(nèi)生真菌中存在一定量的抑制活性成分(如真菌毒素等)[27]。添加不同濃度內(nèi)生真菌菌液濃縮物作為誘導子，對苦豆子無菌苗喹諾里西啶生物堿含量有一定的影響，低濃度的真菌誘導子有利于苦豆子生物堿的合成，在0.01～1.0 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，苦豆子無菌苗生物堿的含量與真菌誘導子的添加量呈正相關，當濃度為1.0 mg·L-1時，誘導效果最好。此外，誘導子處理時間對苦豆子無菌苗的影響較大，處理9 d起喹諾里西啶生物堿含量迅速增加，處理12 d達到最大值，這與文濤等[28]的研究結(jié)果相似。

近年來，人們陸續(xù)從黑麥草、瘋草、苦豆子等禾本科、豆科植物中分離到能夠產(chǎn)生宿主植物生物堿的內(nèi)生真菌，確定該類內(nèi)生真菌與宿主植物生物堿的合成密切相關[29-30]。類似的結(jié)果在其它的培養(yǎng)物中也有發(fā)現(xiàn)，在長春花(Catharanthusroseus)細胞培養(yǎng)中選取的3種真菌，綠色木霉(Trichodermavirride)誘導子最有利于阿馬里新的積累[6]。在長春花細胞培養(yǎng)中，畸雌腐霉(Pythiumirregulare)對阿馬里新的合成最有利，而鐮刀菌(Fusariumsolani)對長春質(zhì)堿的誘導效果最好[8]。不同的真菌誘導子對不同的培養(yǎng)物具有不同的效果。迄今為止，還沒有找到普遍適用的某一類或某一種真菌，這使得研究者必須尋找針對某種培養(yǎng)物具有最佳誘導效果的真菌誘導子，因此，真菌種類的選擇至關重要[23]。

總之，在苦豆子無菌苗或細胞培養(yǎng)物中添加一定量的內(nèi)生真菌滅活菌絲或菌液濃縮物，對于提高宿主喹諾里西啶生物堿的含量是一種有效的方法。研究也暗示了通過內(nèi)生真菌調(diào)控宿主植物次生代謝產(chǎn)物的可能性，為進一步研究內(nèi)生真菌促進宿主植物生長及次生代謝的調(diào)控機制奠定了基礎。

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EffectofSophoraalopecuroidesL.endophyticfungionthegrowthofthehostplantcultureandsynthesisofquinolizidinealkaloids

GAO Yuan1,3, SUN Mu-di1, XU Quan-zhi1, LV Xi1, ZHANG Qing-chen2, Gu Pei-wen1

(1.AgriculturalCollege,NingxiaUniversity,Yinchuan,Ningxia750021,China; 2.SchoolofPharmaceuticalSciences,ShandongUniversity,Jinan,Shandong250012,China; 3.Huai'anEntryandExitInspectionandQuarantineBureau,Huai'an,Jiangsu223001,China)

Eight strains of endophytic fungi were isolated and identified as the fungal elicitors from the healthy plant ofS.alopecuroidesL. and then their autoclaved mycelia and concentrated filtrates were made respectively to study the effect of different types, concentration and eliciting time of endophytic fungal elicitors on the growth of aseptic seedling and callus tissue ofS.alopecuroidesL., and the content of quinolizidine alkaloids. Among the 8 strains of endophytic fungal elicitors, the elicitation effect of the concentrated filtrate was stronger than those of the autoclaved mycelia. The autoclaved mycelia and concentrated filtrates of HMGKDF1promoted the growth of callus, with the rate of growth being 1.82 and 1.42 times higher than that in CK, respectively. The concentrated filtrate of NDZKDF13has a strong effect on the accumulation of quinolizidine alkaloids ofS.alopecuroidesL. The content of total alkaloids was 0.5483 mg·g-1, 23.8 times higher than that in CK. Within a certain range (0.01～1.0 mg·L-1), endophytic fungal elicitors promoted the synthetic accumulation of quinolizidine alkaloids of the host plant. After 12 days of induction by endophytic fungal elicitors, the content of quinolizidine alkaloids reached the highest amount, 2.65 times higher than that in CK. Addition of the autoclaved mycelia or concentrated filtrates from the endophytic fungi into aseptic seedlings and callus tissues ofS.alopecuroidesL. could be an effective way to increase the content of quinolizidine alkaloids and to improve the growth of the plant.

SophoraalopecuroidesL.; endophytic fungal; fungal elicitor; plant culture; quinolizidine alkaloids

1000-7601(2017)03-0212-07doi:10.7606/j.issn.1000-7601.2017.03.33

2016-04-12

：2017-03-15

：國家自然基金項目“苦豆子內(nèi)生真菌促進宿主喹諾里西啶生物堿合成積累的機制研究”(31260452)

高 媛(1988—)，女，山東日照市人，碩士，主要從事生物防治與菌物資源利用。 E-mail：elfish521@163.com。

顧沛雯(1969—)，女，教授，主要從事生物防治與菌物資源利用研究。 E-mail：gupeiwen2013@126.com。

Q949.32; S567.23

： A