外源一氧化氮對Na2CO3脅迫下南瓜幼苗碳氮代謝的影響

吳旭紅，羅貴強，馮晶

(1.齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.齊齊哈爾市衛(wèi)生監(jiān)督所， 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

外源一氧化氮對Na2CO3脅迫下南瓜幼苗碳氮代謝的影響

(1.齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006； 2.齊齊哈爾市衛(wèi)生監(jiān)督所， 黑龍江 齊齊哈爾 161005)

為探討外源NO對Na2CO3脅迫下南瓜幼苗碳氮代謝過程的影響，以銀輝2號南瓜品種為材料，采用盆栽法研究了80 μmol·L-1SNP對60 mmol·L-1Na2CO3脅迫下南瓜幼苗生長、葉綠體色素含量、碳氮代謝相關酶活性及代謝產(chǎn)物量的變化規(guī)律。結(jié)果表明：Na2CO3脅迫12 d，南瓜幼苗地上和地下部分干重、相對生長量、根冠比、Rubisco羧化活力、光合色素含量和氮代謝相關酶活性均不同程度下降；Rubisco氧化活力、游離氨基酸總量和蛋白水解酶活性顯著上升。80 μmol·L-1SNP外源處理能明顯緩解Na2CO3脅迫對南瓜幼苗生長及光合作用的抑制，增加了干物質(zhì)的積累和光合色素的含量。與Na2CO3脅迫處理相比，干物質(zhì)積累量、相對生長量、葉綠素和類胡蘿卜素(caro)含量、硝酸還原酶(NR)、谷氨酰胺合成酶(GS)、Rubisco羧化酶、淀粉酶(AMY)活性和可溶性蛋白含量分別提高了26.72%、30.45%、17.69%、46.15%、46.43%、30.70%、38.75%、70.0%、65.37%；Rubisco加氧酶、蛋白水解酶活性和游離氨基酸總量分別降低了18.29%、31.76%、28.57%。外源NO通過促進淀粉酶和Rubisco羧化活性的提高和氧化活性的下降，維持了可溶性總糖含量的穩(wěn)定；通過增強NR、GS和谷氨酸合酶(GOGAT)活性、抑制蛋白水解酶和谷氨酸脫氫酶(GDH)活性，降低葉片中游離氨基酸含量，增加了蛋白質(zhì)的積累。本研究結(jié)論：堿性鹽脅迫下，80 μmol·L-1的SNP通過增強南瓜幼苗的光合碳代謝，促進了酮酸轉(zhuǎn)化為氨基酸。通過提高氮代謝相關酶NR、GS、GOGAT活性，促使碳流由光合碳代謝轉(zhuǎn)向氮代謝，維持了鹽害下南瓜幼苗碳氮代謝的正常進行，增強了南瓜幼苗抵御Na2CO3脅迫的能力。

一氧化氮；Na2CO3脅迫；碳氮代謝；南瓜；代謝產(chǎn)物

鹽堿危害是制約農(nóng)作物生長和產(chǎn)量的重要非生物脅迫因子，全球受鹽漬化土壤面積可達8億hm2,其中50%以上是由Na2CO3等堿性鹽構成的蘇打鹽堿土。我國的鹽堿荒地和鹽堿問題耕地已超過3 000萬hm2,在我國的東北、西北、華北均有分布，尤其是東北的松嫩平原，是世界三大蘇打鹽堿地之一[1]。堿性鹽除可造成滲透調(diào)節(jié)失衡、光合機構受損、離子的吸收及區(qū)隔化等代謝紊亂外，高pH值對非鹽生植物在種子萌發(fā)和幼苗生長階段是更加高危的生態(tài)逆境，因此其破壞力更強。幼苗階段是植物感受逆境信號最敏感的時期，由于堿脅迫造成碳素和氮素的同化和吸收障礙，養(yǎng)分的生理缺乏和代謝受阻導致生長發(fā)育受到抑制[1-2]；此階段也是適應環(huán)境變化進行生理調(diào)節(jié)的活躍期。通過促控手段增加光合產(chǎn)物的積累，為氮代謝提供充足的碳架和還原力是改善和減輕堿脅迫危害的重要途徑。一氧化氮(nitric oxide，NO)作為一種分子信號，參與了多種植物對鹽堿脅迫的生理適應性和耐受性的調(diào)節(jié)過程。如：NO通過提高根系和葉片的抗氧化酶活性，增強了黃瓜幼苗對Ca(NO3)2脅迫的耐性[2]；緩解了NaCl脅迫對番茄幼苗生長的抑制[3]和小麥(Yangmai 158)根系發(fā)育的氧化損傷[4]；促進了鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)過程中淀粉和可溶性蛋白的水解，加速了萌發(fā)進程[5]；上調(diào)了水稻(jiafuzhan)根葉保護酶活力，增強了其對鹽害逆境的適應力[6]；參與了堿脅迫下光合功能的調(diào)控，增強了黑麥草的耐堿性[7]。而NO對堿脅迫下南瓜幼苗碳氮代謝的影響未見報道。NO對逆境下禾谷類、牧草及部分蔬菜如番茄、黃瓜、辣椒的生理生化響應的研究較多，南瓜是集蔬菜、油料、飼料兼用作物，種植區(qū)域廣泛，尤其在東北和西北地區(qū)，苗期與耕作層土壤返鹽期疊加，加重了對南瓜幼苗的傷害。本試驗以南瓜幼苗為實驗材料，以外源NO供體硝普鈉為調(diào)控手段，研究其對Na2CO3脅迫下南瓜幼苗早期碳氮代謝及相關酶活性的影響，探討外源NO在南瓜幼苗碳素代謝和氮素代謝中的作用及對碳氮代謝相互關系的調(diào)節(jié)機制，分析和探索提高南瓜耐堿性的生理因素和代謝機制，為在鹽堿地區(qū)南瓜的抗鹽栽培措施提供技術支撐和理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

供試南瓜品種為“銀輝2號”(Yinhui 2)，由齊齊哈爾市種子經(jīng)銷處提供。NO供體為硝普鈉(Na2Fe(CN)5)(Sodium nitroprusside，SNP)，購自Sigma公司，純度為98.5%。先配制成100 mmol·L-1母液，4℃保存，用時按所需濃度稀釋。

1.2 實驗設計

1.2．1 Na2CO3和SNP濃度的篩選 精選飽滿、大小均勻的南瓜種子，先經(jīng)0.1%的HgCl2消毒10 min，室溫下蒸餾水浸泡8 h，于培養(yǎng)皿中25℃恒溫箱內(nèi)催芽。將發(fā)芽一致的種子選出，繼續(xù)用蒸餾水培養(yǎng)2 d后，改用濃度分別為30、60、90、120、150 mmol·L-1的Na2CO3培養(yǎng)，3 d后剔除影響輕微和嚴重鹽害的處理，在60 mmol·L-1的Na2CO3處理中，分別添加0、40、60、80、100、120、140 μmol·L-1的SNP，培養(yǎng)4d后選出SNP濃度為80 μmol·L-1。

1.2.2 試驗處理 將催芽后的種子播于細砂經(jīng)清水浸泡1 h，高溫滅菌(130℃，3 h)定量稱重的花盆中(12粒/盆)，于實驗室室溫下(21℃±2℃)自然光照培養(yǎng)，出苗后每隔2 d澆灌Hongland營養(yǎng)液500 ml。待幼苗至二葉一心時，每盆保留生長整齊一致的幼苗8株，共30盆。

試驗共設4個處理：分別為處理Ⅰ(對照)：Hongland營養(yǎng)液(CK)；處理Ⅱ：Hongland營養(yǎng)液+80 μmol·L-1的SNP；處理Ⅲ：Hongland營養(yǎng)液+60 mmol·L-1Na2CO3；處理Ⅳ：Hongland營養(yǎng)液+60 mmol·L-1Na2CO3+80 μmol·L-1的SNP。于每天8∶30和16∶30用相應的處理液定量澆灌2次，每次100 ml/盆。每處理60株苗，每次取樣4株，3次重復。于處理的3、6、9、12 d分別進行Rubisco、AMY、蛋白水解酶活性和可溶性糖、可溶性蛋白、游離氨基酸總量的測定。處理結(jié)束后，做相對生長量、干物質(zhì)積累、光合色素含量及氮代謝關鍵酶活性的測定。

1.3 測定項目和方法

1.3.1 生長指標的測定 于處理結(jié)束后取出幼苗，將地上、地下部分分開，迅速用蒸餾水洗凈并吸干表面水分，稱取鮮重后，105℃烘箱殺青15 min后轉(zhuǎn)至75℃烘干至衡重，稱干重。相對生長量、地上部鮮重和干重及根冠比以4株幼苗的平均值表示，單位為g·株-1。

1.3.2 碳代謝相關酶活性及指標的測定 1，5-二磷酸核酮糖羧化酶/加氧酶(Rubisco)活力的測定：取南瓜葉片2.0 g，迅速加入2.0 ml提取液研磨成勻漿。將勻漿過濾，濾液離心后取上清進行Rubisco活力測定[8]。淀粉酶(amylase，AMY)活性測定采用3,5二硝基水楊酸比色法[9]?？扇苄蕴抢幂焱壬y定[8]：取0.1 g南瓜葉片剪碎，用乙醇丙酮混合液暗提取24 h，分別在663、645、470 nm處測光吸收值，葉綠素、類胡蘿卜素按李合生的公式計算[9]。

1.3.3 氮代謝及相關酶活性及指標的測定 硝酸還原酶(nitrate reductase，NR)活性采用活體法[8]。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，GS)活性測定參照湯章誠的方法[10]。谷氨酸合成酶(glumtamate synthase，GOGAT)活性參照趙全志等的方法[11]。谷氨酸脫氫酶(glutamic dehydrogenase，GDH)參照Majerowicz等的方法[12]?？扇苄缘鞍缀陀坞x氨基酸總量采用李合生的考馬斯亮藍和水合茚三酮法測定[9]。蛋白水解酶的活性采用張志剛等的方法[13]。

1.4 統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)用Microsoft Excel 2003進行統(tǒng)計，所有數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標準差表示，用Spss 17.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計分析，Duncan新復極差法進行多重比較(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 Na2CO3脅迫下外源NO對南瓜幼苗生長的影響

表1可見，在Na2CO3脅迫下，南瓜幼苗地上部分和根系鮮、干重均明顯下降，分別比正常生長條件(CK)鮮重下降了28.69%和26.11%，干重降幅達32.89%和41.17%；地下部分相對生長量降幅最大；根冠比降至最低；與正常生長條件均達差異顯著水平,說明堿性鹽Na2CO3不僅顯著抑制了南瓜幼苗對水分和養(yǎng)分的吸收，而且對干物質(zhì)積累的影響根系比地上部分更加嚴重。SNP單獨處理，對幼苗地上、地下部鮮重無明顯影響，但顯著促進了植株地上部分和根系干物質(zhì)的積累(P<0.05)。SNP復合處理，使堿脅迫導致的生長抑制明顯緩解，南瓜幼苗地上及根系鮮、干重分別比Na2CO3脅迫下提高了19.18%、15.52%和25.49%、35.71%(P<0.05)，根系相對生長量增幅為25.48%、36.01%，根冠比加大,表明外源一氧化氮供體SNP可以減輕Na2CO3脅迫對南瓜幼苗生長的抑制作用，使受害幼苗的水分和養(yǎng)分狀況得到改善，且在處理時段內(nèi)對根系生長的促進作用更加顯著。

表1 外源NO對Na2CO3脅迫下南瓜幼苗生長的影響(平均數(shù)±SE)

注：同一列數(shù)據(jù)后小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。下同

Note: Values with different lowercases letters of the same column indicate significant differences (P<0.05).The same as below.

2.2 外源NO對Na2CO3脅迫下南瓜幼苗葉片Rubisco和AMY活性及可溶性糖含量的影響

Na2CO3脅迫處理使南瓜葉片Rubisco羧化活性明顯受抑，并呈現(xiàn)出隨處理時間延長而降低(見圖1a)。與正常生長條件相比較，在脅迫6 d和12 d時，酶活性分別喪失了38.95%、59.58%(P<0.05)，但在脅迫處理后期相對降幅收窄(7.48%)。單純SNP處理，在處理初期(3 d)對酶活性并未形成明顯影響，當達6 d時酶活顯著升高，從酶活力隨時間的變化上比較，6～12 d各處理與對照之間差異顯著(P<0.05)。Na2CO3+SNP處理3～6 d，Rubisco羧化活性分別較Na2CO3處理上調(diào)10.13%、34.90%，雖然仍表現(xiàn)為隨時間延長酶活下降，但9～12 d時增幅已達49.66%、38.75%，說明SNP能顯著延緩堿脅迫導致的Rubisco羧化活性的喪失，一定程度上修復了Na2CO3對Rubisco羧化活力的損傷。對比而言，堿性鹽處理顯著激活了Rubisco的氧化活性，處理達9～12 d時，樣品的氧化酶活性分別比對照提高了59.30%、34.43%。而復合處理則僅為Na2CO3處理組的74.82%、81.72%(P<0.05),結(jié)果顯示，SNP明顯抑制了Rubisco氧化活性的上升。

淀粉酶可將葉片中的淀粉水解為小分子的糖，為氮素代謝和器官發(fā)育提供碳架和能量。從圖2a可見，堿脅迫初始，淀粉酶活力激增了29.41%，此后持續(xù)下降，9～12 d時僅為對照的40.00%、38.46%；Na2CO3+SNP處理明顯抑制了脅迫導致的淀粉酶活力的下降，6 d時酶活顯著高于對照和SNP單獨處理，達Na2CO3脅迫1.92倍(P<0.05)。處理后期雖然酶活力已顯著低于對照，但與堿脅迫仍差異顯著?？扇苄蕴亲邉輬D2b在正常生長條件和SNP單獨處理條件下均表現(xiàn)為隨生育進程上升—平穩(wěn)—上升的相同趨勢，SNP各處理都顯著高于對照。堿脅迫下南瓜葉片可溶性糖含量先升后降，處理6 d時達到峰值，12 d后降至對照的73.11%?？扇苄蕴鞘侵参矬w內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)劑，脅迫初期參與了南瓜幼苗對鹽害的應激調(diào)節(jié)。復合SNP處理3～6 d時，葉片糖含量較脅迫處理下降了16.18%、13.83%；9～12 d時，葉片糖含量較脅迫處理增加了25.43%、44.04%(P<0.05)。

圖1 外源NO對Na2CO3脅迫下南瓜葉片中Rubisco 羧化酶(a)和氧化酶(b)酶活性的影響

圖2 外源NO對Na2CO3脅迫下淀粉酶活性(a)和可溶性糖含量(b)的影響

比較淀粉酶活力和可溶性糖含量變化可發(fā)現(xiàn)，兩者之間并無精確的對應關系，即在葉片中可溶性糖的積累并非完全來自于淀粉的水解，可能的途徑源于Rubisco羧化活性的提高，光合碳代謝的高效進行所致。SNP在鹽害逆境下上調(diào)了淀粉酶活力，下調(diào)了總糖在葉片中的積累量，促進了碳流由光合碳代謝向氮代謝的轉(zhuǎn)變；抑制淀粉酶活力的下降，維持可溶性總糖含量的穩(wěn)定效應既為氮同化提供了主要由光合碳代謝中間產(chǎn)物(MAL-OAA)穿梭產(chǎn)生的還原力NADH和電子，同時有機氮化物對同化力和α-KG的消耗不斷減少了碳同化產(chǎn)物的量，協(xié)調(diào)了碳氮代謝之間的關系，維持了南瓜幼苗的碳氮平衡。

2.3 外源NO對Na2CO3脅迫下南瓜幼苗葉片光合色素含量的影響

葉綠素是光合作用中最有效和最重要的色素，其含量在一定水平上影響南瓜苗期同化外源物質(zhì)和進行光合積累的能力，并最終影響南瓜的產(chǎn)量。Na2CO3脅迫下，Chl a、Chl b及Caro含量分別比對照降低了22.34%、19.75%、27.78%，說明滲透脅迫、離子毒害及高pH造成了南瓜葉片的光合機構受損，電子傳遞和光合磷酸化的偶聯(lián)機制遭到破壞。非堿脅迫下外加SNP，一定程度上提高了葉片的葉綠素總量，但與正常生長條件比差異不顯著，但顯著促進了Caro積累并大幅提高了Chla/b(P<0.05)。復合SNP處理，Chl a、Chl b含量分別提高了18.87%、13.85%(P<0.05)，Chla/b顯著上升。說明膜結(jié)構得以修復和穩(wěn)定。Caro含量比Na2CO3脅迫增加了46.15%，Caro既是光合色素，又是內(nèi)源性的非酶系統(tǒng)ROS清除劑，可以發(fā)揮淬滅ROS的作用。

2.4 外源NO對Na2CO3脅迫下南瓜幼苗葉片氮代謝相關酶活性的影響

綠色植物氮代謝中，無機氮(NO3-、NH4+)必須轉(zhuǎn)變?yōu)橛袡C氮(氨基酸、酰胺等)，才能參與蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的合成。硝酸還原酶(NADH/NR，EC 1.6.6.1)是存在于細胞質(zhì)中的黃素蛋白酶，能將NO3-還原為NO2-，再由葉綠體中的NiR將NO2-還原為NH4+。硝態(tài)氮高速同化時，需大量碳架，因此葉片內(nèi)碳流會由合成糖類流向合成氨基酸[14]，因此NR不僅直接調(diào)節(jié)硝酸鹽的還原，是氮代謝的限速酶，酶活性高低在一定程度上體現(xiàn)蛋白質(zhì)的代謝強度,而且與光合碳代謝緊密相連。Na2CO3脅迫對葉片NR活性產(chǎn)生了明顯的抑制作用，處理12 d時，酶活性僅為對照的59.27%，復合SNP處理NR活性上調(diào)了46.43%，但仍顯著低于對照。由表3可以看出，SNP對NR活性具有明顯的誘導作用，外源添加SNP使NR被抑制的活力重新激活，比正常生長條件提高了16.61%(P<0.05)。

表2 外源NO對Na2CO3脅迫下南瓜葉片光合色素含量的影響(平均數(shù)±SE)

表3 外源NO對Na2CO3脅迫下南瓜幼苗葉片氮代謝酶活性的影響(平均數(shù)±SE)

由NR和NiR還原生成的銨要進一步通過GS-GOGAT循環(huán)才能參入有機氮代謝，形成氨基酸進而合成蛋白質(zhì)及轉(zhuǎn)變成其它次生代謝產(chǎn)物，因此，GS是氮代謝的樞紐。因GS對氨的親和力更強，故GS-GOGAT循環(huán)是植物體內(nèi)氨同化更為普遍和重要的方式[14]。正常生長條件下SNP處理葉片的GS活性并未受到明顯影響，經(jīng)60 mmol·L-1Na2CO3處理后，與對照比較，脅迫使葉片的GS活性下降了37.02%(P<0.05)。添加80 μmol·L-1的SNP，明顯逆轉(zhuǎn)了GS下降的趨勢，使GS酶活性提高了30.70%。GS-GOGAT的運轉(zhuǎn)使銨處于較低水平，既避免了由銨的積累引起的光合磷酸化解偶聯(lián)，又避免了對NR的產(chǎn)物抑制。GOGAT是與GS偶聯(lián)的氨同化途徑，催化Gln和α-KG生成2分子的Glu。60 mmol·L-1Na2CO3脅迫12 d，葉片GOGAT活力僅為對照的58.08%，抑制作用顯著(P<0.05)。SNP對正常生長條件的幼苗GOGAT活力亦呈現(xiàn)促進作用，在處理周期后期酶活性提高幅度達12.40%。而Na2CO3+SNP組GOGAT活力比堿害下提高了24.02%，說明SNP能有效緩解GOGAT由堿害造成的活力下降，促進碳流的快速運轉(zhuǎn)。

植物組織中有氨積累時，GDH催化銨的共同受體α-KG的還原胺化，當機體碳架不足時，也能使Glu脫氫脫氨形成α-KG，故GDH被認為是植物體內(nèi)氨同化為有機氮化物的初始環(huán)節(jié)。Na2CO3處理，GDH活性不降反升，分別為對照和SNP單獨處理的1.75倍、2.08倍，復合處理使GDH活性得到顯著抑制，比堿脅迫下調(diào)了26.24%(P<0.05)，但仍顯著高于對照。在處理時段內(nèi)無論是正常生長狀態(tài)添加SNP，還是堿脅迫時復合處理，均使GDH活性受到不同程度的抑制。推測一方面由于堿脅迫逆境造成苗期光合碳代謝受阻，CO2同化的速率直接影響到氨基酸合成所需碳架和能量的供應，使Glu大量氧化脫羧，釋放同化力NADH和α-KG，轉(zhuǎn)運至葉綠體供應氨基酸的生物合成；另一方面由于GDH與氨的親和力很低，堿害逆境下GS、GOGAT等銨態(tài)氮同化酶活力下降，NH4+的積累激活了GDH活力的提升，發(fā)揮了解除氨毒的重要作用。

南瓜葉片可溶性蛋白和游離氨基酸隨幼苗生長而積累。從圖3a可以看出，堿處理初期使蛋白含量增加了14.65%，6 d時達到峰值，此時已高于對照37.73%，9～12 d則呈顯著下降的態(tài)勢，分別僅為對照的83.22%、73.43%(P<0.05)。推測堿脅迫誘導了逆境蛋白的合成使之含量升高，隨脅迫強度加大提升了蛋白水解酶的活性，引發(fā)了蛋白質(zhì)的大量降解。SNP無論是單獨還是復合處理，均促進了蛋白質(zhì)的積累，尤其是復合處理中后期，其含量已達堿脅迫的1.60倍以上。堿脅迫初期(3 d)，蛋白水解酶活性僅高于對照8.42%(P>0.05)，此后活性大幅上升，處理結(jié)束時劑量累加效應更加明顯，酶活性達到對照的1.85倍(圖3c)；游離氨基酸總量由初始處理對照的1.77倍升至峰值的2.08倍。單純SNP對蛋白水解酶和游離氨基酸總量未形成趨勢性影響。復合SNP下調(diào)了蛋白酶活性，調(diào)節(jié)效應從6～12 d比堿害下分別降低了13.22%、21.80%、31.76%；由于復合處理抑制了蛋白水解酶活性的升高，使游離氨基酸的積累量顯著下降，尤其是處理的中后期(9～12 d)，游離氨基酸總量分別僅為堿處理的75.81%、71.43%(P<0.05)(圖3b)。

圖3 外源NO對Na2CO3脅迫下南瓜幼苗葉片可溶性蛋白(a)、游離氨基酸總量(b)及蛋白水解酶活性(c)的影響

3 討 論

生長抑制是非鹽生植物對鹽堿脅迫的直觀表現(xiàn)，一定程度可體現(xiàn)植物的受害程度。Na+鹽脅迫時過量的Na+可取代細胞膜上的Ca2+，膜結(jié)構和功能受損，Na+/Ca2+升高不僅使有機溶質(zhì)外滲，還會造成對水分和礦質(zhì)元素的吸收和代謝障礙[15]。張春霞等[1]發(fā)現(xiàn)，在Na2CO3脅迫下，甜高粱種子萌發(fā)過程明顯受到抑制，發(fā)芽率、發(fā)芽勢及活力指數(shù)大幅下降。趙利等[16]研究了NaCl、Na2SO4、Na2CO3三種Na+鹽對南瓜幼苗的生理效應，通過對干物質(zhì)積累、葉綠素含量、根系活力及膜脂過氧化程度的比較，得出了Na2CO3對南瓜危害最大、NaCl次之、Na2SO4最小的結(jié)論。

一氧化氮(NO)是普遍存在于動植物體內(nèi)的胞內(nèi)和胞間信使分子，在植物的種子萌發(fā)、生長發(fā)育、逆境的脅迫應答及細胞的程序性死亡等過程中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[17]。有研究發(fā)現(xiàn)，外源NO可通過激活抗氧化系統(tǒng)和增強質(zhì)膜H+-ATPase活性，改善Na+、K+平衡，提高裸燕麥的耐堿性[18]；還通過提高光合色素含量和凈光合速率，緩解NaCl脅迫對黃瓜幼苗造成的光合碳代謝的抑制[19]；林燕等[20]的研究證明，外源NO還能緩解NaHCO3脅迫對黃瓜幼苗氮代謝的抑制，提高其耐鹽性。對苜蓿的研究也表明，外源NO能明顯緩解鹽脅迫對苜蓿幼苗生長和光合作用的抑制，通過對參與氮代謝關鍵酶活性的調(diào)控，促進了苜蓿幼苗的氮代謝[21]。植物可通過一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)、硝酸還原酶或亞硝酸還原酶(nitrate/nitrite，NR/NiR)等酶促和非酶途徑產(chǎn)生NO[22]，其對植物碳氮代謝的影響會因植物種類、逆境種類、脅迫強度、處理劑量而不同。本研究表明，60 mmol·L-1Na2CO3顯著抑制了南瓜幼苗的生長。以0.5 mmol·L-1SNP可產(chǎn)生2.0 μmol·L-1NO計[23]，80 μmol·L-1的SNP(約0.32 μmol·L-1NO)，明顯促進了南瓜幼苗地上尤其是地下部干物質(zhì)的積累，相對生長量大幅度提高，推測一方面與NO通過抑制ROS的積累、提高抗氧化酶活性及降低過氧化產(chǎn)物對膜結(jié)構的損傷，維持了膜結(jié)構的完整性和流動性，促進了細胞生長有關；另一方面由于NO參與了對光合過程的調(diào)節(jié)，光化學活性的提高促進了南瓜幼苗對養(yǎng)分和水分的吸收[18]。

碳氮代謝是植物體內(nèi)兩大代謝途徑，兩者相互依存，緊密聯(lián)系。光合碳代謝為有機氮代謝提供能量和碳架；有機氮代謝為碳素同化提供必要的酶類并爭奪和共用碳素代謝生成的同化力和中間產(chǎn)物[14]。

催化植物光合碳同化的雙功能酶Rubisco對環(huán)境極為敏感，在非生物脅迫條件下極易被降解[24]。鹽脅迫導致Rubisco與葉綠體內(nèi)膜上的可溶性酶復合物交聯(lián)和易位，并迅速被降解[25]。本研究同發(fā)現(xiàn)，在60 mmol·L-1Na2CO3脅迫下，南瓜幼苗葉片Rubisco羧化活性降低59.58%，氧化活性升高了34.43%，80 μmol·L-1的SNP處理明顯延緩了Rubisco羧化活性的下降和氧化活性的上升，外源NO一定程度上修復了Na2CO3脅迫造成的損傷，這與熊大斌等脯氨酸對鹽脅迫下大麥葉片Rubisco酶活性的研究結(jié)果一致[24]，說明在植物生長發(fā)育以碳代謝為主的早期，NO的調(diào)控不僅為氮代謝提供了充足的碳架，更為光合產(chǎn)物的還原提供了還原力。

AMY負責將葉綠體中積累的光合產(chǎn)物轉(zhuǎn)化為單糖，一方面直接作為氨基受體形成有機碳氮化合物，另一方面依環(huán)境變化間接調(diào)節(jié)細胞滲透壓，維持細胞正常代謝，是碳代謝強度的重要指標[26]。本試驗結(jié)果表明，Na2CO3脅迫初期，AMY活性急劇升高，是南瓜幼苗對逆境脅迫的應激反應，通過加速淀粉水解和轉(zhuǎn)化增加胞內(nèi)可溶性糖的含量來抵御滲透脅迫，這與鉬脅迫對煙草葉片AMY活力的影響趨勢一致[26]。外源NO上調(diào)了Na2CO3脅迫下的AMY活性，由于CO2同化及氮代謝的大部分反應均在葉綠體中進行，碳代謝的中間產(chǎn)物為氨基酸的合成提供了前體。

葉綠體的類囊體膜是對環(huán)境最為敏感和脆弱的生物膜，Na2CO3脅迫破壞了南瓜幼葉的葉綠體結(jié)構，造成葉片的光合損傷，從而致使葉綠素和類胡蘿卜素含量下降。外源SNP顯著提高了堿性鹽環(huán)境下的Chl a、Chl b及Caro，說明NO對Na2CO3脅迫下南瓜幼苗光合作用的下降具有緩解作用，這與蘆翔等[27]在燕麥上的研究結(jié)果一致。

NR是硝態(tài)氮同化的關鍵酶，本試驗結(jié)果顯示，由于Na2CO3環(huán)境造成南瓜幼苗功能葉片蛋白質(zhì)合成受阻，降解加強，故NR活力下降。添加外源NO顯著提高了NR活力，這是因為NO一定程度修復了堿性鹽所造成的氧化損傷，促進了根系對NO3-的吸收和轉(zhuǎn)運[4]，從而誘導NR活性升高。NR及NiR還原胺化的產(chǎn)物須經(jīng)GS/GOGAT循環(huán)來解除氨毒。由于Na2CO3脅迫嚴重制約了碳代謝，而CO2同化速率直接影響NO3-還原的能量和碳架供應，且碳代謝產(chǎn)物必須轉(zhuǎn)化成氨基共同受體α-KG才能供氨基酸合成之用，故導致GS、GOGAT活力同步降低，與NR表現(xiàn)出協(xié)同效應。添加NO后緩解了酶活抑制，推測與NO促進了南瓜幼苗早期碳代謝，促進了光合積累，協(xié)調(diào)了庫源關系。NR對硝態(tài)氮的持續(xù)同化，使碳流從合成糖轉(zhuǎn)向合成氨基酸的方向。由于有機酸尤其是α-KG較糖的氧化水平高，故由糖轉(zhuǎn)化成α-KG可釋放出較多的同化力，滿足了GS/GOGAT循環(huán)的需求，實現(xiàn)了碳流的快速運轉(zhuǎn)[14]。樊懷福[19]和劉建新等[7]的研究證實了外源NO通過提高葉片凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、葉綠素含量和光能的捕獲及轉(zhuǎn)換而使鹽害得以緩解，促進了黃瓜和黑麥草的生長。GDH既催化Glu氧化脫氨，又可將α-KG還原胺化。Robinson等[28]認為，逆境下GDH活性調(diào)控與碳的供應同化有關。本試驗中，Na2CO3環(huán)境導致南瓜葉片GDH活性急劇升高，原因為光合碳代謝受阻、碳架不足，此時碳流由氮代謝轉(zhuǎn)而流向碳代謝，Glu脫氫脫氨形成α-KG，一是為TCA循環(huán)補充中間代謝物，二是蛋白水解酶活性的升高加速了蛋白質(zhì)的降解，造成NH4+的快速積累，此時啟動了GDH途徑，而造成GDH活性的升高。80 μmol·L-1的SNP緩解酶活大幅升高的作用與提高了南瓜幼苗碳同化能力密切相關，由于光合作用加強、光合產(chǎn)物增加，為銨的同化提供了能量和物質(zhì)，調(diào)節(jié)了能量和新合成的碳的流向，光合作用可同時向碳代謝及氨基酸合成提供還原力和電子，最大限度地緩解了傷害，滿足了碳氮代謝的同時需要。

氨基酸的合成既取決于氨的生成和α-KG的碳架供應，同時又與蛋白質(zhì)的降解密切相關。前者受NR和GS活性調(diào)節(jié)，而蛋白質(zhì)的積累程度則取決于其合成和降解的相對強弱。60 mmol·L-1Na2CO3脅迫處理，南瓜葉片可溶性蛋白首先表現(xiàn)為激增之后劇降，可能為在相對短時間內(nèi)誘導南瓜葉片產(chǎn)生和積累了逆境蛋白，如滲調(diào)蛋白(OSM)、水通道蛋白等，這在番茄、甜菜、豌豆等植物中已被證明OSM的存在具有普遍性[15]。隨脅迫強度加大，一是光合碳代謝受阻，光合鏈及光合代謝產(chǎn)物提供的還原劑匱乏，降低了蛋白質(zhì)的合成速率，導致可溶性蛋白含量大幅下降；二是蛋白水解酶活性的上調(diào)也加速了原有蛋白質(zhì)的降解，從而使游離氨基酸總量上升；三是高pH的蛋白質(zhì)變性作用。外源SNP復合處理，一定程度上逆轉(zhuǎn)了可溶性蛋白的下降和氨基酸的積累，使碳流向氮代謝方向運轉(zhuǎn)，促進了南瓜幼苗的早期發(fā)育和形態(tài)建成，提高了幼苗的耐堿性，這與劉建新[18]、鄭春芳等[29]外源NO對裸燕麥(Avena nuda)及小麥在NaCl及NaHCO3脅迫下可溶性蛋白積累的影響研究結(jié)果一致，但游離氨基酸含量的變化趨勢則不相同。

綜上所述，碳氮代謝是植物體內(nèi)同時進行、相互依存的生化過程，碳氮代謝失調(diào)是南瓜幼苗受到堿脅迫的重要表現(xiàn)。60 mmol·L-1Na2CO3致使南瓜幼苗光合產(chǎn)物的合成、積累受到嚴重影響，光合碳同化提供的電子不足，使處于碳氮代謝偶聯(lián)節(jié)點的NR不能及時還原NO3-→NH4+，GS、GOGAT的胺化過程受阻。80 μmol·L-1的SNP增強了Na2CO3脅迫下的南瓜幼苗的光合作用，使光合碳代謝中合成的酮酸轉(zhuǎn)化為氨基酸。通過提高氮代謝相關酶NR、GS、GOGAT活性，加快了胺化過程，減少了氨基酸的積累和NH4+的細胞毒性?？扇苄蕴?、可溶性蛋白含量的提高為南瓜苗期發(fā)育中的物質(zhì)和能量代謝及形態(tài)建成提供了還原力和ATP，協(xié)調(diào)了CO2同化和NO3-還原之間因競爭中間代謝物而產(chǎn)生的相互抑制。光合碳代謝的促進為氮代謝——氨基酸、蛋白質(zhì)的合成提供了充足的原料，提高了南瓜幼苗的耐堿性，為在實際生產(chǎn)中南瓜的抗鹽堿栽培提供可行性途徑。

[1] 張春霞，邊鳴鏑，于 慧，等.碳酸鈉脅迫對甜高粱種子萌發(fā)和幼苗期生理特性的影響[J].吉林農(nóng)業(yè)大學學報，2011，33(2)：134-138，143.[2] 杜長霞，邵俏賽，樊懷福，等．外源NO對Ca(NO3)2脅迫下黃瓜幼苗生長和抗氧化系統(tǒng)的影響[J]．核農(nóng)學報，2013，27(6)：854-860．[3] 吳雪霞，陳建林，查丁石，等．外源一氧化氮對NaCl脅迫下番茄幼苗活性氧代謝的影響[J]．植物營養(yǎng)與肥料學報，2009，15(2)：422-428．

[4] 陳 明，沈文飚，阮海華，等．一氧化氮對鹽脅迫下小麥幼苗根生長和氧化損傷的影響[J]．植物生理和分子生物學報，2004，30(5)：569-576.

[5] 劉文瑜，楊宏偉，魏小紅，等．外源NO調(diào)控鹽脅迫下蒺藜苜蓿種子萌發(fā)生理特性及抗氧化酶的研究[J]．草業(yè)學報，2015，24(2)：85-95．

[6] 肖 強，陳 娟，吳飛華，等．外源NO供體硝普鈉(SNP)對鹽脅迫下水稻幼苗中葉綠素和游離脯氨酸含量及抗氧化酶的影響[J]．作物學報，2008，34(10)：1849-1853．

[7] 劉建新，王金成，王 鑫，等．外源NO對NaHCO3脅迫下黑麥草幼苗光合生理響應的調(diào)節(jié)[J]．生態(tài)學報，2012，32(11):3460-3466．

[8] 張志良，瞿偉菁，李小方．植物生理學實驗指導[M]．第4版．北京：高等教育出版社，2009：76-79．

[9] 李合生．植物生理生化實驗原理和技術[M]．北京：高等教育出版社，2000：169-172．

[10] 湯章誠．現(xiàn)代植物生理學實驗指導[M]．北京：科學出版社，2004．

[11] 趙全志，陳靜蕊，劉 輝，等．水稻氮素同化關鍵酶活性與葉色變化的關系[J] ．中國農(nóng)業(yè)科學，2008，41(9)：2607-2616．

[12] Majerowicz N，Kerbauy G B，Nievola C C，et al．Growth and nitrogen metabolism of Catasetum fimbriatum(Orchidaceae) grown with different nitrogen sources[J]． Environmental and Experimental Botany，2000，44:195-206．

[13] 張志剛，芮 琪，徐朗萊．小麥葉片老化期間的內(nèi)肽酶與H2O2的關系[J].植物學報，2001，43(2)：127-131.

[14] 宋建民，田紀春，趙世杰．植物光合碳和氮代謝之間的關系及其調(diào)節(jié)[J]．植物生理學通訊，1998，34(3):230-238．

[15] 楊曉慧，蔣衛(wèi)杰，魏 珉，等．植物對鹽脅迫的反應及其抗鹽機理研究進展[J] ．山東農(nóng)業(yè)大學學報(自然科學版)，2006，37(2):302-305．

[16] 趙 利，陳貴林，李衛(wèi)欣，等．NaCl、Na2SO4和Na2CO3對南瓜幼苗的生理脅迫效應[J]．河北農(nóng)業(yè)大學學報，2006，29(6)：21-24．

[17] Qiao W H，F(xiàn)an L M． Nitric oxide signaling in plant responses to abiotic stresses[J]． Journal of Integrative Plant Biology，2008，50:1238-1246．

[18] 劉建新，王金成，王瑞娟，等．外源一氧化氮提高裸燕麥幼苗的耐堿性[J]．草業(yè)學報，2015，24(8)：110-117．

[19] 樊懷福，郭世榮，焦彥生，等．外源一氧化氮對NaCl脅迫下黃瓜幼苗生長、活性氧代謝和光合作用的影響[J]．生態(tài)學報，2007，27(2)：546-553．

[20] 林 燕，洪艷艷，史慶華，等．SNP對NaHCO3脅迫下黃瓜幼苗生長及氮代謝酶活性的影響[J]．植物營養(yǎng)與肥料學報，2010，16(5)：1294-1298．

[21] 周萬海，師尚禮，寇江濤．鹽脅迫下外源NO對苜蓿幼苗生長及氮代謝的影響[J] ．應用生態(tài)學報，2012，23(11):3003-3008．

[22] Palavan-Unsal N， Arisan D． Nitric oxide signalling in plants[J]． Botanical Review，2009，75:203-229．

[23] Delledonne M， Xia Y， Dixon R A， et al． Nitric oxide functions as a signal in plant disease resistance[J]． Nature，1998，394：585-588．

[24] 熊大斌，曹玲瓏，李冬兵，等．脯氨酸對鹽脅迫條件下大麥葉片Rubisco酶活性的影響[J]．河南農(nóng)業(yè)大學學報，2015，49(4)：443-449．

[25] Mehta R A， Fawcett T W， Porath D， et al． Oxidative stress causes rapid membrane translocation and in vivo degradation of ribulose-1，5-bisphosphate carboxylase/oxygenase[J]． J Biol Chem，1992，267(4):2810-2816．

[26] 武 麗，張西仲，唐興貴，等．鉬脅迫對煙草含鉬酶和碳氮代謝關鍵酶的影響[J]．核農(nóng)學報，2015，29(12)：2385-2393．

[27] 蘆 翔，石衛(wèi)東，王宜倫，等.外源NO對NaCl脅迫下燕麥幼苗抗氧化酶活性和生長的影響[J].草業(yè)科學，2011，12(28):2150-2156．

[28] Robinson S A， Stewart G R， Phillips R． Regulation glutamate dehydrogenase activity in relation to carbon limitation and protein catabolism in carrot cell suspension culture[J]． Plant Physiology，1992，98:1190-1195．

[29] 鄭春芳，姜 東，戴廷波，等．外源一氧化氮供體硝普鈉浸種對鹽脅迫下小麥幼苗碳氮代謝及抗氧化系統(tǒng)的影響[J]．生態(tài)學報，2010，30(5)：1174-1183．

EffectsofexogenousnitricoxideonthegrowthandcarbonandnitrogenmetabolismofpumpkinseedlingsunderNa2CO3stress

WU Xu-hong1, LUO Gui-qiang1, FENG Jing-min2

(1.CollegeofLifeSciences，AgricultureandForestry，QiqiharUniversity，Qiqihar,Heilongjiang161006，China; 2.QiqihaerSanitarySupervisionInstitute，Qiqihaer,Heilongjiang161006,China)

In order to explore the effects of exogenous nitric oxide on metabolism process of carbon and nitrogen of pumpkin seedlings, a pot experiment was conducted to study the effects of 80 μmol·L-1SNP on the growth of seedlings, the contents of chloroplast pigments, the activities of carbon and nitrogen metabolism related enzymes and the amount of metabolites of pumpkin (cv. Yinhui No.2) seedlings under the stress of 60 mmol·L-1Na2CO3. The results showed that aboveground and underground dry weight, relative growth rate, root shoot ratio, Rubisco carboxylase activity, light enzyme activity of photosynthetic pigment contents and nitrogen metabolism were decreased in different degrees, while Rubisco oxidation activity, total free amino acids and proteolytic enzyme activity were significantly increased when the seedlings exposed to 60 mmol·L-1Na2CO3for 12 d. Application of 80 μmol·L-1SNP obviously alleviated the inhibition effects of Na2CO3stress on the seedling growth and photosynthesis, as it increased the plant dry matter and leaf chlorophyll content. Compared with Na2CO3stress treatment, 80 μmol·L-1SNP considerably increased dry matter accumulation, relative dry weight, chlorophyll content, carotenoid content, nitrate reductase, glutamine synthetase, carboxylase, amylase activity and soluble protein accumulation by 26.72%, 30.45%, 17.69%, 46.15%, 46.43%, 30.70%, 38.75%, 70.0%, 65.37%, respectively, while decreased protease, oxygenase activity, free amino acid content by 18.29%, 31.76%, 28.57%. Meanwhile, exogenous NO maintained the stability of total soluble sugar content by increasing the activity of amylase and Rubisco carboxylation and decreasing the oxidative activity. Exogenous NO also inhibited the activity of proteolytic enzymes and glutamate dehydrogenase (GDH), decreased the content of free amino acids in leaves, and increased the accumulation of protein by increasing the activity of NR, GS and glutamate synthase (GOGAT). Under alkaline salt stress, 80 μmol·L-1SNP promoted the keto acid translating into amino acids through the enhancement of pumpkin seedlings photosynthetic carbon metabolism. Meanwhile, by improving the activity of related enzymes NR, GS, GOGAT, 80 μmol·L-1SNP caused the switch of carbon to nitrogen, maintaining the balance between them under salt stress of Na2CO3.

nitric oxide； Na2CO3stress； carbon and nitrogen metabolism； pumpkin； metabolic substances

1000-7601(2017)03-0151-08doi:10.7606/j.issn.1000-7601.2017.03.24

2016-04-14

：2017-03-04

：黑龍江省教育廳科學技術研究項目(10551332)

：吳旭紅(1962—)，女，黑龍江齊齊哈爾人，教授，主要從事植物營養(yǎng)及生理研究。 E-mail:wvg25583681129@sina.com

Q945.78

： A