短時水分脅迫對水稻葉片光合作用的影響

李俊周，喬江方，李夢琪，杜彥修，趙全志

(河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心/河南省水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部黃淮海作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450002)

短時水分脅迫對水稻葉片光合作用的影響

李俊周，喬江方，李夢琪，杜彥修，趙全志

(河南糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心/河南省水稻生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)部黃淮海作物生理生態(tài)與耕作重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 河南 鄭州 450002)

為揭示水分脅迫下水稻葉片光合特性下降的生理原因，以水培的水稻幼苗為材料，測定30% PEG-6000模擬水分脅迫150 min過程水稻葉片光合特性、熒光參數(shù)和光合機(jī)構(gòu)關(guān)鍵酶活性的變化。結(jié)果表明：短時水分脅迫處理0～60 min氣孔導(dǎo)度快速下降，胞間CO2濃度、凈光合速率、蒸騰速率和熒光參數(shù)均降低；60～120 min氣孔導(dǎo)度緩慢下降，RuBP羧化酶活性開始快速下降，胞間CO2濃度開始上升，非光化學(xué)猝滅仍然是上升趨勢，其它光合熒光參數(shù)持續(xù)降低。120 min后，非光化學(xué)猝滅出現(xiàn)下降趨勢，RuBP羧化酶活性和胞間CO2濃度分別保持下降和上升趨勢，其它光合熒光參數(shù)持續(xù)降低。短時脅迫處理結(jié)果暗示，光合作用0～60 min主要受氣孔限制，60～120 min受氣孔限制和非氣孔限制共同作用，120 min后主要受非氣孔限制。

水稻；短時水分脅迫；光合熒光特性；非氣孔限制；氣孔限制

水分脅迫是限制作物生長和產(chǎn)量的主要環(huán)境因子之一。水分脅迫對產(chǎn)量的影響主要是通過影響植物葉片的光合機(jī)構(gòu)，以降低其光合性能[1]。薛崧等[2]研究認(rèn)為水分脅迫對作物光合色素有顯著影響，會造成葉綠素合成速率降低、葉綠素(Chl)分解和類胡蘿卜素(Caro)含量減少，引起Chla/b和Chl/Caro值的改變，進(jìn)而影響原初反應(yīng)和激發(fā)能的傳遞，導(dǎo)致光能吸收效率的降低。趙麗英等[3]通過PEG-6000處理發(fā)現(xiàn)水分脅迫對小麥幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)影響較大，證實(shí)嚴(yán)重水分虧缺或長時間水分虧缺植物葉片的光合機(jī)構(gòu)會受到破壞。PEG-6000脅迫處理兩天會使敏旱玉米品種類囊體膜受損、葉綠體超微結(jié)構(gòu)遭受破壞[4]。盧從明等[5]采用自然失水法進(jìn)行不同程度的水分脅迫，發(fā)現(xiàn)輕度水分脅迫對葉片光合電子傳遞速率影響較小，嚴(yán)重水分脅迫會對明顯抑制光合電子傳遞活性，環(huán)式與非環(huán)式光合磷酸化活性受抑程度更大。RuBP羧化酶對凈光合速率起著決定性的影響，是光合碳同化的關(guān)鍵酶。王仁雷等[6]通過研究水分脅迫條件下水稻的光合特性，發(fā)現(xiàn)隨著NaCl脅迫時間和濃度的加大，凈光合速率、PSⅡ光化學(xué)效率(Fv/Fm)和RuBP羧化酶活性下降，氣孔導(dǎo)度和胞間CO2濃度減小。前人關(guān)于水分脅迫處理后水稻葉片光合特性及關(guān)鍵酶活性的研究主要集中于長時間脅迫處理后的變化，長時間脅迫處理后的結(jié)果受植株自身調(diào)節(jié)的影響。而水稻葉片光合特性及光合機(jī)構(gòu)對短時水分脅迫的影響還不是很清楚，本研究采用PEG-6000模擬水分脅迫處理，研究短時脅迫處理對光合特性及光合機(jī)構(gòu)的影響，探討短時脅迫影響水稻葉片光合作用下降的的內(nèi)在機(jī)理。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)在河南農(nóng)業(yè)大學(xué)室內(nèi)人工氣候室進(jìn)行。供試水稻品種為秈型雜交稻兩優(yōu)培九、粳型常規(guī)稻豫粳六號和738。種子消毒后，在培養(yǎng)皿中發(fā)芽，秧苗3葉1心時移栽至水培液中，營養(yǎng)液采用國際水稻研究所吉田昌一的配方，氮素濃度一直維持在40 mg·L-1。水培箱的長、寬和深分別為33 cm、23 cm和10 cm，每箱移栽9株。秧苗移栽前先在清水中處理4 d，以使植株間差異趨于一致，以后開始營養(yǎng)液處理。每7 d更換營養(yǎng)液一次，pH保持5.0～5.3。試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

水稻生長至9葉1心，選取生長一致的水稻苗進(jìn)行測定，水分脅迫采用PEG-6000模擬水分脅迫，PEG濃度設(shè)定為30%，水勢比正常水分下降了1.25 MPa。PEG處理0、30、60、90、120、150 min進(jìn)行各性狀的測定，每重復(fù)測定3株。

光合特性采用光合測定系統(tǒng)(LI-6400，Li-cor company，Nebraska，USA)進(jìn)行測定。采用開放式氣路，在10∶00—12∶00時采用人工紅藍(lán)光源，光強(qiáng)設(shè)定為1 000 μmol·m-2·s-1。測定的指標(biāo)包括凈光合速率Pn、氣孔導(dǎo)度Gs、胞間CO2濃度Ci、蒸騰速率Tr和羧化效率CE(羧化效率為Pn/Ci)。

葉綠素?zé)晒鉁y定采用FMS2型便攜調(diào)制式葉綠素?zé)晒鈨x(Hansatech, 英國)。測定前，植株均在PAR=600 μmol·m-2·s-1、Ta=25℃條件下適應(yīng)1 h，然后用葉夾夾住葉片(暗適應(yīng))15～30 min。測定時，熒光儀按預(yù)先設(shè)定的程序首先以弱測量光(<0.05 μmol·m-2·s-1)照射葉片，測量出F0。然后以飽和脈沖光(12 000 μmol·m-2·s-1)照射，給出Fv、Fm以及Fv/Fm。最后以AL(光化光，180 μmol·m-2·s-1)持續(xù)照射3 min后測定ΦPSⅡ。其它葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)如電子傳遞速率、qP(光化學(xué)猝滅系數(shù))、NPQ(非光化學(xué)猝滅系數(shù))等同時給出。

RuBP羧化酶活性測定采用加入RuBP底物反應(yīng)的方法[7]，取水稻葉1 g，沖洗干凈晾干，加入5 ml預(yù)冷的提取介質(zhì)，在冰浴上研磨至勻漿，經(jīng)4層紗布過濾，濾液于4℃下20 000 g離心15 min，棄沉淀；上清液即粗酶提取液置0℃保存?zhèn)溆?。吸取Tris 0.3 ml，MgCl 20.3 ml，ATP 0.3 ml，DTT 0.3 ml，NADH 0.3 ml，KHCO30.1 ml，EDTA 0.3 ml，蒸餾水0.8 ml。取RuBP羧化酶液0.1 ml于試管，30℃保溫10 min，然后加入0.1 ml的三磷酸苷油酸激酶/三磷酸苷油酸脫氫酶，在分光光度計(jì)340 nm測定光吸收E0，最后加0.1 ml的RuBP，立刻于340 nm每隔15 sec至30 sec間隔，測光吸收變化E1。

酶活力=(E0-E1)×Vt/(2×d×∮×△t×Vs)

式中，E0、E1分別為反應(yīng)前、后反應(yīng)液的A340；Δt為E0到E1的時間(min)；∮為1 μmol NADH的吸光系數(shù)(6.22)；d為比色杯的光徑(cm)；Vt為酶液總量(ml)；Vs為反應(yīng)液體積(ml)；酶活力單位為(mmol·mm-1·ml-1)；2表示每固定1 mol CO2有2 mol NADH被氧化。

1.3 統(tǒng)計(jì)分析

利用 Excel對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理及制圖。數(shù)據(jù)分析采用DPS V9.50軟件，樣本平均數(shù)的差異顯著性測驗(yàn)采用LSD法。

2 結(jié)果與分析

2.1 短時水分脅迫對水稻光合特性的影響

從圖1可以看出，脅迫處理后150 min內(nèi)水稻凈光合速率呈現(xiàn)下降趨勢，處理0～30 min下降速率較快，30～90 min下降相對平緩。脅迫后三個品種葉片氣孔導(dǎo)度均呈現(xiàn)Z字型的變化趨勢，處理0～30 min緩慢下降，30～60 min迅速下降，60 min后又緩慢下降，150 min水稻葉片氣孔基本關(guān)閉。脅迫150 min兩優(yōu)培九、豫粳六號和738三個品種氣孔導(dǎo)度分別下降86.74%、88.82%和87.52%，氣孔導(dǎo)度下降的幅度較凈光合速率大。葉片胞間CO2濃度脅迫后呈現(xiàn)倒拋物線的變化趨勢，脅迫0～60 min胞間CO2濃度處于下降的變化趨勢，60 min后又呈上升趨勢。葉片蒸騰速率脅迫后都有不同程度的下降，處理0～60 min下降速率較快，60 min后下降速率有所降低。處理150 min兩優(yōu)培九、豫粳六號和738三個品種分別下降53.67%、70.89%和83.49%。葉片羧化效率脅迫后呈現(xiàn)下降的變化趨勢，處理0～60 min變化程度較小，60 min后快速下降。處理150 min兩優(yōu)培九、豫粳六號和738三個品種羧化效率分別下降85.25%、75.29%和78.5%。

2.2 短時水分脅迫對水稻葉片熒光誘導(dǎo)動力學(xué)參數(shù)的影響

由葉片光化學(xué)效率Fv/Fm的變化可以看出(圖2)，脅迫0～30 min迅速下降，隨后緩慢下降，但整體仍處于下降的趨勢。脅迫150 min兩優(yōu)培九、豫粳六號和738分別下降23.96%、22.6%和27.62%。實(shí)際光化學(xué)效率脅迫后三個品種都存在明顯的下降趨勢，0～90 min平緩下降，90 min后迅速下降。脅迫150 min兩優(yōu)培九、豫粳六號和738葉片實(shí)際光化學(xué)效率分別下降34.92%、24.75%和21.35%。葉片光化學(xué)猝滅系數(shù)脅迫后三個品種均有不同程度的下降趨勢，0～90 min緩慢下降，90 min后迅速下降。脅迫150 min兩優(yōu)培九、豫粳六號和738分別下降45.72%、33.74%和42.89%。隨處理時間延長水稻葉片葉綠體原初反應(yīng)電子用于光合電子傳遞的份額逐漸減小。葉片非光化學(xué)猝滅脅迫后三個品種呈現(xiàn)先上升而后下降的變化趨勢，0～120 min緩慢上升，120 min兩優(yōu)培九、豫粳六號和738非光化學(xué)猝滅達(dá)最大值，分別比處理前上升48.19%、63.28%和63.16%。120 min后非光化學(xué)猝滅緩慢下降。水稻葉片電子傳遞速率脅迫后都有不同程度的下降，0～90 min平緩下降，90 min后迅速下降。脅迫150 min兩優(yōu)培九、豫粳六號和738葉片光合電子傳遞速率分別下降70.0%、61.13%和62.33%。

圖1 短時水分脅迫水稻葉片光合特性的變化

圖2 短時水分脅迫水稻葉片葉綠素?zé)晒馓匦缘淖兓?/p>

2.3 短時水分脅迫對水稻葉片RuBP羧化酶活性的影響

RuBP羧化酶是光合作用光合碳循環(huán)中最初的CO2固定酶，是光合碳同化的關(guān)鍵酶，對凈光合速率起決定性作用。從圖3可以看出，脅迫后水稻葉片中RuBP羧化酶活性逐漸下降，處理0～30 min明顯下降，隨后30～120 min緩慢下降，120 min后迅速下降。150 min兩優(yōu)培九、豫粳六號和738分別下降67.29%、37.59%和65.43%。

圖3 短時水分脅迫水稻葉片RuBP羧化酶活性的變化

3 討 論

植物感知脅迫作用后，通常表現(xiàn)出光合作用下降。前人研究發(fā)現(xiàn)，PEG模擬短時水分脅迫后各種色素蛋白復(fù)合體含量都會出現(xiàn)不同程度的降低，其中LHCⅡ下降幅度最大，從而導(dǎo)致激發(fā)能從LHCⅡ向光系統(tǒng)Ⅱ傳遞的降低，表現(xiàn)出光系統(tǒng)Ⅱ熒光發(fā)射強(qiáng)度和Fv/Fm大幅下降，導(dǎo)致光合作用降低[8-10]。本試驗(yàn)30% PEG模擬水分脅迫150 min，光合電子傳遞速率降低，ATP和NADPH形成受阻，Rubisco的大幅下降直接影響了C3途徑中CO2的固定，最終影響光合作用碳同化的進(jìn)行，導(dǎo)致凈光合速率大幅下降以及熒光參數(shù)F0、ΦPSⅡ、qP的降低，NPQ升高，這都表明光合系統(tǒng)已經(jīng)受到嚴(yán)重影響，植物啟動了相應(yīng)的水分脅迫適應(yīng)機(jī)制。

植物受到水分脅迫后，光合作用受到氣孔限制和非氣孔限制的雙重調(diào)節(jié)[11]。輕度水分脅迫初期光合速率的降低是主要是通過氣孔限制，即氣孔關(guān)閉以減少蒸騰作用，進(jìn)而阻礙CO2進(jìn)入葉內(nèi)；嚴(yán)重水分或者長時間水分處理，限制因素逐漸變?yōu)榉菤饪紫拗芠12-13]。

表明隨著植物葉片水勢的降低，植物葉片光合器官遭受破壞和活性降低，光合速率下降從氣孔限制逐漸向葉肉細(xì)胞光合活性限制進(jìn)行轉(zhuǎn)變，也就是向非氣孔限制的轉(zhuǎn)變[14-15]。本試驗(yàn)150 min PEG模擬水分脅迫過程中熒光誘導(dǎo)動力學(xué)參數(shù)的變化趨勢較復(fù)雜，氣孔導(dǎo)度0～30 min緩慢下降和30～60 min快速下降引起胞間CO2濃度、凈光合速率和蒸騰速率的下降，以及各熒光參數(shù)的降低，此階段主要是氣孔限制起主要作用。60～120 min氣孔導(dǎo)度緩慢下降，RuBP羧化酶活性和羧化效率呈現(xiàn)下降趨勢，胞間CO2濃度開始上升，非光化學(xué)猝滅仍然是上升趨勢，其它光合熒光參數(shù)持續(xù)降低。這暗示此階段光合作用的下降不全部是由氣孔關(guān)閉引起的，葉肉細(xì)胞光合活性降低的非氣孔限制也開始起作用。120 min后，非光化學(xué)猝滅表現(xiàn)出下降趨勢，RuBP羧化酶活性出現(xiàn)快速下降趨勢，胞間CO2濃度保持上升趨勢，其他光合熒光參數(shù)持續(xù)降低，暗示光合器官與功能受到破壞，非氣孔限制成為光合作用的主要限制因素。本研究也證明了輕度水分脅迫初期氣孔限制起主要作用，長時間或者嚴(yán)重脅迫是以非氣孔限制為主。因此，氣孔限制和非氣孔限制對光合作用的影響取決于水分脅迫的時間和程度。

[1] Teng K Q, Li J Z, Liu L, et al. Exogenous ABA induces drought tolerance in upland rice: the role of chloroplast and ABA biosynthesis-related gene expression on photosystem II during PEG stress[J]. Acta Physiol Plant, 2014,36:2219-2227.

[2] 薛 崧,汪沛洪,許大全,等.水分脅迫對冬小麥CO2同化作用的影響[J].植物生理學(xué)報(bào),1991,18(1):1-7.

[3] 趙麗英,鄧西平,山 侖.滲透脅迫對小麥幼苗葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響[J].應(yīng)用生態(tài)學(xué)報(bào),2005,16(7):1261-1264.

[4] Shao R X, Xin L F, Zheng H F, et al. Changes in chloroplast ultrastructure in leaves of drought-stressed maize inbred lines[J]. Photosynthetica, 2016,54(1):74-80.

[5] 盧從明,張其德,匡延云.水分脅迫對小麥光系統(tǒng)Ⅱ的影響[J].植物學(xué)報(bào),1994,36(2):93-98.

[6] 王仁雷,華 春,劉友良.鹽脅迫對水稻光合作用的影響[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào),2002,25(4):11-14.

[7] 高俊鳳.植物生理學(xué)試驗(yàn)指導(dǎo)[M].高等教育出版社,2006.

[8] 盧從明,張其德,匡延云.水分脅迫對小麥葉綠體激發(fā)能分配的光系統(tǒng)Ⅱ原初光能轉(zhuǎn)化效率的影響[J].生物物理學(xué)報(bào),1995,11(1):82-86.

[9] Li J Z, Chen Y P, Teng K Q, et al. Rice leaf heterogeneity in chlorophyll fluorescence parameters under short-term osmotic stress[J]. Biol Plantarum, 2015,59:187-192.

[10] Zhang H, Ni Z, Chen Q, et al. Proteomic responses of drought-tolerant and drought-sensitive cotton varieties to drought stress[J]. Mol Genet Genomics, 2016:1-11.

[11] Earl H J. Stomatal and non-stomatal restrictions to carbon assimilation in soybean (Glycine max) lines differing in water use efficiency[J]. Environ Exp Bot, 2002,48(3):237-246.

[12] Cornic G. Drought stress inhibits photosynthesis by decreasing stomatal aperture-not by affecting ATP synthesis[J]. Trends Plant Sci, 2000,5(5):187-188.

[13] Parry M A J, Andralojc P J, Khan S, et al. Rubisco activity: effects of drought stress[J]. Ann Bot, 2002,89(7):833-839.

[14] Ramalho J C, Zlatev Z S, Leito A E, et al. Moderate water stress causes different stomatal and non-stomatal changes in the photosynthetic functioning ofPhaseolusvulgarisL. genotypes[J]. Plant Biol, 2014,16(1):133-146.

[15] Campos H, Trejo C, Pe?a-Valdivia C B, et al. Stomatal and non-stomatal limitations of bell pepper (CapsicumannuumL.) plants under water stress and re-watering: Delayed restoration of photosynthesis during recovery[J]. Environ Exp Bot, 2014,98:56-64.

Theeffectsofshort-termwaterstressonleafphotosynthesisinrice

LI Jun-zhou, QIAO Jiang-fang, LI Meng-qi, DU Yan-xiu, ZHAO Quan-zhi

(CollaborativeInnovationCenterofHenanGrainCrops/KeyLaboratoryofricebiologyandKeyLaboratoryofPhysiology/EcologyandGeneticsImprovementofFoodCropinHenanProvince,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou450002,China)

In order to reveal the physiological mechanism of the reduction of photosynthesis under water stress, the change of photosynthetic and chlorophyll fluorescence characteristics and key enzymes activities of photosynthetic apparatus after 150 min 30% PEG-6000 stress were investigated using rice seedling under hydroponic culture. The result indicated that stomatal conductance decreased drastically, while intercellular CO2 concentration, net photosynthetic rate, transpiration rate, and chlorophyll fluorescence parameters decreased gradually by 0～60 min of stress. During 60～120 min of stress, stomatal conductance decreased slowly, RuBP carboxylase activity began to rapidly decreased, intercellular CO2concentration began to rise, non-photochemical quenching continued rise, other photosynthetic fluorescence parameters continued to drop. After 120 min of stress, non-photochemical quenching began to decline, RuBP carboxylase activity and intercellular CO2concentration showed a trend of declining and increasing respectively, while other photosynthetic fluorescence parameters declined. These results suggest that photosynthesis during 0～60 min of stress and 60～120 min of stress, and after 120 min of stress were regulated by stomatal limitation, combination of stomatal limitation and non-stomatal limitation, and non-stomatal limitation, respectively.

rice; short-term water stress; photosynthetic and chlorophyll fluorescence characteristics; non-stomatal limitation; stomatal limitation

1000-7601(2017)03-0126-04doi:10.7606/j.issn.1000-7601.2017.03.20

2016-03-20

：2017-03-24

：河南省重大科技專項(xiàng)(141100110600)；河南省高?？萍紕?chuàng)新人才支持項(xiàng)目(16HASTIT016)；鄭州市節(jié)水農(nóng)業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室建設(shè)項(xiàng)目(112PYFZX185)

李俊周(1978—)，男，河南開封人，博士，副教授，主要從事水稻抗旱遺傳機(jī)理研究。 E-mail:lijunzhou199899@126.com。

S512.1+2；Q945.79

： A