輕癥和重癥H7N9禽流感病毒的致病性研究

曹賦

輕癥和重癥H7N9禽流感病毒的致病性研究

曹賦

目的對輕癥和重癥H7N9禽流感病毒菌株的致病性進行分析，并探討病毒分子特征與其致病差異間的關聯(lián)性。方法通過建立三種模型即PBMC人體外培養(yǎng)及病毒感染，人肺組織體外培養(yǎng)及病毒感染及小鼠感染H7N9動物模型，分別對輕癥和重癥H7N9攜帶病毒感染者其分離株包括GD-6和GD-7，對兩株病毒的感染性及病理情況進行研究分析。結(jié)果病毒對三種模型組織均能感染并進行有效復制但復制GD-7的能力高于GD-6；在小鼠肺組織內(nèi)，其重癥分離株GD-7病毒增殖力較輕癥分離株GD-6要高且對于小鼠的致病力其重癥分離株GD-7較輕癥分離株GD-6強。結(jié)論GD-7作為重癥分離菌株其復制能力及致病能力均較GD-6輕癥分離株要強。

輕癥；重癥；H7N9禽流感病毒；致病性

禽流感作為由甲型流感病毒所引發(fā)導致的一類禽類傳染性疾病，而人感染H7N9禽流感主要是由禽流感病毒中的H7N9亞型禽流感病毒所致的一種急性呼吸道傳染病[1-2]。其起病急聚、進展速度快、病情惡化后造成的后果較為嚴重，受到大家的倍加關注。若為重癥患者甚至可發(fā)生肺炎合并呼吸衰竭癥或致其他功能器官衰竭的癥狀，存在較高的病死率[3]。

在H7N9流行患者中，臨床上可主要表現(xiàn)出輕癥和重癥兩種類型的感染攜帶者。而輕癥患者中主要發(fā)病人群為兒童，臨床中主要以流感樣癥狀如發(fā)熱、咳嗽、咽部充血作為特征。而重癥患者中的發(fā)病人群主要面向較大年齡的成人，病情發(fā)展急聚，且極易發(fā)生重癥肺炎及急性呼吸窘迫綜合征（ARDS），甚至嚴重者可發(fā)展致感染性休克，多功能器官衰竭至死亡[4-5]。因此本文通過對輕癥和重癥H7N9禽流感病毒攜帶者的致病性進行相關研究，對其臨床治療提供積極的指導意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

所取到的毒株、細胞及H7N9組織禽流感病毒從輕癥并已愈患者中進行分離GD-6，H7N9禽流感病毒從已重癥死亡病例中將GD-7進行分離，兩株病毒菌株均由CDC測試機構(gòu)予以惠贈。而人外周血單個核細胞（Peripheral blood mononuclear cell，PBMC）經(jīng)Ficoll-Hypaque梯度離心從人的全血中進行一一分離。取自新鮮的人肺組織從癌變組織遠處的正常肺組織及癌旁組織中進行提取的，均由合格的三家醫(yī)院進行提供。收集及采集樣本的知情權(quán)均予以按照要求告知患者本人或其直系家屬。所有患者經(jīng)院倫理委員會通過審批，并在知情同意書簽字。

1.2 方法[6-8]

1.2.1 細胞培養(yǎng) 人PBMC在96孔培養(yǎng)板上按1×105細胞/孔進行平鋪，在培養(yǎng)液中吸附2 h后將其移去，然后用含體積分數(shù)為0.2%BSA及2 μg/ml的TPCK-trypsin的RPMI1640培養(yǎng)基于37 ℃、含體積分數(shù)為5%二氧化碳（CO2）飽和濕度恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細胞長至對數(shù)生長期并傳代至足夠數(shù)量時，凍存，準備實驗。

1.2.2 肺組織感染 取人肺組織部位切成2～3 mm小塊狀物，感染劑量達到104PFU/ml。在培養(yǎng)液中吸附2 h后將其移去，然后用含體積分數(shù)為0.2%BSA及2 μg/ml的TPCK-trypsin 的RPMI1640培養(yǎng)基于37 ℃、含體積分數(shù)為5%二氧化碳（CO2）飽和濕度恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.3 熒光定量聚合酶鏈式反應（Fluorescence Quantitative Polymerase Chain Reaction，PCR術） 切取適當大小組織利用免疫組化試劑盒（上?；蚩萍迹?，使用OMEAE.Z.N.A.TM Micro Elute Total RNA Kit 提取組織 mRNA，用Takara Prime Script RT reagent kit withg DNAeraser 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA（-20 ℃儲存?zhèn)溆茫缓笥肧YBR Green進行熒光定量PCR。再使用特異性引物進行擴增。每個樣品3個復孔，取閾值循環(huán)（Threshold Cycle，CT）平均值。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 14.0統(tǒng)計軟件進行比較分析，多組間單因素選擇采用單因素方差分析進，以P0.05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 H7N9病毒在人PBMC的復制水平

經(jīng)定量PCR熒光反應人PBMC中H7N9病毒的復制水平結(jié)果顯示，在感染后尤其在24 h時重癥分離菌株GD-7其復制能力高于輕癥分離菌株GD-6的復制水平值，差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05），見表1。

2.2 H7N9病毒在人肺組織的增殖力

經(jīng)熒光PCR定量反應人肺組織中H7N9病毒的復制能力從結(jié)果顯示可知在發(fā)生感染后在24 h時與輕癥分離菌株GD-6的增殖能力相比，其重癥分離菌株GD-7其增值水平要遠遠較高，差異具有統(tǒng)計學意義（P0.05），見表2。

2.3 兩個病毒菌株對小鼠的致病力

兩株病毒GD-6及GD-7在發(fā)生感染3～9 d后，小鼠均無小鼠死亡病理。兩組中的小鼠雖無體質(zhì)量下降現(xiàn)象但GD-7 發(fā)生小鼠感染的體質(zhì)量增加速度較GD-6小鼠慢，見表3。

表1 H7N9病毒在人PBMC的復制水平結(jié)果

表2 H7N9病毒在人肺組織培養(yǎng)中的增殖能力

表3 H7N9病毒對小鼠的致病力

3 結(jié)論

禽流感病毒在病毒分類標準上歸為正粘病毒科中的甲型流感病毒屬，作為一種分節(jié)段的單負鏈RNA病毒。目前有關報道已證實可直接感染人類的禽流感病毒屬主要有H5N1、H9N2、H7N7、H7N7等。有文獻報道其攜帶病毒感染者具有不同的臨床結(jié)局可能與其宿主易感性及病毒本身的特性存在一定關聯(lián)[9]。目前，H7N9禽流感病毒作為一類新型且具有高致病性的禽流感病毒。在臨床中進行對抗人感染H7N9禽流感病毒問題較為復雜，尚未存在較好解決措施。有研究發(fā)現(xiàn)當H7N9禽流感病毒在流行過程中經(jīng)過基因重組及氨基酸位點發(fā)生突變，且處于不斷變化中，當每次流行發(fā)病期間病毒的分離株分子發(fā)生了遺傳特性和致病性，且均表現(xiàn)出較大的差異性，提出將追溯毒株來源及變異動向可能有助于對H7N9的防控[10]。

本文對輕癥和重癥感染者攜帶H7N9禽流感病毒GD-6及GD-7進行相關的研究分析表明重癥H7N9病毒在人PBMC、人肺組織的增殖力與復制水平要高于輕癥H7N9病毒。且重癥H7N9病毒較輕癥H7N9病毒致病力要強。因此對輕、重癥病例進行研究可全面系統(tǒng)地對H7N9 禽流感病毒的特征和致病毒力相互關聯(lián)性進行分析，為H7N9禽流感病毒的致病性提供科學依據(jù)，也為臨床治療提供一定的指導意義。

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Study on Pathogenicity of Mild and Severe Strains H7N9 of Avian Inf l uenza Virus

C AO Fu Department of Respiratory Tuberculosis, Red-Cross Hospital of Yulin City, Yulin Guangxi 537000, China

ObjectiveTo analyze the pathogenicity of mild strain and severe strain H7N9 of avian inf l uenza virus and to explore the association between the molecular characteristics of viruses and their pathogenic differences.MethodsGD-6 and GD-7 were isolated from patients infected with mild or severe H7N9 virus. There models were used in this research, PBMC in vitro cultured and infected by virus, human lung tissue culture and virus infection and mouse infected with H7N9 animal model. Then the pathogenicity of the two strains of the H7N9 virus were analyzed and compared.ResultsIn the three models the virus could infect tissue and reproduce, and GD-7 strain more effectively than GD-6 strain. In the lung tissue of mice, the degeneration of GD-7 virus with higher pathogenicity than that of GD -6 strain.ConclusionGD-7 as a severe isolated strain has stronger ability of replication and pathogenicity than GD-6 strain which isolated from mild H7N9.

mild; severe; H7N9 avian inf l uenza virus; pathogenicity

R440

A

1674-9308（2017）13-0196-03

10．3969/j．issn．1674-9308．2017．13．109

廣西玉林市紅十字會醫(yī)院呼吸結(jié)核科，廣西 玉林 537000