H7N9流感緊急流行病學調(diào)查中發(fā)現(xiàn)病毒抽樣方案的制定與體會

田召芳，李春蕾，黨安坤，蘭鄒然

（1. 煙臺市動物疫病預防與控制中心，山東煙臺 264000；2. 山東省動物疫病預防與控制中心，山東濟南 250022）

H7N9流感緊急流行病學調(diào)查中發(fā)現(xiàn)病毒抽樣方案的制定與體會

田召芳1，李春蕾1，黨安坤2，蘭鄒然2

（1. 煙臺市動物疫病預防與控制中心，山東煙臺 264000；2. 山東省動物疫病預防與控制中心，山東濟南 250022）

對于全面掌握禽間H7N9流感感染狀況來說，開展緊急流行病學調(diào)查時發(fā)現(xiàn)病毒的抽樣方案設(shè)計相當重要。制定方案的步驟包括：明確抽樣方案設(shè)計目的、確定研究方法和抽樣原則、設(shè)計抽樣方案（計算群體抽樣數(shù)量、場群的隨機選擇、場內(nèi)抽樣數(shù)量的計算等）、方案實施、數(shù)據(jù)收集整理和分析等。在方案制定過程中充分體會到了獸醫(yī)流行病學技術(shù)的重要性。

H7N9流感；緊急流行病學調(diào)查；抽樣方案；流行病學

自2013年人間出現(xiàn)了H7N9流感感染病例以來，人H7N9流感已經(jīng)歷了4個流行季，呈現(xiàn)周期性發(fā)展[1]。由于該病毒易于重組和變異，衛(wèi)生部門擔心該病毒可能會重組和變異為在人和人之間傳播的毒株，從而導致在人間的大流行。這種擔心有其理論依據(jù)[2]。而對于禽類，自2013年在活禽市場中監(jiān)測到H7N9流感病毒后，獸醫(yī)科學家們就擔心這種病毒會朝著對禽類高致病性的毒株進化。一旦出現(xiàn)高致病性毒株，將對禽類的防控產(chǎn)生巨大的壓力，產(chǎn)生的危害和困難將是難以估計的。2017年高致病性H7N9流感病毒開始出現(xiàn)，并在湖南、河南、河北和天津等地引起了高致病性疫情的暴發(fā)[3]。不管是出現(xiàn)人間H7N9流感病例，或是暴發(fā)家禽疫情，還是在實驗室發(fā)現(xiàn)該病毒病原學陽性情況，獸醫(yī)部門都需要開展緊急流感病學調(diào)查。其中，制定發(fā)現(xiàn)該病毒在各家禽場點分布的抽樣方案，對于證明區(qū)域內(nèi)是否存在該病的感染非常重要。本文結(jié)合近年來的工作，介紹H7N9流感緊急流行病學調(diào)查中發(fā)現(xiàn)病毒抽樣方案設(shè)計及體會，希望能給一線的獸醫(yī)工作者在處理類似工作時提供參考。

1 抽樣方案制定及實施

參考農(nóng)業(yè)部印發(fā)的《動物H7N9流感緊急監(jiān)測方案》和《動物H7N9流感應急處置指南（試行）》[2]，針對縣級層面出現(xiàn)人間H7N9流感病例，或監(jiān)測發(fā)現(xiàn)家禽H7N9病原學陽性情況時，為了發(fā)現(xiàn)更多感染的家禽和了解病原的分布，對該縣所在市開展發(fā)現(xiàn)H7N9流感病毒的抽樣方案設(shè)計，大致需要開展以下工作：其一，確定抽樣方案設(shè)計目的；其二，確定研究方法和抽樣原則；其三，設(shè)計抽樣方案；其四，方案實施；最后，數(shù)據(jù)的收集、整理和分析，為緊急流行病學調(diào)查提供數(shù)據(jù)支持。

1.1 確定抽樣方案設(shè)計目的

掌握該市H7N9流感的存在和分布情況。

1.2 確定研究方法和抽樣原則

1.2.1 研究方法。調(diào)查主要通過橫斷面研究方法實現(xiàn)，通過現(xiàn)場詢問、填寫調(diào)查表與抽樣監(jiān)測的方式進行。

1.2.2 抽樣原則。抽樣原則包括以下幾點：第一，場點選擇應遵循隨機抽樣原則，參考農(nóng)業(yè)部《動物H7N9流感緊急監(jiān)測方案》和《動物H7N9應急處置指南》要求，對不同監(jiān)測區(qū)有所側(cè)重。將出現(xiàn)人間H7N9流感病例，或監(jiān)測發(fā)現(xiàn)家禽H7N9病原學陽性的縣區(qū)作為核心區(qū)；與核心區(qū)相鄰的縣區(qū)作為重點監(jiān)測區(qū)；該市其他區(qū)域作為一般監(jiān)測區(qū)。第二，抽取的場點應包含種禽場、商品場、活禽市場、家禽屠宰場、野鳥棲息地等，所有活禽市場、屠宰場和野鳥棲息地均應被選擇為抽樣場。第三，樣品應涵蓋區(qū)域內(nèi)的所有家禽類和野生鳥類。第四，家禽場內(nèi)，按系統(tǒng)隨機抽樣要求進行隨機抽樣。

1.3 設(shè)計抽樣方案

1.3.1 群體抽樣數(shù)量的計算。用發(fā)現(xiàn)疫病的方法[3]來計算要抽取的場群樣本量，公式為：按預期場群流行率2%，置信水平95%，檢測方法敏感性100%，整個市抽樣框假設(shè)為無窮大，來計算整個市的采樣場點數(shù)量，應隨機監(jiān)測的場點數(shù)量不低于149個（也可用Win episcope、Epi info，以及中國動物衛(wèi)生與流行病學中心提供的計算樣本量的Excel工具等流行病學抽樣軟件[4]進行抽樣量計算）?？紤]到核心區(qū)、重點監(jiān)測區(qū)和一般監(jiān)測區(qū)抽樣數(shù)量有別，可以適當加大核心區(qū)和重點監(jiān)測區(qū)的抽樣比例和抽樣數(shù)量。根據(jù)農(nóng)業(yè)部《動物H7N9流感緊急監(jiān)測方案》和《動物H7N9應急處置指南》要求，核心監(jiān)測區(qū)每個縣（市、區(qū)）至少應采集30個家禽養(yǎng)殖場（村），重點監(jiān)測區(qū)至少采集20個家禽養(yǎng)殖場（村），一般監(jiān)測區(qū)至少采集10個家禽養(yǎng)殖場（村）。以煙臺市為例，比如開發(fā)區(qū)出現(xiàn)H7N9人間病例，則該區(qū)就是核心監(jiān)測區(qū)，周邊的蓬萊市、芝罘區(qū)和福山區(qū)為重點監(jiān)測區(qū)，其他市區(qū)為一般監(jiān)測區(qū)，其實際抽樣場點數(shù)量分配見表1。

表1 煙臺市各縣（市、區(qū)）抽樣場點數(shù)量分配（單位：個）

1.3.2 場群的隨機選擇。因為所有活禽市場、屠宰場和野鳥棲息地均應納入抽樣范圍，這樣需要進行場群選擇的只有家禽養(yǎng)殖場。各縣（區(qū)）可根據(jù)各自的養(yǎng)殖禽場列表（抽樣框），按照系統(tǒng)隨機抽樣方法，選出所要抽取的養(yǎng)禽場。例如，某縣是一般監(jiān)測區(qū)，有家禽場100個，按照要求一般監(jiān)測區(qū)需要抽取10個，那么用系統(tǒng)隨機抽樣方法，等距離每間隔9個場選取1個作為抽樣場，即可選出10個家禽場。

1.3.3 場內(nèi)抽樣數(shù)量的計算。由于流感屬于空氣傳播疫病，病毒一旦進入非免疫禽群，傳播速度會比較快，因此在場內(nèi)進行樣本量計算時，可以考慮使用較大的預期流行率，比如10%。那么按上述發(fā)現(xiàn)疫病的樣本量計算公式，每個場點按照群內(nèi)流行率10%，置信水平95%，檢測方法敏感性100%，預計每個場點的最大采集樣品數(shù)為30 份。如果數(shù)量不夠30份，則按實際數(shù)量采集。

1.3.4 活禽市場、屠宰場和野鳥棲息地樣品的采集。對于活禽市場、屠宰場，除了采集活禽樣本外，還應采集污水溝、籠子、料槽和案板等環(huán)境樣本；對于野鳥棲息地，如果能捕捉到野鳥，可采集野鳥的血液、咽喉/泄殖腔拭子以及新鮮糞便。如果無法捕捉野鳥，就采集新鮮的野鳥糞便。

1.4 方案的實施

根據(jù)方案開展調(diào)查、抽樣，樣本送實驗室開展檢測。血清學檢測采用血凝抑制（HI）試驗。檢測血清中H7亞型流感抗體的具體操作參照《高致病性禽流感診斷技術(shù)》（GB/T 18936—2003），HI抗體水平≥24，判定為陽性。病原學檢測采用通用RT-PCR或熒光RT-PCR檢測方法，對陽性樣品再用農(nóng)業(yè)部推薦的H7亞型流感RT-PCR或熒光RT-PCR進行確認。

1.5 數(shù)據(jù)的收集、整理和分析

收集調(diào)查問卷和實驗室檢測結(jié)果，進行統(tǒng)計分析，為緊急流行病學調(diào)查提供數(shù)據(jù)支持。

2 體會

2.1 獸醫(yī)流行病學技術(shù)的應用使調(diào)查工作信心倍增

近年來，隨著FAO、EU、OIE等對我國獸醫(yī)流行病學技術(shù)援助的增加，農(nóng)業(yè)部獸醫(yī)局對獸醫(yī)流行病學技術(shù)應用的推動速度在加快。在中國動物衛(wèi)生與流行病學中心的組織下，獸醫(yī)現(xiàn)場流行病學培訓班已經(jīng)成功舉辦了3期，第4期正在進行中，獸醫(yī)流行病學技術(shù)培訓的應用正在逐步展開。原有的缺乏獸醫(yī)流行病學技術(shù)支持的動物疫病監(jiān)測方案開始受到質(zhì)疑，因監(jiān)測目標不明確、抽樣設(shè)計無依據(jù)、樣本缺乏代表性等，更讓大家對監(jiān)測結(jié)果缺乏信心。本文介紹的H7N9流感緊急流行病學調(diào)查方案，在設(shè)計時采用了獸醫(yī)流行病學技術(shù)，不管是抽樣場數(shù)，還是場內(nèi)抽樣數(shù)量，都是按照流行病學抽樣公式進行計算的。這既保證了抽取的樣本量能滿足發(fā)現(xiàn)疫病的要求，也能保證樣本的代表性。通過這種方案的設(shè)計和實施，最終保證了調(diào)查結(jié)果較高的可信度，增強了調(diào)查工作的信心。

2.2 進行抽樣方案設(shè)計時應兼顧科學性和政策性

在進行抽樣方案設(shè)計時，既要考慮方案的科學性，保證設(shè)計方案的樣本量能實現(xiàn)調(diào)查目的，抽取的樣本能保證結(jié)果的準確性和精確性，使調(diào)查結(jié)果具有較高的可信度，又要兼顧國家政策及規(guī)定，保證樣本能滿足國家政策及規(guī)定的要求，不至于違背相關(guān)規(guī)定，在調(diào)查過程中出現(xiàn)政策性失誤。因此，抽樣數(shù)量應就高不就低，盡量同時滿足兩方面的要求。

2.3 在抽樣設(shè)計時預期流行率的確定相當重要

用發(fā)現(xiàn)疫病的方法進行樣本量計算時，需要考慮4個參數(shù)，即疾病預期流行率、置信水平、群體大小和檢測方法敏感性。其中，置信水平通常設(shè)定為95%，檢測方法敏感性根據(jù)方法來確定，是個常量，群體大小也是常量，不能確定的只有預期流行率，因此確定預期流行率顯得異常重要。如果設(shè)定過低，則需要抽取的樣本量就會很大；如果設(shè)定過高，抽樣量就會很少，可能檢測不到陽性結(jié)果。這是一對矛盾，需要用一定的知識和經(jīng)驗去平衡。對于禽流感非免疫群體，一旦病毒入侵，通常會有較高的感染率，因此在確定預期個體流行率時可以設(shè)置較高數(shù)值。但是，如果在人間剛發(fā)現(xiàn)有個別病例，那么在禽間通常不會有太高的感染率，在進行群體抽樣數(shù)量計算時，可將群體預期流行率設(shè)置在比較低的水平，以抽取更多的群體。然而國家目前正在推出H7N9流感的強制免疫。一旦對禽群進行了疫苗免疫，那么由于抗體的產(chǎn)生，該病毒即使入侵，也不會在免疫群體中造成較高的感染率，病毒在群間的傳播會受到阻隔。因此，一旦開始免疫，在開展H7N9流感調(diào)查時，預期群間流行率和群內(nèi)個體流行率將都要調(diào)整到更低水平，從而檢測到更多的群體和群內(nèi)個體，這樣才能真正發(fā)現(xiàn)病原感染。

[1] 王琦梅，劉社蘭，陳恩富. 人感染H7N9禽流感流行病學研究進展[J]. 中華預防醫(yī)學雜志，2017，51（2）：183-187.

[2] ALEXANDER D J. A review of avian inf l uenza in different bird species[J]. Vet Microbiol，2000，74（1/2）：3-13.

[3] OIE. WAHIS[DB/OL].[2017-05-31]. http://www. oie.int/wahis_2/public%5C.%5Ctemp%5Creports/en_ fup_0000023870_20170529_175922.pdf.

[4] 農(nóng)業(yè)部. 關(guān)于印發(fā)《動物H7N9禽流感緊急監(jiān)測方案》和《動物H7N9禽流感應急處置指南（試行）》的通知：農(nóng)醫(yī)發(fā)〔2013〕13號[A]. 北京：農(nóng)業(yè)部，2013.

[5] CANNON R M. Sense and sensitivity--designing surveys based on an imperfect test[J]. Prev Vet Med，2001，49（3/4）：141-163.

[6] 沈朝建，王幼明. 獸醫(yī)流行病學調(diào)查與監(jiān)測抽樣技術(shù)手冊[M]. 北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2013.

（責任編輯：朱迪國）

Development of Sampling Program for Finding out Virus in H7N9 Inf l uenza Emergency Investigation

Tian Zhaofang1，Li Chunlei1，Dang Ankun2，Lan Zouran2
（1. Center for Animal Disease Control of Yantai City，Yantai，Shandong 264000；2. Shandong Provincial Center for Animal Disease Control，Jinan，Shandong 250022）

For recognizing the infectious status of H7N9 inf l uenza in poultry，it is particularly important to develop a sampling program for fi nding out virus in emergency epidemiological investigation. There were several steps to develop the program，including determining the purpose of samping program design，determinating the research methods and sampling principles，designing the sampling programs（calculating the number of sampling farms，random selection of farms，calculation of the sampling poultries within the selected farms，etc.），the implementation of program，collection and analysis of the data and so on. The importance of veterinary epidemiology was fully realized in the process of investigation program design.

H7N9 inf l uenza；emergency investigation；sampling program；epidemiology

S851.3

：A

：1005-944X（2017）07-0025-04

10.3969/j.issn.1005-944X.2017.07.007

山東省科技發(fā)展計劃項目（2015GNC10027）

蘭鄒然