細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑Olomoucine對(duì)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)蛋白聚糖、短蛋白聚糖表達(dá)的抑制作用

易善清， 侯 超， 劉 珍， 武 衡

細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑Olomoucine對(duì)活化星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)蛋白聚糖、短蛋白聚糖表達(dá)的抑制作用

易善清1， 侯 超2， 劉 珍3， 武 衡1

目的 研究細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑Olomoucine對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后神經(jīng)蛋白聚糖(Neurocan)、短蛋白聚糖(Brevican)表達(dá)的抑制作用。方法 應(yīng)用睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)刺激法建立體外培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化模型，實(shí)驗(yàn)分3組：對(duì)照組、活化組與抑制組。對(duì)照組：正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞；活化組：星形膠質(zhì)細(xì)胞加入20 ng/ml睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(CNTF)處理24 h；抑制組：星形膠質(zhì)細(xì)胞用20 ng/ml睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子預(yù)處理24 h，加入100 μmol/L Olomoucine。應(yīng)用ELISA法檢測(cè)不同時(shí)間點(diǎn)(12 h、24 h、48 h)各組細(xì)胞上清液中Neurocan、Brevican含量變化，半定量RT-PCR檢測(cè)各組細(xì)胞GFAP mRNA及Neurocanm RNA、Brevican mRNA的表達(dá)變化。結(jié)果(1)活化組上清液中Neurocan、Brevican的含量在12 h、24 h、48 h隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01);抑制組上清液中Neurocan、Brevican含量隨著時(shí)間的延長(zhǎng)較活化組明顯降低，與對(duì)照組、活化組比較差異有顯著性(P<0.01)。(2)活化組細(xì)胞GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01);抑制組細(xì)胞GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表達(dá)均明顯下調(diào)，與活化組比較差異有顯著性(P<0.01)。結(jié)論 細(xì)胞周期依賴激酶抑制劑Olomoucine可抑制活化星形膠質(zhì)細(xì)胞神經(jīng)蛋白聚糖、短蛋白聚糖表達(dá)。

星形膠質(zhì)細(xì)胞； Olomoucine； 神經(jīng)蛋白聚糖； 短蛋白聚糖

星形膠質(zhì)細(xì)胞(astrocyte，Ast)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要組成部分之一，具有多種重要的生物學(xué)功能，在調(diào)節(jié)神經(jīng)元內(nèi)外離子平衡、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌、能量代謝、神經(jīng)遞質(zhì)攝取與滅活、突觸可塑性等方面具有重要的作用[1]。病理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細(xì)胞可由靜息狀態(tài)向活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞在早期可分泌大量的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子促進(jìn)軸突再生，清除細(xì)胞外的毒性物質(zhì)，保護(hù)神經(jīng)元免受損傷，有利于損傷后神經(jīng)元的功能恢復(fù)；在中晚期，其保護(hù)作用減弱，分泌對(duì)神經(jīng)元具有毒性作用的細(xì)胞因子，加劇炎癥損傷，特別是可以合成抑制軸突生長(zhǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)成分：硫酸軟骨素蛋白聚糖(chondroitin sulfate proteoglycans,CSPGs)類物質(zhì)。CSPGs是一類由一個(gè)核心蛋白和一條或多條共價(jià)氨基葡萄糖鏈(glycosaminogylycan,CAG)組成的大分子家族。CSPGs可分為Aggrecan家族[ 包括聚集蛋白聚糖、神經(jīng)蛋白聚糖(Neurocan)、短蛋白聚糖(Brevican等)] 、NG2、phosphacan等。研究表明，CSPGs是阻礙CNS損傷后再生的化學(xué)屏障的最主要成分，并且可形成膠質(zhì)瘢痕而抑制軸突再生。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞中CSPGs(特別是神經(jīng)蛋白聚糖、短蛋白聚糖)的表達(dá)迅速增加，并在損傷中心區(qū)至周邊區(qū)形成濃度梯度，導(dǎo)致神經(jīng)再生阻滯[2]，故CSPGs與軸突再生失敗有非常密切的關(guān)系。

細(xì)胞周期依賴激酶(cyclin dependent protein kinases,CDKs)抑制劑 Olomoucine可競(jìng)爭(zhēng)性與CDKs的ATP位點(diǎn)結(jié)合，從而使細(xì)胞停滯于G1/S期和G2/M期。本研究應(yīng)用睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(ciliary neurotrophic factor,CNTF)建立星形膠質(zhì)細(xì)胞活化模型[3]，觀察CDK抑制劑Olomoucine對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化增殖及CSPGs(主要是Neurocan、Brevican)表達(dá)的抑制效應(yīng)，以明確是否可以通過(guò)細(xì)胞周期調(diào)控達(dá)到抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化，并抑制阻礙軸突生長(zhǎng)的細(xì)胞外基質(zhì)成分Neurocan、Brevican的分泌，對(duì)以后進(jìn)一步明確其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后膠質(zhì)瘢痕形成中的作用具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng) 取2～3 d SD大鼠，75%乙醇浸泡消毒，取腦，剔除軟腦膜及血管后取大腦皮質(zhì)，PBS清洗3次，剪碎，加入0.125%的胰蛋白酶1 ml室溫下消化5 min，用培養(yǎng)液(含20%FBS的DMEM)終止消化，1200 rpm離心10 min，棄上清，加入培養(yǎng)液3～5 ml，200目篩網(wǎng)過(guò)濾，濾液以1000 rpm離心12 min，棄上清，加入培養(yǎng)液1～2 ml吹打成細(xì)胞懸液，接種于20 ml玻璃培養(yǎng)瓶中，37 ℃，用差速貼壁處理去除成纖維細(xì)胞，收集星形膠質(zhì)細(xì)胞，將傳至第3代的星形膠質(zhì)細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞活化模型的建立及Olomoucine干預(yù) 實(shí)驗(yàn)分3組：對(duì)照組、活化組、抑制組。對(duì)照組：正常培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞；活化組：加入20 ng/ml睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子預(yù)處理24 h建立星形膠質(zhì)細(xì)胞活化模型；抑制組：星形膠質(zhì)細(xì)胞用20 ng/ml睫狀神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子預(yù)處理24 h，加入100 μmol/L Olomoucine。于12 h、24 h、48 h檢測(cè)各組指標(biāo)變化(每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)取5孔細(xì)胞)。

1.3 ELISA法 用ELISA法檢測(cè)各組上清液中不同時(shí)間點(diǎn)Neurocan、Brevican的含量。

1.4 RT-PCR 用RT-PCR檢測(cè)各組GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表達(dá)變化，實(shí)驗(yàn)方法參照試劑盒。Neurocan基因特異性引物：上游：5’-CTGCTACCGCTACTTTGCT-3’，下游：5’-CTGGGAGAATCCTTCATCAC-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：457 bp；GFAP基因特異性引物：上游：5’-TAATGACTATCGCCGCCAACTG-3’，下游：5’-TTCGCCCTCCGCAATTTC-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：274 bp；Brevican基因特異性引物：上游：5’-CCTCGCTGATGACCTGAA-3’，下游：5’-CCGATAGGCTTCGTTTACC-3’；擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度：253 bp。按照Trizol 試劑盒說(shuō)明書(shū)提取細(xì)胞內(nèi)總RNA ，然后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。 PCR反應(yīng)體系：加入引物、cDNA、PCR預(yù)混液和DEPC水，擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性 5min，94 ℃變性 1 min,52 ℃退火1 min，72 ℃延伸 2 min，35 個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸10 min。最后行產(chǎn)物分析：每孔加取5 μl PCR擴(kuò)增產(chǎn)物， 加樣品緩沖液1 μl,用含溴化乙啶的1.0%的瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照并進(jìn)行電泳條帶分析，測(cè)定目的基因表達(dá)水平，所測(cè)指標(biāo)的mRNA與β-actin比值(相對(duì)表達(dá)量)作為觀察指標(biāo)，每組標(biāo)本PCR 重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 活化星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液中Neurocan、Brevican含量明顯增加，Olomoucine可抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞活化而減少上清液中Neurocan、Brevican含量(見(jiàn)圖1、圖2)。3組細(xì)胞上清液中均可檢測(cè)到Neurocan、Brevican，活化組上清液中Neurocan、Brevican的含量在12 h、24 h、48 h隨著時(shí)間的延長(zhǎng)逐漸增加，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01)；抑制組上清液中Neurocan、Brevican含量隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下降，在24 h、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)與活化組比較差異有顯著性(P<0.01)。

2.2 活化星形膠質(zhì)細(xì)胞上清液中GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表達(dá)明顯增加，Olomoucine可抑制活化星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA的表達(dá)(見(jiàn)圖3～圖5)。3組星形膠質(zhì)細(xì)胞中均可見(jiàn)GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表達(dá)，對(duì)照組GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)增加不明顯；活化組GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)，與對(duì)照組比較差異有顯著性(P<0.01)。抑制組GFAP mRNA、Neurocan mRNA、Brevican mRNA的表達(dá)隨時(shí)間延長(zhǎng)逐漸下調(diào)，在24 h、48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)與活化組比較差異有顯著性(P<0.01)。

與對(duì)照組比較*P<0.01；與活化組比較#P<0.01;與活化組12 h比較△P<0.01

圖1 各組不同時(shí)間點(diǎn)上清液中Neurocan含量比較

與對(duì)照組比較*P<0.01；與活化組比較#P<0.01;與活化組12 h比較△P<0.01

圖2 各組不同時(shí)間點(diǎn)上清液中Brevican含量比較

與對(duì)照組比較*P<0.01；與活化組比較#P<0.01;與活化組12 h比較△P<0.01

圖3 各組不同時(shí)間點(diǎn)GFAP mRNA表達(dá)

與對(duì)照組比較*P<0.01；與活化組比較#P<0.01;與活化組12 h比較△P<0.01

圖4 各組不同時(shí)間點(diǎn)Neurocan mRNA表達(dá)

與對(duì)照組比較*P<0.01；與活化組比較#P<0.01;與活化組12 h比較△P<0.01

圖5 各組不同時(shí)間點(diǎn)Brevican mRNA表達(dá)

3 討 論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，星形膠質(zhì)細(xì)胞有著復(fù)雜而重要的功能，如：突觸的形成和傳遞、維持離子和體液的平衡等。中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，星形膠質(zhì)細(xì)胞增生活化，活化后的星形膠質(zhì)細(xì)胞具有雙重作用。一方面，它可刺激多種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的釋放而保護(hù)神經(jīng)元；另一方面，它又可釋放許多炎癥因子，引起神經(jīng)元的大量死亡。同時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)度增生可促使膠質(zhì)瘢痕的形成，嚴(yán)重的阻礙了神經(jīng)修復(fù)及軸突的再生[4]。在星形膠質(zhì)細(xì)胞形成膠質(zhì)瘢痕的過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)成分-CSPGs起著重要的作用。

研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，CSPGs在病灶周圍的表達(dá)明顯上調(diào)，在細(xì)胞基質(zhì)中形成阻礙神經(jīng)再生的抑制性環(huán)境，當(dāng)再生軸突到達(dá)CSPGs表達(dá)豐富的損傷區(qū)時(shí)就停止進(jìn)一步的延伸。CSPGs由核心蛋白和硫酸軟骨素(chondr oitin sulfate,CS)、蛋白聚糖 (proteoglycans,PGs)共價(jià)連接在蛋白質(zhì)上組成的一類蛋白聚糖，其中硫酸軟骨素-E是阻止軸突再生的關(guān)鍵分子[5]。目前已證明，Neurocan、Brevican、磷酸蛋白聚糖(phos-sphacan)是腦損傷后形成的膠質(zhì)瘢痕中表達(dá)明顯上調(diào)的CSPGs，與抑制神經(jīng)再生的作用密切相關(guān)。

Neurocan是由163kDa的核心蛋白、3條CS鏈和一定量的O-連接寡糖鏈組成，通過(guò)與細(xì)胞粘附分子、其他CSPGs分子及細(xì)胞外基質(zhì)分子，抑制神經(jīng)軸突的外生長(zhǎng)和突觸的形成[6]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后，活化的星形膠質(zhì)細(xì)胞可分泌大量的Neurocan到細(xì)胞外基質(zhì)中，并成為膠質(zhì)瘢痕的重要組成成分，阻礙神經(jīng)修復(fù)與重建[7]。本實(shí)驗(yàn)中我們觀察到，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后，上清液中Neurocan的含量明顯增加，RT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)GFAP mRNA 和Neurocan mRNA表達(dá)幾乎同時(shí)出現(xiàn)明顯增強(qiáng)，時(shí)間上表現(xiàn)高度重疊，提示Neurocan可能由活化星形膠質(zhì)細(xì)胞合成分泌。

Brevican是所有CSPGs中長(zhǎng)度最短的，它阻止過(guò)多的樹(shù)突和軸突往損傷區(qū)域延伸，是形成膠質(zhì)瘢痕抑制軸突生長(zhǎng)的重要成分[8]。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后，上清液中Brevican含量隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸增高，Brevicanm RNA隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，表達(dá)亦逐漸上調(diào)，表明星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后Brevican表達(dá)增多。

從以上實(shí)驗(yàn)我們可以推測(cè)，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后分泌較多的Neurocan、Brevican，而Neurocan、Brevican作為CSPGs的重要成分而參與膠質(zhì)瘢痕的形成，從而阻止軸突的生長(zhǎng)。因此，抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖在神經(jīng)損傷后的再生修復(fù)中具有重要的意義。

眾所周知，細(xì)胞增殖是通過(guò)細(xì)胞周期來(lái)實(shí)現(xiàn)的，而周期素蛋白(cyclines)和周期素依賴性蛋白激酶(cyclindependent kinases,CDK)是細(xì)胞周期調(diào)控的關(guān)鍵分子。Olomoucine是一種CDK 抑制劑，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性抑制CDK的ATP結(jié)合位點(diǎn)來(lái)抑制CDK1、CDK2、及CDK5等酶的活性，使細(xì)胞周期停滯于G1/S或G2/M轉(zhuǎn)折點(diǎn)，使細(xì)胞DNA合成及細(xì)胞分裂被阻滯，以抑制細(xì)胞的分裂增殖[9]。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)Olomoucine作用于活化星形膠質(zhì)細(xì)胞后，可抑制GFAP mRNA的表達(dá)；同時(shí)還發(fā)現(xiàn)，活化星形膠質(zhì)細(xì)胞中加入Olomoucine干預(yù)后，Neurocan、Brevican的分泌隨著時(shí)間延長(zhǎng)逐漸減少，兩者mRNA的表達(dá)亦逐漸下調(diào)。表明Olomoucine能明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的進(jìn)一步活化，從而使Neurocan、Brevican表達(dá)下調(diào)。

本實(shí)驗(yàn)研究表明，星形膠質(zhì)細(xì)胞活化后，Neurocan、Brevican的表達(dá)增高，Olomoucine通過(guò)抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化，而下調(diào)Neurocan mRNA、Brevican mRNA的表達(dá)，降低Neurocan、Brevican的分泌。該實(shí)驗(yàn)可為神經(jīng)再生和功能恢復(fù)的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。

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The expression of brevican and neurocan in the activity astrocytes and Inhibition effect of Olomoucine

YIShanqing,HOUChao,LIUZheng,etal.

(DepartmentofNeurology,AffiliatedNo1Hosipital,NanhuaUniversity,Hengyang421001,China)

Objective To study the inhibitory effect of cell cycle-dependent kinase inhibitor Olomoucine on the expression of neuronal glycoprotein (Neurocan) and short protein oligosaccharides (Brevican) after activation of astrocytes.Methods To establish the activation model of astrocytes cultured in vitro by using ciliary neurotrophic factor (CNTF) stimulation method.The experiment were divided into three groups:the control group,the activation group and the suppression group.Astrocytes in the control group were cultured generally;the activation group were co-cultuted with 20 ng/ml CNTF,and in the suppression group were incubated 100 μmol/L olomoucine.Three groups of cells by different conditions deal with 12,24 and 48 hours later.The content of Neurocan and Brevican were examined by sites sandwich enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).RT-PCR was used to detect the expression of glial fibrillary acidic protein (GFAP) mRNA,Neurocanm RNA and Brevicanm RNA.Results (1)The content of Neurocan and Brevican in the supernatant of activation group was gradually increased with the duration of 12,24 and 48 h,and the difference was significant compared with the control group (P<0.01).The content of Neurocan and Brevican in inhibition group was significantly decreased with the duration of the activation group,and the difference was significant compared with control group and activation group(P<0.01).(2)The expression of GFAP mRNA,Neurocan mRNA and Brevican mRNA in activation group was significantly increased,and the difference was significant compared with the control group(P<0.01).The expression of GFAP mRNA,Neurocan mRNA and Brevican mRNA decreased markedly,and the difference was significantly compared with activation group (P<0.01).Conclusions Cell cycle-dependent kinase inhibitor Olomoucine inhibits the expression of activated stellate glial cell nerve protein glycoprotein and short protein.

Astrocytes; Olomoucine; Neurocan; Brevican

1003-2754(2017)06-0504-04

2017-02-13；

2017-05-25

衡陽(yáng)市科技局(2015KJ43)

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，湖南 衡陽(yáng) 421001；2.湖南省第二人民醫(yī)院，湖南 長(zhǎng)沙 410001；3.南華大學(xué)機(jī)能實(shí)驗(yàn)室，湖南 衡陽(yáng) 421001)

武 衡，E-mail:wh720108@sina.com

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