枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產聚-γ-谷氨酸的條件優(yōu)化

武國慧，張蕾，高德才，李鵬程，張鷹，石元亮1，，*

（1.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所，遼寧沈陽110016；2.中國科學院大學，北京100049；3.遼寧中科生物工程有限公司，遼寧本溪117004）

枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產聚-γ-谷氨酸的條件優(yōu)化

武國慧1，2，張蕾1，2，高德才1，2，李鵬程3，張鷹3，石元亮1，3，*

（1.中國科學院沈陽應用生態(tài)研究所，遼寧沈陽110016；2.中國科學院大學，北京100049；3.遼寧中科生物工程有限公司，遼寧本溪117004）

為提高聚-γ-谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）產量，降低其生產成本，利用枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），采用單因素試驗及正交試驗優(yōu)化法，探究培養(yǎng)基組分及發(fā)酵條件對γ-PGA發(fā)酵產量的影響。結果表明：最佳培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件為：蔗糖5%，谷氨酸鈉6%，氯化銨0.3%，磷酸氫二鉀2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸錳0.003%，pH 7.0，接種量為3%，發(fā)酵溫度33℃，發(fā)酵時間48 h。與未優(yōu)化前γ-PGA產量（15.8 g/L）相比，經優(yōu)化后的產量達20.8 g/L，提高了31.65%。

聚-γ-谷氨酸；液體發(fā)酵；微生物合成；培養(yǎng)基；正交設計

聚-γ-谷氨酸（poly-γ-glutamic acid，γ-PGA）是微生物（主要為芽孢桿菌類）發(fā)酵的產物，由L-谷氨酸（L-Glu）、D-谷氨酸（D-Glu）單體通過 γ-酰胺鍵聚合而成的一種陰離子高分子型聚合物[1]。它的基本碳骨架分子呈直鏈型，主鏈上存在著大量的氫鍵、肽鍵和游離羧基，使γ-PGA具有水溶性、生物相容性和生物降解性能。另外，游離羧基使γ-PGA具有大量的活性位點，可發(fā)生交聯、螯合、衍生化等反應[2]，便于材料的功能化，易與其它材料聚合形成新型復合材料，使γ-PGA在醫(yī)藥、食品及化妝品、污水處理和農業(yè)等領域顯示出十分廣闊的應用前景[3]。然而，由于γ-PGA發(fā)酵產量低、成本高，限制了其廣泛的應用。因此，研究如何提高γ-PGA產量具有非常重要的意義。

目前，γ-PGA的生產方法主要有化學合成法、直接提取法、酶轉化法和微生物發(fā)酵法[4]。與其它方法相比，微生物發(fā)酵法具有條件溫和、周期短、γ-PGA產量高且分子量分布合適等優(yōu)點[5]，已經成為國內外研究的熱點。美國、日本、韓國等在γ-PGA合成與應用方面進行了很多研究，尤其日本味之素和明治制果公司，成功研發(fā)并實現了商業(yè)化生產。國內對γ-PGA的研究正處于興起階段，其中臺灣味丹公司已成功實現了工業(yè)化，華中農業(yè)大學、南京工業(yè)大學等高校及研究所也相繼開展了發(fā)酵和應用方面的研究[6-7]。

然而，采用微生物發(fā)酵法生產γ-PGA時，由于菌株代謝途徑復雜，至今仍處推測之中，尚欠定論，調節(jié)方式也多樣化，從而給提高γ-PGA產量帶來了較大的困難，使生產成本較高，阻礙了工業(yè)化生產。因此，本試驗采用單因素試驗并結合正交試驗優(yōu)化法，對該枯草芽孢桿菌的生產條件進行優(yōu)化，以期提高γ-PGA產量和生產強度，降低其生產成本，為工業(yè)化生產提供理論基礎和數據支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 菌種

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）：土壤養(yǎng)分高效利用工程研究室保存。

1.1.2 培養(yǎng)基

種子培養(yǎng)基：葡萄糖2%，谷氨酸鈉1%，蛋白胨0.5%，磷酸氫二鉀0.2%，pH 7.0；發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖5%，谷氨酸鈉4%，硫酸銨0.5%，磷酸氫二鉀2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸錳0.003%，pH 7.0。

1.2 設計與方法

1.2.1 菌種培養(yǎng)方法

種子培養(yǎng)：250 mL三角瓶內裝50 mL種子培養(yǎng)基，接種甘油管種子100 μL，溫度30℃，轉速220 r/min，搖床振蕩培養(yǎng)20 h，得發(fā)酵種子。

發(fā)酵培養(yǎng)：按5%的接種量將種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，250 mL三角瓶裝液量為50 mL，30℃，220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h。

1.2.2 搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化方法的設計

分別考察不同接種量（1%、3%、5%、7%、9%）、初始 pH 值（5.0、6.0、7.0、8.0、9.0）、發(fā)酵溫度（27、30、33、37、40 ℃）和發(fā)酵時間（24、36、48、60、72 h）對枯草芽孢桿菌生產γ-PGA的影響；另外，對碳源（葡萄糖、蔗糖、檸檬酸、糖蜜、味精渣）和氮源（硫酸銨、氯化銨、酵母膏、蛋白胨、玉米漿）種類及濃度進行了篩選，進而對蔗糖、氯化銨、谷氨酸鈉和磷酸氫二鉀組分濃度進行了正交優(yōu)化。搖瓶試驗均采用250 mL三角瓶，裝液量為50 mL，30℃下220 r/min搖床振蕩培養(yǎng)48 h。重復3次。

1.2.3 分析方法

細菌濃度的測定：發(fā)酵液稀釋50倍，以蒸餾水作參比，可見光分光光度計660 nm下測定吸光度。谷氨酸含量的測定：SBA-40E型生物傳感儀。γ-PGA的測定[8]：首先對發(fā)酵液離心，取上清液測谷氨酸單體的含量，然后對上清液用6 mol/L HCl，100℃水解4 h，再測定谷氨酸總量，2次測定的谷氨酸含量之差為聚谷氨酸含量。

1.3 數據處理與統(tǒng)計檢驗

所有試驗數據均采用Microsoft Excel 2010進行整理，不同處理之間差異采用SPSS19.0軟件進行單因素方差分析（one-way ANOVA），Duncan法進行顯著性檢驗（P＜0.05），所有結果的數據均以平均值±標準誤的形式來表達，文中圖均采用Origin 8.6軟件繪制。

2 結果與分析

2.1 培養(yǎng)基組分對γ-PGA發(fā)酵產量的影響

2.1.1 碳源種類對γ-PGA發(fā)酵產量的影響

不同碳源對γ-PGA產量的影響見圖1。

圖1 不同碳源對γ-PGA產量的影響Fig.1 Effects of different carbon sources on γ-PGA yield

由圖1可知，單一碳源菌體量的大小順序為蔗糖≈葡萄糖≈糖蜜＞味精渣＞檸檬酸，統(tǒng)計結果表明，蔗糖、葡萄糖和糖蜜的菌體量無顯著差異，并均顯著高于味精渣和檸檬酸（P＜0.05）；γ-PGA發(fā)酵產量大小順序為蔗糖（16.2 g/L）＞葡萄糖（13.1 g/L）＞糖蜜（10.2 g/L）＞味精渣（2.6 g/L）＞檸檬酸（0.3 g/L），t檢驗結果表明，兩兩之間均達到顯著水平（P＜0.05）。表明蔗糖作為碳源，γ-PGA發(fā)酵產量最高，葡萄糖次之，檸檬酸的γ-PGA發(fā)酵產量最低，與前人研究結果一致[9]。而Goto等[10]發(fā)現Bacillus subtilis IF03335以檸檬酸為單一碳源時卻能夠獲得較高的γ-PGA產量，與本試驗結果相反，這可能是由于本試驗供試菌種缺少糖合成循環(huán)過程中的某種酶所造成的[11]。

2.1.2 氮源種類對γ-PGA發(fā)酵產量的影響

不同氮源對γ-PGA產量的影響見圖2。

圖2 不同氮源對γ-PGA產量的影響Fig.2 Effects of different nitrogen sources on γ-PGA yield

由圖2可得，不同氮源菌體量大小順序：玉米漿＞蛋白胨＞硫酸銨＞酵母膏＞氯化銨，統(tǒng)計結果表明，玉米漿的菌體量均顯著高于其它氮源的菌體量（P＜0.05）；γ-PGA發(fā)酵產量大小順序為氯化銨（19.7 g/L）＞硫酸銨（18.0 g/L）＞蛋白胨（17.1 g/L）=酵母膏（17.1 g/L）＞玉米漿（10.2 g/L），統(tǒng)計結果表明，以氯化銨為氮源的γ-PGA發(fā)酵產量顯著高于硫酸銨（P＜0.05），且二者均顯著高于以蛋白胨、酵母膏和玉米漿為氮源的γ-PGA發(fā)酵產量（P＜0.05），由此可得，以無機氮（硫酸銨和氯化銨）作為氮源時，γ-PGA發(fā)酵產量較高，且無機氮中以氯化銨作為氮源時，γ-PGA發(fā)酵的產量最高，與前人研究結果一致。例如，Ito等[12]以NH4Cl作為Bacillus subtilis TAM-4發(fā)酵氮源時，也得到較高的γ-PGA產量。同時，與Jung等[13]研究中的高產菌株Bacillus sp.RKY3 KCTC 10412BP以蛋白胨為氮源相比，氯化銨成本較低，更適合工業(yè)化生產。

2.1.3 蔗糖、氯化銨、谷氨酸鈉、磷酸氫二鉀濃度對γ-PGA發(fā)酵產量的影響

蔗糖、氯化銨、谷氨酸鈉、磷酸氫二鉀濃度對γ-PGA產量的影響見圖3。

由圖3可知，蔗糖、氯化銨、谷氨酸鈉、磷酸氫二鉀濃度分別達到5%、0.5%、4%、2%時，γ-PGA發(fā)酵產量達到最大值，分別為 18.4、17.3、18.5、17.7 g/L。在蔗糖濃度達到5%后，進一步增加蔗糖濃度后，γ-PGA的產量反而降低，這可能是由于過高的蔗糖濃度導致了發(fā)酵液滲透壓增加，使菌體生長受到抑制，阻礙了γ-PGA的合成，因此，本試驗蔗糖的最佳濃度為5%。氯化銨的最佳濃度為0.5%，過高或過低的氯化銨濃度對γ-PGA的合成均不利，因此，本試驗確定0.5%的氯化銨濃度更有利于γ-PGA產物的積累。谷氨酸鈉的最佳濃度為4%，而較高谷氨酸鈉反而不利γ-PGA的合成，這表明添加的谷氨酸鈉并沒有全部用來合成γ-PGA，可能更多的是作為一種誘導物[11]，以激活γ-PGA合成的一系列酶，促使枯草芽孢桿菌合成γ-PGA。磷酸氫二鉀的最佳濃度為2%，過高或過低的磷酸氫二鉀濃度反而使γ-PGA的產量降低。

圖3 蔗糖（a）、氯化銨（b）、谷氨酸鈉（c）、磷酸氫二鉀（d）濃度對 γ-PGA產量的影響Fig.3 Effects of different concentration of sucrose（a），NH4Cl（b），sodium glutamate（c）and K2HPO4（d）on γ-PGA yield

2.2 培養(yǎng)基組分正交試驗結果

在單因素試驗的基礎上，綜合試驗結果，以γ-PGA產量為指標，選取蔗糖、氯化銨、谷氨酸鈉、磷酸氫二鉀4個因素為考察因素，每個因素設置3個水平，安排四因素三水平正交方案。因素水平表見表1。

按照確定的因素水平，參照L9（34）試驗設計，設置3組平行試驗以估計試驗誤差。極差分析結果顯示：谷氨酸鈉是影響γ-PGA產量的最重要因素，余者依次是氯化銨、蔗糖、磷酸氫二鉀（表2）。

通過比較表2各因素各水平的均值，得出每個因素的最佳水平分別是：蔗糖選擇水平2，即5%；氯化銨選擇水平1，即0.3%；谷氨酸鈉選擇水平3，即6%；磷酸氫二鉀選擇水平2，即2.0%。

表1 正交設計因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal design

表2 正交試驗結果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal design

2.3 培養(yǎng)條件對γ-PGA發(fā)酵產量的影響

2.3.1 不同接種量、初始pH、溫度對γ-PGA發(fā)酵產量的影響

接種量、初始pH、培養(yǎng)溫度對γ-PGA產量的影響見圖4。

圖4表明，當接種量、初始pH和培養(yǎng)溫度分別達到3%、7和33℃時，γ-PGA發(fā)酵產量達到最大值，分別為19.6、15.4、19.8 g/L。采用上述試驗確定的最佳發(fā)酵條件，將培養(yǎng)20 h的種子培養(yǎng)液，分別以1%、3%、5%、7%、9%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基，發(fā)酵48 h后分別測定γ-PGA的產量，得出最佳接種量為3%，過高或者過低的接種量，γ-PGA的產量反而較低，主要原因是較低的接種量會延長菌體生長的延遲期，導致發(fā)酵周期長；過高的接種量會使菌體消耗大量底物生長過快，從而不利于產物的積累[14]。

采用上述試驗確定的最佳發(fā)酵條件，將pH分別調至 5.0、6.0、7.0、8.0、9.0，按 3%接種量將種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h，測定γ-PGA發(fā)酵產量，結果表明，pH在6.0～8.0時，γ-PGA產量較高，與前人研究結果不盡一致[15-17]，原因是不同菌種所需的最適pH不同，因此應根據不同的菌種選取最適的pH。

采用上述試驗確定的最佳發(fā)酵條件，按3%接種量將種子液接入pH為7.0的發(fā)酵培養(yǎng)基，分別在27、30、33、37、40℃下培養(yǎng) 48 h，測定 γ-PGA 的產量，得出最佳溫度為33℃，與前人研究結果不一致[18]，原因是不同菌種的最適溫度不同，說明該菌種在33℃下菌體生長過程中起作用的酶系和γ-PGA合成酶系都很穩(wěn)定且活力較高[19]，使γ-PGA的產量最高。

2.3.2 發(fā)酵時間對γ-PGA發(fā)酵產量的影響

發(fā)酵時間對γ-PGA產量的影響見圖5。

圖4 接種量（a）、初始pH（b）、培養(yǎng)溫度（c）對 γ-PGA產量的影響Fig.4 Effects of inoculum amount（a），initial pH（b）and temperature（c）on γ-PGA yield

圖5 發(fā)酵時間對γ-PGA產量的影響Fig.5 Effects of fermentation time on γ-PGA yield

由圖5可知，發(fā)酵時間達到48 h時，γ-PGA的產量達到最大值（18.6 g/L）。Ju等[20]采用菌株B.subtilis MJ80的發(fā)酵周期為3 d，本試驗采用枯草芽孢桿菌的發(fā)酵周期短，適合工業(yè)化生產需要。

2.4 驗證試驗結果

上述單因素及正交試驗結果表明，適于該枯草芽孢桿菌的搖瓶發(fā)酵生產γ-PGA的最優(yōu)組合為：蔗糖5%，谷氨酸鈉6%，氯化銨0.3%，磷酸氫二鉀2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸錳0.003%，pH 7.0，接種量為3%，發(fā)酵溫度33℃，發(fā)酵時間48 h。為檢驗正交優(yōu)化試驗所得結果的可靠性，采用上述優(yōu)化條件進行了3組枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產γ-PGA的平行試驗，結果表明，γ-PGA的平均產量為20.8 g/L，比優(yōu)化前γ-PGA的產量（15.8 g/L）顯著提高了31.65%（P＜0.05）。

3 結論

通過對枯草芽孢桿菌發(fā)酵生產γ-PGA的發(fā)酵條件進行單因素及正交試驗優(yōu)化，篩選出發(fā)酵培養(yǎng)基組分和培養(yǎng)條件的最優(yōu)組合：蔗糖5%，谷氨酸鈉6%，氯化銨0.3%，磷酸氫二鉀2%，磷酸二氫鉀0.1%，硫酸錳0.003%，pH 7.0，接種量為3%，33℃下發(fā)酵培養(yǎng)48 h。在此優(yōu)化條件下，γ-PGA產量達到20.8 g/L，比優(yōu)化前提高了31.65%。

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Optimization of Fermentation Conditions of Poly-γ-glutamic Acid Production by Bacillus subtilis

WU Guo-hui1，2，ZHANG Lei1，2，GAO De-cai1，2，LI Peng-cheng3，ZHANG Ying3，SHI Yuan-liang1，3，*
（1.Institute of Applied Ecology，Chinese Academy of Sciences，Shenyang 110016，Liaoning，China；2.University of Chinese Academy of Sciences，Beijing 100049，China；3.Liaoning Zhongke Biological Engineering CO.，LTD.，Benxi 117004，Liaoning，China）

To improve the production and reduce the cost of γ-PGA，a fermentation study with Bacillus subtilis was conducted to explore the effects of medium compositions and culture conditions on γ-PGA production based on single-factor experiment and orthogonal design.The results showed that the optimized cultivation conditions and medium composition were as follows：sucrose 5%；sodium glutamate 6%；NH4Cl 0.3%；K2HPO42%；KH2PO40.1%；MnSO40.003%；initial pH 7.0；inoculum amount 3%；temperature 33℃；fermentation time 48 h.In this study，high γ-PGA productivity（20.8 g/L）was obtained under the optimal conditions，31.65%higher than the previous conditions（15.8 g/L）.

poly-γ-glutamic acid；liquid fermentation；biosynthesis；medium；orthogonal design

2016-08-26

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.037

“十二五”國家科技支撐項目“濱海鹽堿地作物穩(wěn)定性肥料研制與施用技術研究”（2013BAD05B04）

武國慧（1990—），女（漢），碩士研究生，研究方向：微生物工程。

*通信作者：石元亮，研究員，博士，研究方向：土壤微域生態(tài)系統(tǒng)及其調控研究。