高效液相色譜法檢測運(yùn)動(dòng)飲料中的L-肉堿

周文清

（景德鎮(zhèn)陶瓷大學(xué)，江西景德鎮(zhèn)333000）

高效液相色譜法檢測運(yùn)動(dòng)飲料中的L-肉堿

周文清

（景德鎮(zhèn)陶瓷大學(xué)，江西景德鎮(zhèn)333000）

建立一種快速、有效的高效液相色譜法測定運(yùn)動(dòng)飲料中L-肉堿的方法。樣品經(jīng)1.0 mmol/L鹽酸提取后，采用MCX固相萃取小柱進(jìn)行凈化和富集。采用RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）分離，以乙腈∶辛烷磺酸鈉（50 mmol/L）=25∶75（體積比）作為流動(dòng)相，用PDA檢測器檢測，外標(biāo)法峰面積定量。結(jié)果表明，L-肉堿標(biāo)液在1.0 μg/mL～20.0 μg/mL濃度范圍內(nèi)線性良好，相關(guān)系數(shù)r2為0.999，檢出限為0.1 mg/kg，定量限為0.3 mg/kg，加標(biāo)回收率達(dá)到82.3%～84.1%。

高效液相色譜；運(yùn)動(dòng)飲料；L-肉堿

肉堿的化學(xué)結(jié)構(gòu)中有左旋（L-）和右旋（O-）兩種旋光異構(gòu)體，而自然界中只存在L-肉堿，且只有L-肉堿有營養(yǎng)功效。研究表明L-肉堿可以有效防止運(yùn)動(dòng)后血液中乳酸濃度升高，提高人體的耐受力和抵抗力[1-3]。目前許多國家的運(yùn)動(dòng)員用L-肉堿作為提高體能的營養(yǎng)補(bǔ)充劑，體育運(yùn)動(dòng)后人體肌肉組織中的游離肉堿濃度下降20%左右，可以通過補(bǔ)充外源L-肉堿得到改善，從而促進(jìn)體內(nèi)脂肪氧化產(chǎn)能，提高運(yùn)動(dòng)成績。所以添加了L-肉堿為生理活性成分的運(yùn)動(dòng)飲料，也開始成為運(yùn)動(dòng)飲料的一個(gè)賣點(diǎn)，開始悄然流行起來。但是目前還沒有針對運(yùn)動(dòng)飲料中L-肉堿的檢查方法，所以本試驗(yàn)針對運(yùn)動(dòng)飲料中L-肉堿開發(fā)一種快速有效的檢測方法。

目前，針對L-肉堿的檢測方法主要有酶法測定法、毛細(xì)管電泳色譜法、高效液相色譜法等[4-10]。酶法測定法的原理是加入的DTNB試劑能與L-肉堿中的化學(xué)鍵發(fā)生反應(yīng)，生成4-硝基苯酚化合物，它在412 mn處有強(qiáng)烈的吸收峰，可以據(jù)此來定量L-肉堿的含量，但是此法易收到其溶液內(nèi)的硫醇物質(zhì)干擾，影響結(jié)果的準(zhǔn)確性。高效液相色譜法為現(xiàn)在常用的檢出方法，但是在前處理的步驟上繁瑣，費(fèi)時(shí)，試驗(yàn)成本較大。本試驗(yàn)在原有的高效液相色譜法的基礎(chǔ)上，對前處理步驟進(jìn)行改進(jìn)，改用固相萃取法對L-肉堿進(jìn)行樣品的富集和凈化，并對檢測條件進(jìn)行優(yōu)化，使得對運(yùn)動(dòng)飲料中L-肉堿的檢測能夠做到快速、準(zhǔn)確的目的，適用于日常快捷的檢測。肉堿的結(jié)構(gòu)圖見圖1。

圖1 肉堿的結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of carnitine

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

2695型號高效液相色譜系統(tǒng)，配2998型號PDA檢測器：Waters；L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品：國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心；甲醇、乙腈為色譜純；MCX、WCX、HLB固相萃取小柱：規(guī)格 3 cc，250 mg。

1.2 樣品來源

樣品為市場上銷售的標(biāo)稱含有L-肉堿的運(yùn)動(dòng)飲料。

1.3 色譜條件

色譜柱：RP C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：20 μL。

柱溫：30℃。

1.4 方法

1.4.1 色譜條件的優(yōu)化

固定流動(dòng)相流速1.0 mL/min，配制不同體系的流動(dòng)相體系，甲醇/磷酸二氫鉀體系、甲醇/辛烷磺酸鈉體系、乙腈/磷酸二氫鉀體系和乙腈/辛烷磺酸鈉體系，考察4種流動(dòng)相對L-肉堿色譜行為的影響；并優(yōu)化合適的流動(dòng)相pH值，使得目標(biāo)峰的出峰時(shí)間合適，峰形尖銳、對稱。

1.4.2 檢測波長的選擇

本試驗(yàn)采用PDA檢測器進(jìn)行全波長掃描（掃描范圍190 nm～400 nm），根據(jù)L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品的響應(yīng)值，選擇比較合適的檢測波長。

1.4.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

稱取相應(yīng)質(zhì)量的L-肉堿標(biāo)準(zhǔn)品，配制成濃度為1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、20.0 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行儀器分析，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

根據(jù)L-肉堿有較好的水溶性和醇溶性的特點(diǎn)，本試驗(yàn)比較甲醇、乙醇、1.0 mmol/L鹽酸溶液等3種提取溶液對L-肉堿的提取效果。

選擇較優(yōu)的提取溶液后，比較常用的WCX固相萃取柱、HLB固相萃取柱以及MCX固相萃取柱等3種固相萃取柱對樣品富集凈化的效果。

1.4.5 加標(biāo)回收試驗(yàn)及樣品測定

以市售未添加L-肉堿的運(yùn)動(dòng)飲料為空白基質(zhì)，加入標(biāo)準(zhǔn)溶液，選擇優(yōu)化后的前處理?xiàng)l件操作，過MCX固相萃取柱，上機(jī)檢測，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

參考相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)和文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)不同標(biāo)準(zhǔn)文獻(xiàn)檢測L-肉堿的流動(dòng)相體系不同，主要分為四大類流動(dòng)相體系：甲醇/磷酸二氫鉀體系、甲醇/辛烷磺酸鈉體系、乙腈/磷酸二氫鉀體系和乙腈/辛烷磺酸鈉體系。為了了解這些流動(dòng)相對L-肉堿色譜行為的影響，固定流動(dòng)相洗脫速度，配制不同體系的流動(dòng)相Ⅰ：甲醇-磷酸二氫鉀緩沖（50 mmol/L）（體積比為25∶75）；流動(dòng)相Ⅱ：甲醇-辛烷磺酸鈉（50 mmol/L，pH）（體積比為 25∶75）；流動(dòng)相Ⅲ：乙腈-磷酸二氫鉀緩沖（50 mmol/L）（體積比為25 ∶75），流動(dòng)相Ⅳ：乙腈-辛烷磺酸鈉（50 mmol/L，pH）（體積比為25∶75），考察流動(dòng)相對L-肉堿色譜行為的影響。

在確定好流動(dòng)相體系后，要進(jìn)一步優(yōu)化流動(dòng)相體系的pH值，使目標(biāo)峰的出峰峰形尖銳、對稱。考慮到L-肉堿是兩性化合物，在酸性流動(dòng)相溶液中，羧基電離被抑制，而季銨基團(tuán)帶正電荷，與流動(dòng)相中的辛烷磺酸根陰離子形成離子對，會(huì)在C18柱上有保留。本試驗(yàn)以磷酸來調(diào)節(jié)流動(dòng)相的pH值，考察pH值與目標(biāo)峰保留時(shí)間的關(guān)系。L-肉堿的色譜圖見圖2。

結(jié)果表明：甲醇、乙腈在分離和保留L-肉堿上并沒有明顯差別，考慮到乙腈洗脫能力更強(qiáng)，選用乙腈做為流動(dòng)相體系之一。乙腈/磷酸二氫鉀體系與乙腈/辛烷磺酸鈉體系相比，乙腈/辛烷磺酸鈉體系能更好的將樣品中的雜質(zhì)峰分開。

當(dāng)乙腈/辛烷磺酸鈉流動(dòng)相pH值在2.5到3.5范圍內(nèi)，降低流動(dòng)相的pH值，峰形改善并延長保留時(shí)間，當(dāng)pH值大于3.3時(shí)，色譜峰呈較為明顯的前延峰。綜合考慮分離度、柱子耐受性、保留時(shí)間等因素，選擇流動(dòng)相體系pH3.0時(shí)，目標(biāo)峰在色譜柱上能得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時(shí)間合適。

2.2 檢測波長的選擇

本試驗(yàn)采用PDA檢測器對L-肉堿進(jìn)行全波長掃描（范圍190 nm～400 nm）。L-肉堿的全波長掃描圖見圖3。

圖2 L-肉堿色譜圖Fig.2 The chromatograms of L-carnitine

圖3 L-肉堿的全波長掃描圖Fig.3 Full wavelength scanning chart of L-carnitine

如圖3所示，L-肉堿在220 nm附近存在一個(gè)吸收峰。含L-肉堿的樣品在特征波長條件下的色譜圖雜質(zhì)峰較少，峰形尖銳對稱，所以選擇220 nm作為L-肉堿的檢測波長。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

為了驗(yàn)證L-肉堿在流動(dòng)相Ⅳ：乙腈-辛烷磺酸鈉（50 mmol/L，pH）（體積比為25∶75）體系中的線性關(guān)系，配制了濃度為 1.0、2.0、4.0、8.0、10.0、20.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。試驗(yàn)結(jié)果表明，L-肉堿在1.0 μg/mL～20.0 μg/mL 內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系（r2＞0.99）；采用在空白基質(zhì)中添加目標(biāo)組分的方法，依據(jù)色譜峰的性噪比（S/N）大于3倍確定檢出限（LOD），S/N大于10倍確定定量限（LOQ），得到L-肉堿組分的LOD為0.1 mg/kg，LOQ 為 0.3 mg/kg，結(jié)果見表 1。

2.4 樣品前處理?xiàng)l件的優(yōu)化

根據(jù)L-肉堿有較好的水溶性和醇溶性的特點(diǎn)，試驗(yàn)比較甲醇、乙醇、1.0 mmol/L鹽酸溶液3種提取溶液的提取L-肉堿的提取效果。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與樣品以不同比例混合的甲醇、乙醇提取液，雜質(zhì)較多，無法與L-肉堿分離，色譜圖中目標(biāo)峰峰形拖尾，影響L-肉堿的分析；而1.0 mmol/L鹽酸溶液與樣品以1∶1（體積比）提取的樣品，目標(biāo)峰可與雜質(zhì)完全分離，且峰形對稱，可以作為運(yùn)動(dòng)飲料中L-肉堿的提取溶液。

固相萃取法以其集樣品提取、濃縮、凈化于一體，簡化了操作步驟，減少了溶劑用量，提高了樣品前處理效率而受到重視。比較不同的固相萃取柱對樣品回收率的影響，結(jié)果表明L-肉堿在WCX固相萃取柱與HLB固相萃取柱中回收率不高，目標(biāo)化合物在淋洗液中有檢出，說明L-肉堿在WCX柱與HLB柱中是弱保留，凈化效果不佳。采用MCX固相萃取柱，L-肉堿的回收率大于80%，因此選用MCX固相萃取柱可以起到凈化富集的作用。

表1 L-肉堿的保留時(shí)間、標(biāo)準(zhǔn)曲線、相關(guān)系數(shù)、檢出限與定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of L-carnitine

2.5 加標(biāo)回收與相對偏差

在以上試驗(yàn)的優(yōu)化條件下，利用空白基質(zhì)的樣品進(jìn)行加標(biāo)回收率試驗(yàn)，在分別添加10、50、100μg/kg等3個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，每個(gè)濃度平行測定5次，測定結(jié)果見表2。

表2 方法的回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表2可見，L-肉堿的加標(biāo)回收率為82.3%～84.1%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為1.9%～2.6%，表明本試驗(yàn)所建立的方法具有可靠的準(zhǔn)確度和精密度。

2.6 實(shí)際樣品的測定

應(yīng)用本文所建立的方法，對市售不同類型的標(biāo)稱含有L-肉堿的運(yùn)動(dòng)飲料共10個(gè)批次進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)這10個(gè)批次運(yùn)動(dòng)飲料中都含有L-肉堿，但含量差別較大，范圍在20 μg/kg～1160 μg/kg之間。如圖 4 所示，是一款運(yùn)動(dòng)飲料中含有L-肉堿的色譜圖。

圖4 樣品中L-肉堿的色譜圖Fig.4 The chromatograms of L-carnitine in the sample

3 結(jié)論

本文建立一種固相萃取-高效液相色譜-PDA檢測器檢測運(yùn)動(dòng)飲料中L-肉堿的分析方法。結(jié)果表明，在pH3.0的流動(dòng)相：乙腈-辛烷磺酸鈉（50 mmol/L）（體積比為25∶75），L-肉堿能得到良好的基線分離，其峰型良好，出峰時(shí)間合適。在220 nm的檢測波長下，樣品經(jīng)過1.0 mmol/L鹽酸溶液與樣品以1∶1（體積比）提取后，再處理采用MCX固相萃取柱凈化后，可實(shí)現(xiàn)對目標(biāo)物的有效提取和凈化。樣品中的L-肉堿的加標(biāo)回收率能達(dá)到82.3%～84.1%，能滿足檢測目標(biāo)物質(zhì)的要求，可以準(zhǔn)確快速有效地檢測運(yùn)動(dòng)飲料中L-肉堿。

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Determination of L-Carnitine in Sports Drink by HPLC

ZHOU Wen-qing
（Jingdezhen Ceramic Institute，Jingdezhen 333000，Jiangxi，China）

A rapid and effective method was established for the determination of L-carnitine in sports drink by HPLC.After the sample was extracted by 1.0 mmol/L HCl，it concentrated and purified by MCX solid phase extraction column.The separation of targeted compound was performed on RP C18 column（4.6 mm×250 mm，5 μm）using acetonitrile：sodium octane sulfonate （50 mmol/L）（25 ∶75，volume ratio）as mobile phase，with PDA detector and external standard method peak area quantification.The linear range of L-carnitine was in the range of 1.0 μg/mL-20.0 μg/mL with a correlation coefficient of 0.999.The detection limit was 0.1 mg/kg and the quantitative limit was 0.3 mg/kg.The recovery rate was 82.3%-84.1%.

high performance liquid chromatography（HPLC）；sports drink；L-carnitine

2016-12-09

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.032

周文清（1980—），女（漢），講師，碩士研究生，研究方向：運(yùn)動(dòng)人體科學(xué)。