基于菊芋低聚果糖的酶解工藝研究

陳興都，翟丹云，陳慶安，趙莉莉，董延虎，李赟，牛婕

（甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州730010）

基于菊芋低聚果糖的酶解工藝研究

陳興都，翟丹云，陳慶安，趙莉莉，董延虎，李赟，牛婕

（甘肅省商業(yè)科技研究所，甘肅蘭州730010）

以菊芋菊粉液為原料，采用內(nèi)切型菊粉酶水解法生產(chǎn)低聚果糖。在單因素的基礎(chǔ)上，選取加酶量、溫度、時(shí)間、pH值為自變量，以轉(zhuǎn)化率為響應(yīng)值，通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)對(duì)其酶解工藝參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化。其最優(yōu)工藝為：加酶量2.5 U/g，酶解時(shí)間6.0 h，酶解溫度60℃，酶解pH值為6.0的條件下，低聚果糖的轉(zhuǎn)化率可達(dá)到96.27%，與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為1.91%。

菊芋；低聚果糖；菊粉酶；轉(zhuǎn)化率；響應(yīng)面設(shè)計(jì)

菊芋，學(xué)名 Helianthus tuberosus（L.1753），又叫洋姜、鬼子姜，菊科向日葵屬草本植物，原產(chǎn)北美地區(qū)，經(jīng)歐洲傳入中國(guó)，具有適應(yīng)性強(qiáng)、抗旱、耐寒的生長(zhǎng)特點(diǎn)[1]。其富含碳水化合物，塊根中菊粉含量達(dá)到70%[2]。

低聚果糖（Fructo-oligo-saccharide，F(xiàn)OS）是內(nèi)切型菊粉酶作用于菊粉，切斷菊粉分子內(nèi)部的糖苷鍵，得到蔗果三糖、四糖和五糖等低聚果糖，屬于果糖和葡萄糖構(gòu)成的直鏈雜低聚糖[3-4]。

低聚果糖作為一種天然功能性食用多糖，具有水溶性膳食纖維和益生菌的功能[5-6]，能夠調(diào)節(jié)血糖血脂平衡、維持胃腸道功能、促進(jìn)機(jī)體免疫排毒、預(yù)防糖尿病及心腦血管疾病[7-9]。

酶法降解具有高效性、專一性、產(chǎn)品純度高，同時(shí)不影響低聚果糖的組織結(jié)構(gòu)和生物活性[10-11]，是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)。本試驗(yàn)對(duì)菊芋菊糖液酶解工藝進(jìn)行研究，獲得低聚果糖酶解的工藝參數(shù)，為菊芋資源的充分利用和深加工提供技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 材料儀器

菊芋：市購(gòu)，將菊芋篩土、清洗、切絲后，送至浸提罐70℃～90℃熱蒸汽逆流提取3.0 h，濾過(guò)液經(jīng)雙碳酸和活性炭吸附法分離除去蛋白、膠體等雜質(zhì)，即得菊芋菊粉液；S960型菊粉酶（20 000 U/g）：上海耐今實(shí)業(yè)有限公司；3，5-二硝基水楊酸（DNS）：武漢鴻?？翟噭┯邢薰?；D-果糖（純度＞99%）：寧波北侖雅旭化工有限公司。

TU-1800PC型紫外分光光度計(jì)：上海精密儀器儀表有限公司；HH-8型恒溫水浴鍋：常州市金壇區(qū)環(huán)宇科學(xué)儀器廠；不銹鋼罐：溫州市宏斌食品機(jī)械公司；AL204型電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；PHS-3C型酸度計(jì)：上?？茣钥茖W(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 轉(zhuǎn)化率測(cè)定

果糖含量采用DNS法，以D-果糖質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，建立線性回歸方程y=0.026 3x-0.012 4（相關(guān)系數(shù)R2=0.996 3），根據(jù)方程確定樣品中果糖含量[12]。低聚果糖的轉(zhuǎn)化率計(jì)算公式如下：

1.2.2 酶解單因素試驗(yàn)

選擇S960型菊粉酶降解菊芋菊粉液生產(chǎn)低聚果糖，以菊粉酶添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間、酶解pH值為試驗(yàn)因素，轉(zhuǎn)化率為試驗(yàn)指標(biāo)進(jìn)行單因素試驗(yàn)，研究對(duì)低聚果糖酶解效果的影響。分別選擇菊粉酶添加量為 0.5、1.5、2.5、3.5、4.5 U/g；時(shí)間為 2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 h；溫度為 20、30、40、50、60 ℃；pH 值為 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0，反應(yīng)后過(guò)濾，收集濾過(guò)液，備用[13]。

1.2.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以內(nèi)切型菊粉酶S960的添加量、酶解溫度、酶解時(shí)間以及酶解pH值為自變量，低聚果糖的轉(zhuǎn)化率為因變量，通過(guò)中心旋轉(zhuǎn)組合設(shè)計(jì)來(lái)篩選最優(yōu)酶解工藝參數(shù)[14]，因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface design

1.2.4 最佳工藝驗(yàn)證

利用響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化的最佳工藝參數(shù)，進(jìn)行菊芋低聚果糖酶解工藝的驗(yàn)證。

2 結(jié)果與討論

2.1 酶解工藝參數(shù)的確定

2.1.1 加酶量對(duì)酶解效果的影響

在酶解菊芋提取液的過(guò)程中控制體系溫度50℃、時(shí)間6.0 h、pH值為5.0的酶解條件下，設(shè)置不同的加酶量，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 加酶量對(duì)酶解效果的影響Fig.1 Effect of enzyme dosage on enzymolysis

隨加菊粉酶量增大，濾過(guò)液中低聚果糖的轉(zhuǎn)化率呈先上升后趨于不變的趨勢(shì)，當(dāng)加酶量為2.5 U/g時(shí)，低聚果糖的轉(zhuǎn)化率達(dá)到93.01%，比加酶量1.5 U/g時(shí)高32.35%，比加酶量3.5U/g低1.22%，比加酶量4.5 U/g低3.34%。在適宜的條件下，提高酶液濃度，會(huì)擴(kuò)大與菊芋果聚糖的接觸面積，單位體積內(nèi)反應(yīng)物的活化分子數(shù)增多，反應(yīng)速度加快，加速菊芋低聚果糖的溶出，轉(zhuǎn)化率因而升高。若繼續(xù)增大酶量，低聚果糖的轉(zhuǎn)化率則不明顯，可能原因是酶解過(guò)程的底物隨反應(yīng)逐漸減少?？紤]到生產(chǎn)成本，因此，選取加酶量為2.5 U/g。

2.1.2 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響

在酶解菊芋提取液的過(guò)程中控制體系加酶量2.5U/g、溫度50℃、pH值為5.0的酶解條件下，設(shè)置不同酶解時(shí)間，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Effect of time on enzymolysis

隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶解液中低聚果糖的轉(zhuǎn)化率呈逐漸上升后略有下降的趨勢(shì)，在酶解6.0 h時(shí)低聚果糖的轉(zhuǎn)化率最高，為95.17%。在適宜的催化溫度下，延長(zhǎng)酶解時(shí)間酶促反應(yīng)使菊芋果聚糖迅速溶出，當(dāng)達(dá)到擴(kuò)散的動(dòng)態(tài)平衡后，單位體積內(nèi)反應(yīng)物的活化分子數(shù)逐漸減少，酶解液中低聚果糖會(huì)發(fā)生部分水解，因此，選取酶解時(shí)間為6.0 h。

2.1.3 溫度對(duì)酶解效果的影響

在酶解菊芋提取液的過(guò)程中控制體系加酶量2.5 U/g、時(shí)間6.0 h、pH值為5.0的酶解條件下，設(shè)置不同酶解溫度，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.3 Effect of temperature on enzymolysis

隨酶解溫度升高，在菊粉酶的作用下，濾過(guò)液中低聚果糖的轉(zhuǎn)化率呈逐漸升高后下降的趨勢(shì)，在50℃時(shí)低聚果糖的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到94.43%。溫度升高，會(huì)促使酶液分子受熱擴(kuò)散，增大與菊粉溶液的接觸程度，單位體積內(nèi)活化分子數(shù)增多，加速果聚糖的水解溶出，轉(zhuǎn)化率不斷升高，但溫度過(guò)高，會(huì)抑制酶活性，甚至?xí)鹈甘Щ钭冃?，不利于酶解溶出，因此，選取酶解溫度為50℃。

2.1.4 pH值對(duì)酶解效果的影響

在酶解菊芋提取液的過(guò)程中控制體系加酶量2.5 U/g、溫度50℃、時(shí)間6.0 h的酶解條件下，設(shè)置不同酶解pH值，試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 pH值對(duì)酶解效果的影響Fig.4 Effect of pH on enzymolysis

隨酶解液pH值的增加，濾過(guò)液中低聚果糖的轉(zhuǎn)化率呈先上升后不斷下降的趨勢(shì)，在酶解pH值5.0時(shí)，低聚果糖的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到94.42%。可能原因是在最適酶解pH值下，菊芋果聚糖水解，低聚果糖迅速溶出，高于或低于最適pH值，均會(huì)使酶活性受到抑制，低聚果糖的溶出率會(huì)下降。綜合考慮，選擇酶解pH值為5.0。

2.2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)工藝參數(shù)優(yōu)化

在菊芋菊粉液酶解單因素基礎(chǔ)上，進(jìn)行酶解工藝響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化，試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Design and results of Box-Behnken test

利用Design-Expert 8.06進(jìn)行回歸擬合，得到各酶解因素與低聚果糖轉(zhuǎn)化率（R）的回歸方程為：R=1.801 67A+4.110 83B+4.398 33C+4.948 33D-1.316 25AB-0.913 75AC+0.203 75AD-2.345BC-0.397 50BD+2.527 5CD-1.413 75A2-2.251 25B2-3.402 5C2-2.575D2+92.296 67

為確定響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)中4個(gè)試驗(yàn)因素對(duì)菊芋菊粉酶解效果的影響，以及各個(gè)因素的交互作用和顯著性，進(jìn)行方差分析見(jiàn)表3。

表3 方差分析結(jié)果Table 3 Results of variance analysis

結(jié)果顯示：模型P＜0.01，相關(guān)系數(shù)R2為0.891 3，校正系數(shù)Adj-R2為0.827 6，響應(yīng)變量高于0.80，模型回歸極顯著，各因素之間的交互作用不顯著（見(jiàn)圖5～10）。失擬項(xiàng)不顯著（P＞0.05），表明該回歸方程對(duì)菊粉液的酶解試驗(yàn)擬合情況良好。通過(guò)模型系數(shù)顯著性檢驗(yàn)，得到酶解因素的主效應(yīng)關(guān)系：D＞C＞B＞A，即酶解pH 值＞溫度＞時(shí)間＞加酶量，其中 B、C、D、C2對(duì)酶解效果影響極顯著，而因素D2對(duì)菊粉液酶解效果有顯著影響。

圖5 加酶量和酶解時(shí)間對(duì)酶解效果的影響Fig.5 Effect of enzyme dosage and time on enzymolysis

圖6 加酶量和酶解溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.6 Effect of enzyme dosage and temperature on enzymolysis

通過(guò)S960內(nèi)切型菊粉酶對(duì)菊芋菊粉液的降解處理，響應(yīng)面設(shè)計(jì)優(yōu)化其酶解工藝參數(shù)為：加酶量2.5U/g、時(shí)間6.0h、溫度60℃、pH值為6.0。對(duì)其最佳工藝進(jìn)行驗(yàn)證，驗(yàn)證實(shí)測(cè)值為96.27%，與預(yù)測(cè)值之間的相對(duì)誤差為1.91%。

圖7 加酶量和酶解pH值對(duì)酶解效果的影響Fig.7 Effect of enzyme dosage and pH on enzymolysis

圖8 酶解時(shí)間和溫度對(duì)酶解效果的影響Fig.8 Effect of temperature and time on enzymolysis

圖9 酶解時(shí)間和pH值對(duì)酶解效果的影響Fig.9 Effect of time and pH on enzymolysis

圖10 酶解溫度和pH值對(duì)酶解效果的影響Fig.10 Effect of temperature and pH on enzymolysis

3 結(jié)論

通過(guò)S960內(nèi)切型菊粉酶降解菊芋菊粉液制取低聚果糖，采用響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化酶解工藝，其最佳酶解參數(shù)為：加酶量2.5 U/g、溫度60℃、時(shí)間6.0 h、pH值為6.0，此時(shí)低聚果糖的轉(zhuǎn)化率為96.27%。

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Study on Enzymatic Hydrolysis Processing of Fructo-oligosaccharide from Jerusalem Artichoke

CHEN Xing-du，ZHAI Dan-yun，CHEN Qing-an，ZHAO Li-li，DONG Yan-hu，LI Yun，NIU Jie
（Gansu Institute of Business and Technology，Lanzhou 730010，Gansu，China）

Fructo-oligosaccharide was prepared from extraction of Jerusalem artichoke as a inulinase immobilization hydrolysis method.Four enzymolysis parameters including enzyme dosage，enzymolysis temperature，enzymolysis time and enzymolysis pH were optimized as the result of the conditions for enzymolysis of fructooligosaccharide from Jerusalem artichoke by Box-Behnken Response surface design methodology based on the percent conversion as a response value.Results showed that the optimum condition of enzymolysis was as follows：the dosage of enzyme 2.5 U/g，enzymolysis time 6.0 h，enzymolysis temperature 60℃，and enzymolysis pH6.0.Under this condition fructo-oligosaccharide percent conversion was up to 96.27%.Compared with predicted values and the relative error was 1.91%.

jerusalem artichoke；fructo-oligosaccharide；inulinase；percent conversion；response surface design

2016-09-07

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.024

甘肅省技術(shù)研究與開(kāi)發(fā)專項(xiàng)計(jì)劃（1207TCYA039）

陳興都（1987—），男（漢），工程師，碩士研究生，主要從事食品工藝、天然產(chǎn)物等相關(guān)研究。