效應(yīng)面法優(yōu)選甜茶素提取工藝

吳婕，吳超，宮江寧，廖莉玲，*

（1.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550018；2.貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550001）

效應(yīng)面法優(yōu)選甜茶素提取工藝

吳婕1，吳超1，宮江寧2，廖莉玲2，*

（1.貴州師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550018；2.貴州師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽550001）

為了甜茶素的工業(yè)化生產(chǎn)，在甜茶葉中提取甜茶素的單因素試驗基礎(chǔ)上，采用效應(yīng)面法優(yōu)選出甜茶素的提取工藝參數(shù)，建立關(guān)于甜茶素提取率的二項式擬合方程，得到的最佳提取工藝參數(shù)：乙醇體積分?jǐn)?shù)54.45%，提取溫度70.21℃，液料比15.13 mL/g，提取時間2.1 h，甜茶素提取率的預(yù)測值3.615 3%。同時為了檢驗此工藝條件在實際工業(yè)生產(chǎn)中的可靠性，改進(jìn)工藝條件為：提取溫度70℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，提取時間2.0 h，液料比15 mL/g，得到甜茶素提取率的實際值與其二項式擬合方程的預(yù)測值偏差僅為1.24%。故效應(yīng)面法優(yōu)選出的甜茶素的提取工藝參數(shù)，方法簡便、可靠。

甜茶；提取工藝；甜茶素；效應(yīng)面法

甜茶是一種薔薇科懸鉤子屬的落葉，其葉味甜，故名“甜茶”。甜茶不僅具有人體所必需的氨基酸、維生素C以及礦物質(zhì)等成分，還含有甜茶素、茶多酚和黃酮等活性成分。甜茶的甜味來源于甜茶素（Rubusoside，又名甜茶甙），其分子式為C32H50O13，它是葡萄糖和斯替維醇結(jié)合生成的四環(huán)二萜甙，其化學(xué)結(jié)構(gòu)與甜葉菊甙非常相似。甜茶素的甜度是蔗糖的300倍，然而熱值卻為蔗糖的1%，故可作為一種天然的甜味劑，成為肥胖癥和糖尿病患者的糖類替代物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥等行業(yè)[1]，具有廣闊的市場前景。

提取甜茶素的方法主要有微波提取法、大孔樹脂吸附分離法和有機(jī)溶劑提取法等[2-5]，本試驗采用有機(jī)溶劑乙醇冷凝回流法提取甜茶葉的甜茶素。在甜茶葉中提取甜茶素的單因素試驗基礎(chǔ)上，以甜茶素提取率為研究對象，以乙醇溶劑的體積分?jǐn)?shù)、液料比、提取甜茶素溫度和提取甜茶素的時間為考察因素，借助實驗設(shè)計軟件Design-Expert.7.0的Box-Behnken模式，研究各考察因素對甜茶素提取率的單獨作用和交互作用，建立關(guān)于甜茶素提取率的回歸方程數(shù)學(xué)模型，為甜茶素的工業(yè)化生產(chǎn)優(yōu)選出最佳工藝條件。

1 材料與方法

1.1 主要試驗材料與試劑

甜茶葉：貴州健康茶科技有限公司；甲醇（色譜純）德國進(jìn)口；無水乙醇為分析純。

1.2 主要器材

Aglient1200高效液相色譜儀：美國安捷倫公司；A200S型電子天平：泉州市長新電子有限公司；101-1A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、FZ102微型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；KDM型控溫電熱套：山東鄄城華魯電熱儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 提取甜茶素的工藝流程

清洗甜茶葉→烘干（35℃）→研碎→過40目篩→備用

稱取甜茶葉粉末2.0 g→提取→冷凝回流→過濾→離心（4 200 r/min）→合并濾液→定容→測定甜茶素的質(zhì)量濃度

1.3.2 甜茶素含量的測定[6]與計算

高效液相色譜法測定甜茶素含量。檢測器：Aglient 1200；色譜柱：迪馬 C1（8 250 mm×4.6 mm×5 μm；柱溫：30℃；色譜甲醇 ∶水=85∶15（體積比）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：210 nm；進(jìn)樣量：10 μL。

甜茶素的提取率Y/%=C×V/M×100，式中：C為甜茶素質(zhì)量濃度，mg/mL；V為甜茶素體積，mL；M為甜茶葉質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素試驗

以甜茶素提取率為研究對象，分別以不同的溶劑乙醇的體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取甜茶素的溫度和提取甜茶素的時間為考察因素，進(jìn)行3次平行試驗，得到甜茶素提取率的平均值，從而確定各考察因素的合適取值范圍。

2.1.1 乙醇溶劑的體積分?jǐn)?shù)對甜茶素提取率的影響

稱取2.0 g甜茶葉，液料比10 mL/g，提取時間1.5 h，提取溫度55℃，選取不同的體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液（30%、40%、50%、60%、70%）分別提取甜茶素，試驗結(jié)果如圖1所示。

由圖1可以得出，甜茶素提取率隨著乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大而增大；但是當(dāng)乙醇溶劑的體積分?jǐn)?shù)超過50%時，甜茶素提取率反而有下降的趨勢。因為甜茶素易溶于乙醇極性溶劑，它的溶解量隨著乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，但是其他可以溶于乙醇溶劑的雜質(zhì)，如色素、黃酮類物質(zhì)，它們的溶解量也隨著乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大而增大，當(dāng)乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)超過50%時，可溶于乙醇溶劑的雜質(zhì)溶出量超過甜茶素的溶出量，在單位體積的乙醇溶劑中，甜茶素的提取率反而降低了[7]。此外，乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)較大時其揮發(fā)性較強(qiáng)，工業(yè)生產(chǎn)利用率較低。故選擇有機(jī)溶劑50%的乙醇為宜。

2.1.2 液料比對甜茶素提取率的影響

稱取2.0 g甜茶葉，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%、提取時間1.5 h和溫度 70 ℃，選取不同液料比（5、10、15、20、25 mL/g）分別提取甜茶素，試驗結(jié)果如圖2所示。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對甜茶素提取率的影響Fig.1 Effects of ethanol volume percentage on extraction rate of rubusoside

圖2 液料比對甜茶素提取率的影響Fig.2 Effects of liquid-material ratio on extraction rate of rubusoside

由圖2可以得出，甜茶素的提取率隨著液料比的增大而升高，特別是液料比在15 mL/g以下，甜茶素提取率升高較快，而液料比超過15 mL/g，甜茶素提取率的曲線變化不明顯。因為液料比的增加實質(zhì)是乙醇溶劑量的增加，增加的液料比導(dǎo)致物料內(nèi)外溶液的甜茶素質(zhì)量濃度差增大，從甜茶葉中溶出的甜茶素增多，故甜茶素提取率增大；但是當(dāng)液料比超過15 mL/g時，單位質(zhì)量的甜茶葉中甜茶素已經(jīng)基本溶出，甜茶素提取率變化不明顯；并且不合適的增加液料比不僅不利于提高甜茶素提取率，反而會對后續(xù)的濃縮工藝造成困難。故選擇液料比為15 mL/g較好。

2.1.3 提取甜茶素的時間對其提取率的影響

稱取2.0 g甜茶葉粉末，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，液料比15 mL/g，提取溫度70℃，選取不同的提取時間（1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 h）分別提取甜茶素，試驗結(jié)果如圖3所示。

圖3 提取時間對甜茶素提取率的影響Fig.3 Effects of extraction time on extraction rate of rubusoside

從圖3可以得出，在2 h內(nèi)甜茶素提取率迅速增長，但是超過2 h后，甜茶素提取率變化趨于平緩。因為在2 h時此溶液體系的傳質(zhì)過程已經(jīng)基本達(dá)到動態(tài)平衡，溶出的甜茶素質(zhì)量濃度也基本趨于穩(wěn)定，導(dǎo)致甜茶素提取率也趨于穩(wěn)定。故選擇提取時間2 h效果為佳。

2.1.4 提取甜茶素的溫度對其提取率的影響

稱取2.0 g甜茶葉，乙醇體積分?jǐn)?shù)50%，提取時間2 h，液料比 15 mL/g，選擇不同的提取溫度（60、65、70 、75、80℃）分別提取甜茶素，試驗結(jié)果如圖4所示。

圖4 溫度對甜茶素提取率的影響Fig.4 Effects of temperature on extraction rate of rubusoside

由圖4可以得出，甜茶素提取率隨著提取溫度的升高逐漸增大。在60℃～70℃之間，甜茶素提取率增加的速率較大，而在70℃～80℃之間，甜茶素提取率的變化趨于平緩。因為在一定的時間和液料比范圍之內(nèi)，溫度的升高有利于甜茶素分子在甜茶葉溶液中擴(kuò)散，提取的甜茶素質(zhì)量濃度會增加，甜茶素提取率也會升高；但是當(dāng)溫度升高到一定值時，擴(kuò)散作用使得從甜茶葉中溶出的甜茶素質(zhì)量濃度達(dá)到恒定，導(dǎo)致甜茶素提取率幾乎不再變化。故選擇提取溫度70℃比較合適。

2.2 提取甜茶素工藝條件的效應(yīng)面優(yōu)化

2.2.1 效應(yīng)面因素分析及水平選取

在提取甜茶素的單因素試驗結(jié)果基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）/%、提取溫度（B）/℃、液料比（C）/mL/g、提取時間（D）/h為考察因素，以甜茶素提取率（Y）/%為效應(yīng)值，應(yīng)用Design-Expert.7.0軟件設(shè)計4個考察因素3個水平的Box-Behnken分析試驗。

為了簡化數(shù)據(jù)，把各考察因素水平轉(zhuǎn)化為標(biāo)準(zhǔn)函數(shù)。水平變換公式為：

乙醇體積分?jǐn)?shù)：A/%＝（A*－50）/10

提取溫度：B/℃＝（B*－70）/10

液料比：C/（mL/g）＝（C*－15）/5

提取時間：D/h＝（D*－2.0）/5

本試驗的提取甜茶素考察因素各水平代碼值及實際操作物理量，如表1所示。

表1 考察因素各水平代碼值及實際操作物理量Table 1 Code value and physical practice of independent variables levels

表2 星點設(shè)計及結(jié)果Table 2 Central composite design and results

續(xù)表2 星點設(shè)計及結(jié)果Continue table 2 Central composite design and results

2.2.2 數(shù)學(xué)回歸模型擬合與顯著性檢驗

運(yùn)用Design-Expert.7.0軟件進(jìn)行效應(yīng)面分析，Box-Behnken設(shè)計出29個試驗點。將試驗所得數(shù)據(jù)帶入Box-Behnken中，以各總評歸一值（甜茶素提取率/%）對各考察因素[乙醇體積分?jǐn)?shù)/%、提取溫度/℃、液料比/（mL/g）和提取時間/h]進(jìn)行多元線性回歸和二項式擬合，擬合的甜茶素提取率數(shù)學(xué)回歸模型如下：

Y=3.54+0.33A-0.012B+0.087C+0.23D-0.012AB-0.029AC-0.26AD+0.11BC+0.24BD-0.008 5CD-0.41A2-0.088B2-0.002 9C2-0.35D2

對擬合的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行F檢驗方差分析，其結(jié)果如表3所示。從整體上看，擬合的數(shù)學(xué)回歸模型反映了各考察因素[乙醇體積分?jǐn)?shù)/%、提取溫度/℃、液料比/（mL/g）和提取時間/h]對甜茶素提取率的單獨作用和交互作用，其中 A、B、C、D、A2、B2、C2、D2項代表 4 個考察因素對甜茶素提取率的單獨作用，而AB、AC、AD、BC、BD、CD項代表不同的考察因素對甜茶素提取率的交互作用。

表3 二項式擬合回歸模型的方差分析Table 3 Analysis of variance for binomial fitting quadratic regression model

從表3可以看出：第一，該模型的P＜0.000 1，相關(guān)系數(shù)R2=0.932 0，表示數(shù)學(xué)回歸模型達(dá)到極顯著水平，該模型與實際情況擬合度好，它能夠解釋各考察因素與甜茶素提取率的關(guān)系；第二，失擬項P=0.314 3＞0.05，S/N（信噪比）=15.720 0＞4，表示該模型與實際擬合中的非正常誤差所占的比例很小，該模型模擬出的甜茶素的最佳提取工藝具有很高的可信度。第三，在F值中，各考察因素對甜茶素提取率的影響程度大小順序為：乙醇體積分?jǐn)?shù)/%＞提取時間/h＞液料比/（mL/g）＞提取溫度/℃。第四，在P值中，一次方項的乙醇體積分?jǐn)?shù)對甜茶素提取率影響非常顯著，二次方項的乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)和提取甜茶素的時間對其提取率影響非常顯著。

2.2.3 提取甜茶素工藝優(yōu)化與預(yù)測

Design-Expert.7.0軟件可以根據(jù)星點試驗設(shè)計的結(jié)果繪制效應(yīng)值（甜茶素提取率/%）與任意兩個考察因素[乙醇體積分?jǐn)?shù)/%、提取溫度/℃、液料比/（mL/g）、提取時間/h]的三維效應(yīng)面。通過三維效應(yīng)面能直觀的看出各考察因素交互作用對甜茶素提取率效應(yīng)值的影響[6，8]。本研究的三維效應(yīng)面見圖5～圖10。

圖5 提取溫度和乙醇體積分?jǐn)?shù)對甜茶素提取率的效應(yīng)面Fig.5 Response surface for the effect of cross interaction between extraction temperature and ethanol volume percentage on extraction rate of rubusosides

圖6 乙醇體積分?jǐn)?shù)和液料比對甜茶素提取率的效應(yīng)面Fig.6 Response surface for the effect of cross interaction between ethanol volume percentage and liquid-material ratio on extraction rate of rubusosides

由圖5可以看出，乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取甜茶素的溫度的交互作用不顯著。雖然甜茶素提取率隨著乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)和提取溫度的增加而逐漸升高，但是當(dāng)它們增加達(dá)到一定值時，甜茶素提取率表現(xiàn)降低的趨勢。

由圖6可以看出，乙醇溶劑的體積分?jǐn)?shù)和液料比這兩個考察因素的交互作用不十分顯著。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)一定時，甜茶素提取率隨著液料比的增大而升高，但是升高的幅度很小；當(dāng)液料比一定時，乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)的增大，甜茶素提取率也增加，但是乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)超過55%時，甜茶素提取率反而呈現(xiàn)降低的趨勢。

圖7 乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間對甜茶素提取率的效應(yīng)面Fig.7 Response surface for the effect of cross interaction between ethanol volume percentage and extraction time on extraction rate of rubusosides

圖8 提取溫度和液料比的效應(yīng)面Fig.8 Response surface for the effect of cross interaction between extraction temperature and liquid-material ratio on extraction rate of rubusoside

圖9 提取溫度和提取時間的效應(yīng)面Fig.9 Response surface for the effect of cross interaction between extraction temperature and extraction time on extraction rate of rubusosides

由圖7可以看出，乙醇溶劑體積分?jǐn)?shù)和提取時間這兩個考察因素的交互作用非常顯著，它們微小的變化就會引起甜茶素提取率的變化。當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)和提取時間分別在55%和2.25 h之內(nèi)，甜茶素提取率隨它們的增大而顯著提高；若分別超過其臨界值，甜茶素提取率則呈現(xiàn)下降的趨勢。

由圖8可以看出，提取甜茶素的溫度和甜茶素的液料比這兩個考察因素交互作用不顯著。當(dāng)提取溫度一定時，液料比的增加對甜茶素提取率的增長影響不大；當(dāng)液料比一定時，甜茶素提取率隨著提取溫度的升高而增加，但是提取溫度超過70℃，甜茶素提取率反而降低。

圖10 提取時間和液料比對甜茶素提取率的效應(yīng)面Fig.10 Response surface for the effect of cross interaction between extraction time and liquid-material ratio on extraction rate of rubusosides

由圖9可以看出，提取甜茶素的溫度和時間的交互作用極顯著；當(dāng)提取甜茶素的時間一定時，提取率隨著提取溫度的增加先增加而后減?。划?dāng)提取甜茶素的溫度一定時，提取率隨著提取時間的延長而增加，但是超過2.0 h，甜茶素提取率反而降低。

由圖10可以看出，甜茶素的提取時間和液料比這兩個考察因素的交互作用較不顯著。當(dāng)液料比一定時，甜茶素提取率會隨著提取時間的延長而明顯增加，但是提取時間超過2.25h時，甜茶素提取率則呈現(xiàn)降低的趨勢；當(dāng)提取時間一定時，甜茶素提取率隨著液料比的增加有上升的趨勢，但是升高的幅度不是很大。

綜上所述，數(shù)學(xué)回歸模型預(yù)測的最佳工藝條件為：乙醇體積分?jǐn)?shù)54.45%，提取溫度70.21℃，液料比15.13（mL/g），提取時間 2.1 h，甜茶素提取率預(yù)測值3.615 3%。為了檢驗此工藝條件在實際工業(yè)生產(chǎn)中的可靠性，改進(jìn)工藝條件為：提取溫度70℃，乙醇體積分?jǐn)?shù) 55%，提取時間 2.0 h，液料比 15（mL/g），平行試驗3次，得到甜茶素提取率的平均驗證值3.570 6%，可以得出甜茶素提取率的驗證值與預(yù)測值的相對偏差較小（約1.25%），故認(rèn)為星點設(shè)計效應(yīng)面法選擇的最佳甜茶素的提取工藝，擬合結(jié)果準(zhǔn)確，可信度高。

3 結(jié)論

為了尋求最佳的考察因素水平，一般采用沒有明確的函數(shù)表達(dá)式的線性數(shù)學(xué)模型——正交設(shè)計，但是它無法在設(shè)定的考察因素范圍內(nèi)找到最佳組合[9-10]。效應(yīng)面法可以克服正交設(shè)計的缺點，建立效應(yīng)值與考察因素的回歸數(shù)學(xué)模型，試驗選連續(xù)變量，所得試驗結(jié)果更加接近回歸數(shù)學(xué)模型預(yù)測值[11]，并且可以從效應(yīng)面上選擇最佳的效應(yīng)值，回推出最優(yōu)的考察因素組合。

本研究，在提取甜茶素的單因素試驗基礎(chǔ)上，利用試驗設(shè)計軟件Design-Expert.7.0對考察因素乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）/%、提取溫度（B）/℃、液料比（C）/（mL/g）、提取時間（D）/h與甜茶素提取率（Y）/%的數(shù)學(xué)模型進(jìn)行了回歸分析，其相關(guān)性極顯著，它能有效地預(yù)測甜茶素的最佳工藝條件：乙醇體積分?jǐn)?shù)54.45%，提取溫度70.21℃，液料比為 15.13（mL/g），提取時間 2.1 h，甜茶素提取率的理論值3.615 3%。為了檢驗此工藝條件在實際工業(yè)生產(chǎn)中的可靠性，改進(jìn)工藝條件為：提取溫度70℃，乙醇體積分?jǐn)?shù)55%，提取時間2.0 h，液料比15（mL/g），平行試驗3次，得到甜茶素提取率的平均驗證值為3.570 6%，得出甜茶素提取率的驗證值與預(yù)測值的相對偏差較小（約1.24%），可以認(rèn)為該模型預(yù)測的最佳工藝條件合理可靠。

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Optimization of Extraction Process of Rubusoside by Response Surface Method

WU Jie1，WU Chao1，GONG Jiang-ning2，LIAO Li-ling2，*
（1.College of Chemistry and Life Science，Guizhou Normal College，Guiyang 550018，Guizhou，China；2.School of Chemistry and Material Science，Guizhou Normal University，Guiyang 550001，Guizhou，China）

Based on the single factor test of extraction rubusoside，response was used to explore the optimum extraction parameters of rubusoside for industry.The rubusoside extraction regression equation was established and the optimal extraction processing parameters were determined.The optimal conditions of extraction process were followed：extraction temperature of 70.21℃，ethanol concentration of 54.45%，extraction time of 2.1 h and liquid-material ratio of 15.13 mL/g.Under this condition，the rubusoside extraction rate was 3.615 3%.In order to test the reliability of the process condition in industry，the best verification processing parameters were followed：extraction temperature of 70℃，ethanol concentration of 55%，extraction time of 2.0 h and liquidmaterial ratio of 15 mL/g.The variance between the result of the best verification test and the binomial fitting equation forecast value was nearly 1.24%.Thus，The optimized extraction parameters were simple and reliable.

sweet tea；extraction technology；rubusoside；response method

2016-10-09

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.11.014

吳婕（1982—），女（土家），副教授，博士研究生，主要從事化學(xué)天然產(chǎn)物和環(huán)境科學(xué)研究。

*通信作者：廖莉玲，教授，碩士，主要從事化學(xué)天然產(chǎn)物和材料化學(xué)研究。