5-羥色胺轉(zhuǎn)運體基因LPR及5-羥色胺1A受體C(-1019)G基因多態(tài)性的聯(lián)合作用與重性抑郁癥的關(guān)聯(lián)研究

關(guān)小妮，張克讓，崔 勇，薛德旺，段宏秋，呂廣有，修梅紅*

(1.北京回龍觀醫(yī)院，北京 100096；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西 太原 030001

論著·臨床

5-羥色胺轉(zhuǎn)運體基因LPR及5-羥色胺1A受體C(-1019)G基因多態(tài)性的聯(lián)合作用與重性抑郁癥的關(guān)聯(lián)研究

關(guān)小妮1，張克讓2，崔 勇1，薛德旺1，段宏秋1，呂廣有1，修梅紅1*

(1.北京回龍觀醫(yī)院，北京 100096；2.山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院，山西 太原 030001

目的 探討5-羥色胺轉(zhuǎn)運體基因LPR(5-HTT LPR)多態(tài)性和5-羥色胺1A受體(5-HT1AR)C(-1019)G基因多態(tài)性的聯(lián)合作用與重性抑郁癥的關(guān)系。方法 采用病例對照研究，以2005年10月-2007年5月在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院就診的197例重性抑郁癥患者為患者組，選取同期該院體檢中心與患者組性別、年齡匹配的健康對照者197例為對照組。應(yīng)用聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)(PCR)、SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及DNA直接測序法對兩組的5-HTT LPR及5-HT1AR C(-1019)G基因多態(tài)性進行檢測。應(yīng)用UNPHASED軟件進行統(tǒng)計分析。結(jié)果 患者組與對照組的5-HTT LPR和5-HT1AR C(-1019)G多態(tài)性位點基因型及等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。多態(tài)性聯(lián)合作用分析顯示，患者組G-S等位基因組合頻率高于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(21.4% vs. 12.4%,P=0.022)。結(jié)論 在中國漢族人群中，5-HTT LPR和5-HT1AR C(-1019)G的聯(lián)合作用與重性抑郁癥存在關(guān)聯(lián)，G-S等位基因組合可能會增加重性抑郁癥發(fā)病的危險性。

抑郁癥；5-羥色胺轉(zhuǎn)運體；5-羥色胺1A受體；基因多態(tài)性

抑郁癥是一種常見的可導(dǎo)致自殺死亡的精神疾病，已成為危害人類身心健康的主要疾病之一。研究表明，5-羥色胺(5-HT)系統(tǒng)功能降低和神經(jīng)傳遞減少是抑郁癥的發(fā)病機制之一。5-羥色胺轉(zhuǎn)運體(Serotonin transporter，5-HTT)分布于突觸前膜，通過再攝取5-HT來調(diào)節(jié)突觸間隙的5-HT水平，同時也是選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑(Selective serotonin reuptake inhibitors，SSRIs)發(fā)揮作用的重要靶點。突觸前膜的5-HT1A自主受體被激活后可減少5-HT能神經(jīng)元的電活動，同時它還通過自我反饋控制5-HT能神經(jīng)傳導(dǎo)?？挂钟羲幠苁?-HT1A自身受體脫敏，從而加強5-HT神經(jīng)傳遞。5-HTT影響5-羥色胺1A受體(serotonin 1A receptor，5-HT1AR)的表達和濃度，兩者相互協(xié)調(diào)共同調(diào)控突觸間5-HT系統(tǒng)活動。人類5-HTT基因位于17號染色體長臂11.1-12區(qū)，該基因啟動子區(qū)存在重要的缺失/插入多態(tài)性(5-HTT Linked polymorphic region，5-HTT LPR)，可明顯影響5-HTT的表達與功能活性，它的等位基因是14倍短重復(fù)的S等位基因和16倍長重復(fù)的L等位基因[1]。5-HT1AR基因位于第5號染色體q11.2-13區(qū)域，基因上游調(diào)控區(qū)內(nèi)的C(-1019)G基因多態(tài)性可通過影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合位點控制基因產(chǎn)物的表達。目前國內(nèi)關(guān)于5-HTT LPR、5-HT1AR C(-1019)G基因多態(tài)性與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性研究結(jié)果尚不一致[2-3]，且研究多集中在單基因多態(tài)性與抑郁癥的相關(guān)性上，抑郁障礙被認為是一種多基因遺傳疾病，單個候選易感基因不足以解釋其發(fā)病機制，基因間聯(lián)合作用與抑郁癥的關(guān)聯(lián)性研究有重要臨床意義。因此，本研究將在分析單個基因多態(tài)性對重性抑郁癥(Major Depression，MD)影響的基礎(chǔ)上，再探討上述兩種基因多態(tài)性間的聯(lián)合作用與重性抑郁癥的相關(guān)性，進一步明確5-HTT LPR和5-HT1AR C(-1019)G多態(tài)性在重性抑郁癥發(fā)病過程中的作用。

1 對象與方法

1.1 對象

以2005年10月-2007年5月就診于山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院精神衛(wèi)生科的門診抑郁癥患者為患者組。入組標(biāo)準：①符合《精神障礙診斷與統(tǒng)計手冊(第4版)》(Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders，fourth edition，DSM-Ⅳ)中重性抑郁障礙診斷標(biāo)準；②年齡≥18歲；③漢族；④漢密爾頓抑郁量表17項版(Hamilton Depression Scale-17 item，HAMD-17)評分≥17分。排除標(biāo)準：①有嚴重軀體疾病者；②有遺傳性疾病或其他重性精神障礙者。符合入組標(biāo)準且不符合排除標(biāo)準共197例，其中男性101例，女性96例；年齡18～63歲，平均(29.95±9.18)歲。選取同期在山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院體檢中心與患者組性別、年齡匹配的健康對照者197例為對照組，無嚴重軀體疾病和精神疾病家族史。其中男性91名，女性106名；年齡18～67歲，平均(29.64±9.58)歲。兩組年齡、性別差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(t=-0.322，P=0.748；χ2=1.016，P=0.313)。本研究獲山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院倫理委員會批準。受試者及家屬均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA的提取

采用含EDTA抗凝劑的真空采血管抽取所有受試者外周靜脈血2 mL后，雙蒸水破紅細胞，常規(guī)酚-氯仿法提取外周血基因組DNA，提取后將DNA樣本于-20℃冰箱保存，用于基因分型分析。

1.2.2 基因多態(tài)性檢測

1.2.2.1 5-HTT LPR位點檢測

采用聚合酶鏈式反應(yīng)(Polymerase chain reaction，PCR)對抽提的DNA進行擴增。引物由上海英駿生物技術(shù)有限公司合成。引物：5’-GGC GTT GCC GCT CTG AAT GC-3’(上游)；5’-GAG GGA CTG AGC TGG ACA ACC AC-3’(下游)。PCR反應(yīng)體系，為20 μL體系，基因組DNA約100 ng，2×GC緩沖液10 μL，2.5 mmol/L dNTP 2μL，10 pmol/L上、下游引物各1 μL，Taq DNA聚合酶1 U。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性4 min；每一循環(huán)中95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸45 s，10個循環(huán)；95℃變性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸4 min 5 s，20個循環(huán)；72℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物4℃保存，24 h內(nèi)進行凝膠電泳。取上述PCR產(chǎn)物5 μL進行12%的聚丙烯酰胺凝膠電泳，置凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。

1.2.2.2 5-HT1AR C(-1019)G位點檢測

將DNA通過PCR進行擴增，引物：5’-GTT GTT TAC CTC TCC TTG TCC-3’(上游)；5’-TAA ATC GTG TCA GCA TCC C-3’(下游)。PCR反應(yīng)體系：為25 μL，其中含有60 ng基因組DNA，5 pmol/L dNTPs，4 pmol/L引物，10×PCR緩沖液和2 U Taq DNA聚合酶。PCR反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5 min；每一循環(huán)中94℃預(yù)變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，35個循環(huán)；72℃延伸10 min。然后于4℃保存。采用DNA測序技術(shù)檢測5-HT1AR C(-1019)G基因多態(tài)性。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 19.0進行統(tǒng)計分析，應(yīng)用UNPHASED軟件分析基因多態(tài)性間的聯(lián)合作用與抑郁癥的關(guān)系。Hardy-Weinberg遺傳平衡采用擬合優(yōu)度χ2檢驗，兩組間基因分布頻率比較采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結(jié) 果

2.1 Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗

1/1代表野生純合基因型，1/2代表雜合基因型，2/2代表突變純合基因型，兩組的5-HTT LPR(χ2=1.703，P=0.192；χ2=3.203，P=0.074)和5-HT1AR C(-1019)G(χ2=2.661，P=0.103；χ2=0.267，P=0.605)多態(tài)性均符合H-W平衡(P均>0.05)。見表1。

2.2 5-HTT LPR與5-HT1AR C(-1019)G多態(tài)性位點基因型和等位基因頻率分布

兩組5-HTT LPR和5-HT1AR C(-1019)G多態(tài)性位點基因型及等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)。見表2。

2.3 5-HTT LPR和5-HT1AR C(-1019)G聯(lián)合作用對重性抑郁癥的影響

5-HTT LPR和5-HT1AR C(-1019)G各等位基因組合中，G-S等位基因組合在兩組的頻率分布差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.022)，經(jīng)置換檢驗(permutation)進行10 000次校正檢驗后，GlobalP值為0.0388，OR=1.909。見表3。

注：5-HTT LPR多態(tài)性位點中1/1是LL型，1/2是LS型，2/2是SS型；5-HT1AR C(-1019)G多態(tài)性位點中1/1是CC型，1/2是CG型，2/2是GG型

表2 兩組5-HTT LPR和5-HT1AR C(-1019)G基因型及等位基因頻率分布

注：LL、LS、SS、CC、CG、GG為基因型；L、S、C、G為等位基因

表3 兩組5-HTT LPR和5-HT1AR C(-1019)G等位基因組合頻率分布比較

3 討 論

大量研究表明，5-HTT和5-HT1AR基因是抑郁癥的重要候選基因，目前抑郁癥發(fā)病機制的研究主要集中在5-HTT LPR和5-HT1AR C(-1019)G多態(tài)性上[2-4]。目前國內(nèi)外關(guān)于5-HTT LPR在抑郁癥發(fā)病中的作用結(jié)果報道不一致。本研究結(jié)果顯示患者組和對照組5-HTT LPR各基因型及等位基因分布頻率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P均>0.05)，提示5-HTT LPR可能與重性抑郁癥的發(fā)病無關(guān)，這與既往一些研究結(jié)果一致[5-10]。肖紅等[11]認為5-HTT LPR與抑郁癥的發(fā)病不存在相關(guān)性，但與抑郁癥的嚴重程度相關(guān)，攜帶SS基因型抑郁癥患者的嚴重程度高于LL基因型者，與Kohen等[12]的觀點一致。而Bellivier等[13]研究認為抑郁嚴重程度與5-HTT LPR不相關(guān)。薈萃分析結(jié)果表明，5-HTT LPR多態(tài)性與抑郁癥有關(guān)，但在不同種族中的研究結(jié)果有所差異，如在歐洲人群中SS基因型是抑郁癥的危險基因型，但亞洲人群該基因型卻與抑郁癥的發(fā)病無相關(guān)性[14-15]。Eley等[16]在抑郁癥中探討了5-HTT基因和環(huán)境的交互作用，發(fā)現(xiàn)女性患者中SS基因型和高環(huán)境危險性是抑郁癥發(fā)生的風(fēng)險因素，但Willeit等[17]發(fā)現(xiàn)L等位基因與抑郁癥的發(fā)病有關(guān)。

關(guān)于5-HT1AR C(-1019)G多態(tài)性與抑郁癥相關(guān)性的研究較少，目前亦無定論。本研究結(jié)果顯示，5-HT1AR C(-1019)G的基因型及等位基因分布在患者組和對照組間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義，說明5-HT1AR C(-1019)G多態(tài)性與重性抑郁癥的發(fā)生可能無關(guān)，與在西班牙重性抑郁患者中的研究結(jié)果一致[18]。Huang等[19]也未發(fā)現(xiàn)此位點多態(tài)性與單相抑郁癥、雙相抑郁癥及自殺傾向之間有明顯相關(guān)。而Lemonde等[20]對加拿大患者中的研究結(jié)果顯示，抑郁癥組G等位基因頻率高于健康對照組，抑郁癥組純合GG基因型在患者組中的頻率是健康對照組的2倍，說明5-HT1AR C(-1019)G基因位點多態(tài)性和重性抑郁癥有很大關(guān)聯(lián)。有研究在健康人中發(fā)現(xiàn)了5-HT1AR C(-1019)G基因位點存在種族差異性，如在歐洲白種人中，C等位頻率為61.2%[21]，而在本研究中，C等位基因頻率為77.2%。本研究與既往研究結(jié)果的差異可能是5-HT1AR C(-1019)G基因位點具有種族差異性所致。

抑郁癥是多基因疾病，有許多潛在的候選基因，因此，本研究把重點放在多個微效基因的聯(lián)合作用上。目前關(guān)于5-HTT、5-HT1AR基因聯(lián)合作用與重性抑郁癥相關(guān)研究的報道不多，Neumeister等[22]在一篇綜述中提到5-HTT和5-HT1AR多基因間的聯(lián)合效應(yīng)可能與抑郁癥有關(guān)。Barbara等[23]對西班牙重性抑郁癥患者中的研究顯示，5-HT1AR C(-1019)G和5-HTT LPR聯(lián)合會影響西酞普蘭療效，危險基因聯(lián)合(SS-GG)攜帶者對西酞普蘭的臨床療效差。本研究通過UNPHASED軟件分析得出校正后的GlobalP值，降低了假陽性結(jié)果的出現(xiàn)。本研究結(jié)果顯示，5-HTT LPR和5-HT1AR C(-1019)G兩個位點多態(tài)性的單個位點與重性抑郁癥的發(fā)生無關(guān)，但兩個位點之間的聯(lián)合與重性抑郁癥的發(fā)生有關(guān)。G-S等位基因組合的頻率在患者組中高于對照組(P=0.022)，以C-L為參照，G-S的OR值為1.909，提示G-S等位基因組合有增加重性抑郁癥發(fā)病的危險性。這可能是由于啟動子決定基因的表達，G等位基因削弱轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子對基因表達的抑制作用，增加5-HT1A自身受體的表達，從而減少5-HT傳遞[22]。S等位基因通過減少基因的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達而使5-HT的回吸收率減少。

基因多態(tài)性與抑郁癥相關(guān)性研究結(jié)果不一致的原因，可能是因為抑郁癥屬于復(fù)雜疾病，發(fā)病受多個易感基因和環(huán)境的共同影響，每一個致病基因單獨所起的作用較小。這幾個基因多態(tài)性也可能與附近功能多態(tài)性之間存在連鎖不平衡，并通過多態(tài)性間的效應(yīng)聯(lián)合而發(fā)揮作用。種族差異使種族間的單倍體域大小可能不一樣，一些基因多態(tài)性在種族中還具有影響轉(zhuǎn)錄活性的不同亞型，以至于一項研究結(jié)果很難在其他的種族中得到驗證。本研究由于樣本量偏小，所檢測的多態(tài)性位點少，統(tǒng)計效能比較低，因此不排除假陽性結(jié)果的可能。本研究初步探討遺傳改變與抑郁癥的關(guān)系，未來應(yīng)在大樣本量的基礎(chǔ)上，對5-HTT和5-HT1AR上可能和抑郁癥有關(guān)的所有多態(tài)性位點進行檢測，并結(jié)合功能影像學(xué)等研究進展，綜合考慮、系統(tǒng)分析，以進一步闡明5-HTT和5-HT1AR基因與抑郁癥的關(guān)系。

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(本文編輯：唐雪莉)

Association between the combination of serotonin transporter gene-linked polymorphic region (5-HTT LPR) and serotonin 1A receptor gene C(-1019)G polymorphism with major depressive disorder

GuanXiaoni1,ZhangKerang2,CuiYong1,XueDewang1,DuanHongqiu1,LyuGuangyou1,XiuMeihong1*

(1.BeijingHuiLongGuanHospital,Beijing100096,China; 2.FirstHospitalofShanxiMedicalUniversity,Taiyuan030001,China*Correspondingauthor:XiuMeihong,E-mail:xiumeihong97@163.com)

Objective To investigate the relationship between the combination of 5-HTT LPR and 5-HT1AR C(-1019)G gene polymorphism with major depressive disorder.Methods The case-control study design was adopted in the study. 197 Chinese Han origin patients with major depressive disorder who came from the First Hospital of Shanxi Medical University from October 2005 to May 2007 were recruited as patient group. At the same time, 197 healthy controls matched age and sex frequencies with patient group from the same hospital were included the control group. Polymerase chain reaction (PCR), sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and DNA sequencing analysis were used to detect the genotype of 5-HTT LPR and 5-HT1AR C(-1019)G in two groups. The UNPHASED software was used for statistical analysis.Results There was no significant differences of the distribution of genotype and alleles of 5-HTT LPR, 5-HT1AR C(-1019)G between two groups (allP>0.05). The gene combination analysis indicated that the frequency of G-S allele combination in patient group was significantly higher than that in the control group (21.4% vs. 12.4%,P=0.022). Conclusion This study suggest that the combination of 5-HTT LPR and 5-HT1AR C (-1019) G gene polymorphism is closely related with major depressive disorder in Chinese Han origin. The G-S allele combination may increase the risk of morbidity of major depressive disorder．

Depressive disorder; Serotonin transporter; Serotonin 1A receptor; Gene polymorphism

R749.4

A

10.11886/j.issn.1007-3256.2017.03.010

2016-09-13)

*通信作者：修梅紅，E-mail: xiumeihong97@163.com)