擬南芥AGO基因家族分析及鹽脅迫下的表達驗證

岳路明，宋劍波,,3，徐曉峰，楊海奇，莫小為，宋 軍，莫蓓莘

1) 深圳大學生命與海洋科學學院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳518060；2) 深圳大學光電工程學院，廣東深圳518060；3) 江西農(nóng)業(yè)大學理學院，江西南昌330045；4) 深圳大學生命與海洋科學學院，廣東省表觀遺傳學重點實驗室，廣東深圳518060

【生物工程 / Bioengineering】

擬南芥AGO基因家族分析及鹽脅迫下的表達驗證

岳路明1，宋劍波1,2,3，徐曉峰4，楊海奇1，莫小為4，宋 軍2，莫蓓莘1

1) 深圳大學生命與海洋科學學院，深圳市微生物基因工程重點實驗室，廣東深圳518060；2) 深圳大學光電工程學院，廣東深圳518060；3) 江西農(nóng)業(yè)大學理學院，江西南昌330045；4) 深圳大學生命與海洋科學學院，廣東省表觀遺傳學重點實驗室，廣東深圳518060

argonaute(AGO)蛋白家族成員在小核糖核酸(RNA)介導的轉錄后調控中有重要作用．通過擬南芥AGO蛋白家族的結構域及各類植物中的AGO蛋白的進化關系進行分析，發(fā)現(xiàn)AGO蛋白在植物中結構和進化相對保守．根據(jù)已有的芯片數(shù)據(jù)，對擬南芥中AGO蛋白家族的組織表達進行分析，發(fā)現(xiàn)某些AGO基因具有組織表達的特異性．進一步通過基因上游啟動子響應元件分析，以及鹽等脅迫下的芯片和反轉錄聚合酶鏈式反應(RT-PCR)實驗數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)AGO2、AGO3和AGO7等基因受到鹽等非生物脅迫的誘導表達．初步探明了擬南芥中AGO基因家族在鹽脅迫下的差異表達規(guī)律．

植物生理學；擬南芥；小核糖核酸；argonaute蛋白；轉錄后調控；非生物脅迫

argonaute(AGO)蛋白是核糖核酸(ribonucleicacid,RNA)介導的轉錄后基因調控復合物 (RNA-inducedsilencingcomplex,RISC)的重要蛋白，由于AGO基因突變會導致擬南芥葉子呈管狀，形似八爪魚，故取名argonaute蛋白，簡稱AGO蛋白．AGO蛋白被Bohmert等[1]首次在擬南芥中發(fā)現(xiàn)后，該類蛋白相繼在細菌(bacteria)、 古細菌(pyrococcusfuriosus)和真菌(eubacteria)中被發(fā)現(xiàn)[2]，表明AGO蛋白廣泛存在于各種生物中．由于完整的AGO蛋白很難表達和結晶[3]，直到2003年，才有科學家從低等生物古細菌[4]和真細菌[5]中解析出AGO蛋白的晶體結構．AGO蛋白由N-端可變結構域、保守的PAZ(piwi-argonaute-zwue)結構域、中間連接結構域和PIWI結構域組成[6]．

AGO蛋白結構的多樣性導致其功能的差異性．初期研究發(fā)現(xiàn)，植物AGO1基因的突變會影響轉錄后沉默和對病毒的抗性[7]．在植物中，小RNA會與AGO1蛋白形成RISC復合體，進一步對靶標信使RNA(messengerRNA,mRNA)進行剪切[8]．最新研究發(fā)現(xiàn)，擬南芥中的AGO1[9]、AGO2[10]、AGO4[11]、AGO7[12]和AGO10[13]都能切割靶標基因．在功能上，AGO蛋白參與植物生長發(fā)育的調控．研究還發(fā)現(xiàn)AGO蛋白的催化活性對于胚胎的早期發(fā)育至關重要[14]．另外，AGO蛋白還參與調控植物逆境脅迫的應答．例如在煙草中，AGO1的差異表達能夠改變植物對病毒感染的耐受能力，使遭受病毒侵染的煙草不僅恢復性狀，同時還增強了冷脅迫的耐受能力[15]．在豌豆中，菜豌豆的P68蛋白(Pisumsativump68，PSP68)作為非生物氧化和應激反應通路的分子開關，通過與AGO1蛋白相互作用，可改善作物對逆境的耐受性[15]．另外，AGO蛋白還有些特殊功能，例如AGO蛋白能與某些mirtron微小RNA(MicroRNA,miRNA)相結合，作用于靶標mRNA的3′非編碼區(qū)(untranslatedregions,UTR)，進行基因表達的調控，這可能是一種新的基因表達調控模式[16]．

可見，AGO蛋白在生物體內(nèi)作為一個保守的基因家族，可能參與非生物脅迫等多種生物調控．本研究對植物中AGO蛋白的結構域和進化關系、擬南芥中AGO基因的組織表達以及在各類非生物脅迫下表達分析，初步探明了在鹽等非生物脅迫下，AGO基因家族的差異表達模式．

1 材料與方法

1.1 植物材料及相關數(shù)據(jù)來源 擬南芥(ArabidopisisthalianaCol)種子由加州大學陳雪梅教授惠贈．擬南芥AGO基因及AGO蛋白序列信息從擬南芥信息資源網(wǎng)站(http://www.arabidopsis.org/)下載； 其他物種蛋白信息從植物基因組學網(wǎng)站(https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html)獲得．

1.2 擬南芥AGO蛋白的序列分析

利用MEGA6.0 軟件neighbor-joining法則的P-距離(P-distance)模型構建進化樹，Bootstrapmethod值為1 000．利用EMBL-EBI計算平臺(http://pfam.xfam.org/)對擬南芥的結構域進行分析． 采用PlantCARE軟件(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)分析啟動子脅迫元件．利用擬南芥數(shù)據(jù)庫e-FPBrowser(http://bbc.botany.utoronto.ca/efp)上的AGO基因相對表達信息和脅迫條件下的表達信息，通過Mev生物學軟件構建AGO基因組織表達芯片和AGO基因在脅迫下的表達芯片．

1.3 鹽脅迫下AGO基因的表達分析

擬南芥幼苗在霍格蘭德營養(yǎng)液中培養(yǎng)兩周后轉移到含150 mmol/L氯化鈉的霍格蘭德營養(yǎng)液中，分別處理0、3、6和12 h，收取3個生物學重復．利用Trizol法提取RNA，反轉錄成cDNA，設計10種AGO基因的RT-PCR(realtimefluorescencequantitativePCR，RT-PCR)引物(表1)分析鹽脅迫處理不同時間后樣品中AGO基因表達量的變化.

表1 RT-PCR檢測AGO基因表達引物序列

2 結果與分析

2.1 AGO家族的進化樹分析

圖1 AGO蛋白的進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of AGO proteins

通過構建系統(tǒng)進化樹分析擬南芥(Arabidopisisthaliana, At)、 無油樟(Amborellatrichopoda, Ad)、 苜蓿(Medicagotrancatula, Mt)、 衣藻(Chlamy-domonastrichopoda, Cr)、 水稻(Oryzasativa, Os)、 毛果楊(Populustrichocarpa, Pt)、 小立碗蘚(Physcomitrellapatens, Pp)和卷柏(Selaginellameellendorffii, Sm)等植物中AGO基因家族的進化關系(圖1)，同時構建擬南芥中AGO蛋白的結構域分布圖(圖2)．結果發(fā)現(xiàn)萊茵衣藻、小立碗蘚、擬南芥和水稻分別有3、6、10和19種AGO蛋白同源基因．這說明隨著進化程度的升高，植物中AGO蛋白的數(shù)目和種類也不斷增加．另外，AGO蛋白根據(jù)其在植物中的進化關系分為2類[17]. 在擬南芥中，屬于第1類蛋白的有AGO1、AGO5和AGO10，結構上都包含Mid結構域，并且AGO1還包含了特殊的甘氨酸富集結構域；AGO2、AGO3和AGO7以及AGO4、AGO6、AGO8和AGO9分別屬于第2和第3類蛋白．在擬南芥中，AGO1所形成的RISC復合體是小RNA發(fā)揮剪切功能的重要場所．從進化樹上可以看到，該AGO蛋白在水稻、毛果楊、卷柏和小立碗蘚中都有親緣關系很近的同源基因(圖1)．

圖2 擬南芥AGO蛋白的結構域Fig.2 Domain of AtAGO proteins

2.2AGO基因在植物中的組織表達分析

為探明AGO基因在植物各組織中的表達情況，從擬南芥數(shù)據(jù)庫e-FPBrowser中獲取了9種AGO基因的表達信息(AGO8除外)．分析發(fā)現(xiàn)AGO基本表達呈現(xiàn)以下規(guī)律：AGO1為組成型表達，除成熟花粉外，其他組織中表達較高；AGO2和AGO3在種子中表達較高，其他組織中表達較低；AGO4除在萼片中沒有表達外，其他組織中都有表達；AGO5、AGO7、AGO9和AGO10在花和種子中表達較高；AGO6植株中整體表達較低(圖3)．以上結果說明AGO基因家族存在明顯的組織表達差異性．

2.3 脅迫相關的啟動子元件分析

通過在線分析軟件PlantCARE分析AGO基因轉錄起始位點上游2 000堿基對(basepair，bp)的啟動子序列，發(fā)現(xiàn)含有很多非生物響應相關元件(表2)．例如，所有AGO基因中都含有厭氧誘導的響應元件，其中AGO2啟動子中含有11個厭氧誘導脅迫元件；含3個以上同一種脅迫元件的有AGO2、AGO3、AGO6和AGO9， 其中AGO3基因含ABA應答元件、厭氧誘導元件等多種脅迫元件，且數(shù)目都在3個以上；以上結果說明AGO基因很可能參與非生物脅迫應答．

2.4AGO蛋白在非生物脅迫下的基因芯片分析

為了進一步探明擬南芥AGO蛋白與非生物脅迫之間的關系，根據(jù)已有的芯片數(shù)據(jù)，對AGO基因家族(AGO6和AGO8除外)在脅迫下的表達情況進行分析(圖4)，發(fā)現(xiàn)某些AGO基因對非生物脅迫有響應．例如AGO2受基因毒性脅迫誘導表達強烈，且在根部受紫外損傷脅迫誘導表達明顯；AGO3在地上部分受冷害、鹽和滲透脅迫誘導表達；AGO7受氧化、鹽和紫外脅迫誘導表達．相反，也有一些AGO基因在脅迫下，表達下調．例如AGO4在基因毒性、熱、鹽、紫外和機械損傷脅迫下，基因表達下調明顯；AGO9在干旱、滲透、鹽和紫外脅迫下，表達下調；AGO10在紫外和機械損傷脅迫下表達下調．另外，AGO1屬于組成型表達，所以在各種條件下表達都比較高(圖4)．綜上所述，某些AGO基因在逆境脅迫下有著明顯的差異表達．

圖3 AGO在擬南芥各個組織中的表達Fig.3 Expression profiles of AtAGO genes in various tissues

2.5 AGO蛋白在鹽脅迫下的表達分析

為進一步驗證上述AGO基因受到脅迫誘導表達，通過RT-PCR對擬南芥中10種AGO基因在鹽脅迫下的表達進行了分析(圖5)．結果發(fā)現(xiàn)，AGO2、AGO3和AGO7在鹽脅迫下被誘導表達強烈，這與芯片數(shù)據(jù)一致；而AGO8基因處理前與處理后皆無信號，說明其在擬南芥中是一個假基因. 總之，通過芯片及RT-PCR的實驗數(shù)據(jù)說明部分AGO基因受到環(huán)境脅迫的誘導表達，這說明AGO蛋白可能在植物遭受逆境時，發(fā)揮一些特殊功能．

表2 擬南芥AGO基因脅迫相關的啟動子元件分析

圖4 擬南芥AGO基因在非生物脅迫下的芯片數(shù)據(jù)分析Fig.4 The microarray data of AtAGOs under abiotic stress

圖5 擬南芥AGO基因在鹽脅迫下的表達分析Fig.5 The relative expression of AtAGOs under salt stress

3 討 論

本研究歸納了AGO基因的結構特點、進化特點及受鹽等非生物脅迫的表達規(guī)律．結構與進化上，10種AGO蛋白均含有4個結構域．PAZ結構域和連接結構域形成的口袋更容易與呈酸性的小RNA 3′末端和5′末端相結合．AGO蛋白的進化分類與AGO蛋白的結構與功能關系密切，從親緣關系上AGO蛋白可以分為3大類，第1類與擬南芥中的AGO1蛋白結構相似，故又稱AGO同源蛋白；第2類與果蠅中的PIWI蛋白結構類似，故將其統(tǒng)稱為PIWI同源蛋白；第3類最先在蠕蟲中發(fā)現(xiàn)，它們具有結合siRNA的能力[20]．功能上，以AGO蛋白為主要成分的RISC復合體與DCL蛋白家族協(xié)同作用，參與轉錄后基因表達的調控．但是每種AGO蛋白的功能又有所不同，所以發(fā)揮作用的組織和亞細胞區(qū)域也不完全相同．AGO蛋白在花粉中的表達量普遍偏低，但AGO9基因在花粉中的表達量很高．有研究表明，AGO9主要在生殖細胞的伴胞細胞中表達，參與次級卵母細胞的產(chǎn)生與DNA的修復[21]，并在卵細胞分化的過程中起到重要的作用[22]．大多數(shù)AGO基因的表達主要集中在花器官中，表明這些AGO蛋白在生殖發(fā)育中也發(fā)揮著重要的作用．

雖然之前很多研究表明，AGO蛋白通過轉錄后調控影響植物的生長發(fā)育．但近年研究表明，AGO蛋白也參與了某些脅迫反應的調控．如AGO3基因可以響應鹽脅迫，并在鹽脅迫下表達上調[20]．對AGO基因的啟動子元件分析發(fā)現(xiàn)，AGO基因啟動子中都含有與脅迫相關的元件．這說明AGO蛋白不僅在植物生長發(fā)育過程中發(fā)揮重要的作用，且在逆境脅迫中也可能發(fā)揮作用．RT-PCR的結果顯示在鹽脅迫下，擬南芥AGO2、AGO3和AGO7基因的表達上調明顯，說明這些蛋白可能在植物遭受逆境時，能發(fā)揮一些特殊功能．但AGO基因參與植物脅迫相應調控的分子機制尚不清楚，有待進一步研究．

/ References：

[1] Bohmert K, Bellini C, Bouchez D, et al. AGO1 defines a novel locus ofArabidopsiscontrollingleafdevelopment[J].EmboJournal,1998,17(1):170-180.

[2]Rodríguez-LealD,Castillo-CobiánA,Rodríguez-ArévaloI,etal.Aprimarysequenceanalysisoftheargonauteproteinfamilyinplants[J].FrontiersinPlantScience, 2016,7:01347.

[3]HallTMT.Structureandfunctionofargonauteproteins[J].Structure, 2005,13(10):1403-1408.

[4]SongJJ.CrystalstructureofargonauteanditsimplicationsforRISCsliceractivity[J].Science, 2004,305(5689):1434-1437.

[5]YuanYuren,PeiYi,MaJinbao,etal.CrystalstructureofA.aeolicusargonaute,asite-specificDNA-guidedendoribonuclease,providesinsightsintoRISC-mediatedmRNAcleavage[J].MolecularCell, 2005,19(3):405-419.

[6]RivasFV,ToliaNH,SongJJ,etal.Purifiedargonaute2andansiRNAformrecombinanthumanRISC[J].NatureStructural&MolecularBiology, 2005,12(4):340-349.

[7]MorelJB.Fertilehypomorphicargibayte(ago1)mutantsimpairedinpost-transcriptionalgenesilencingandvirusresistance[J].ThePlantCellOnline, 2002,14(3):629-639.

[8] 馬 軒,李盛本,莫蓓莘,等.擬南芥ago1-27突變體的RNA-seq分析[J].深圳大學學報理工版, 2017,34(1):27-32.MaXuan,LiShengben,MoBeixin,etal.RNA-seqanalysisonArabidopsisago1-27mutant[J].JournalofShenzhenUniversityScienceandEngineering,2017,34(1):27-32.(inChinese)

[9]DerghalA,DjelloulM,TrouslardJ,etal.Anemergingroleofmicro-RNAintheeffectoftheendocrinedisruptors[J].FrontiersinNeuroscience, 2016,10:00318.

[10]ConnertyP,AhadiA,HutvagnerG.RNAbindingproteinsinthemiRNApathway[J].InternationalJournalofMolecularSciences, 2016,17(1):31.

[11]KobayashiH,TomariY.RISCassembly:coordinationbetweensmallRNAsandargonauteproteins[J].BiochimicaetBiophysicaActa(BBA)-GeneRegulatoryMechanisms, 2016,1859(1):71-81.

[12]TaiowaA.Montgomery,MiyaD.Howell,etal.Specificityofargonaute7-miR390interactionanddualfunctionalityinTAS3trans-actingsiRNAformation[J].Cell,2008,133(1):128-141.

[13]RoodbarkelariF,DuF,TruernitE,etal.ZLL/AGO10maintainsshootmeristemstemcellsduringArabidopsisembryogenesisbydown-regulatingARF2-mediatedauxinresponse[J].BMCBiology, 2015,13(1) :74.

[14]Gerson-GurwitzA,WangS,SatheS,etal.AsmallRNA-catalyticargonautepathwaytunesgermlinetranscriptlevelstoensureembryonicdivisions[J].Cell, 2016,165(2):396-409.

[15]BanuMSA,HudaKMK,SahooRK,etal.Peap68impartssalinitystresstoleranceinricebyscavengingofROS-mediatedH2O2andinteractswithargonaute[J].PlantMolecularBiologyReporter, 2015,33(2):221-238.

[16]HansenTB,VenφMT,JensenTI,etal.Argonaute-associatedshortintronsareanovelclassofgeneregulators[J].NatureCommunications, 2016,7:11538.

[17]FangXiaofeng,QiYijun.RNAiinplants:anargonaute-centeredview[J].ThePlantCell, 2016,28(2):272-285.

[18]ZhangZhonghui,LiuXiuying,GuoXinwei,etal.ArabidopsisAGO3predominantlyrecruits24-ntsmallRNAstoregulateepigeneticsilencing[J].NaturePlants, 2016,2(5):16049.

[19]WuestSE,VijverbergK,SchmidtA,etal.Arabidopsisfemalegametophytegeneexpressionmaprevealssimilaritiesbetweenplantandanimalgametes[J].CurrentBiology, 2010,20(6):506-512.

[20] 李 超，杜志游，陳集雙.解讀AGO蛋白結構及其功能[J]中國生物化學與分子生物學學報, 2009(11):969-976.LiChao,DuZhiyou,ChenJishuang.StructuralandfunctionalelucidationofAGOproteins[J].ChineseJournalofBiochemistryandMolecularBiology,2009(11):969-976.(inChinese)

[21]OliverC,SantosJL,PradilloMN.OntheroleofsomeargonauteproteinsinmeiosisandDNArepairinArabidopsisthaliana[J].FrontiersinPlantScience, 2014,5:5177.

[22]Rodríguez-LealD,León-MartínezG,Abad-ViveroU,etal.NaturalvariationinepigeneticpathwaysaffectsthespecificationoffemalegameteprecursorsinArabidopsis[J].ThePlantCell, 2015,27(4):1034-1045.

【中文責編：晨 兮；英文責編：艾 琳】

2017-01-04；Accepted：2017-03-27

Professor Mo Beixin. E-mail: bmo@szu.edu.cn

Bioinformatical and experimental analysis ofAGOgenes in response to salt stress

Yue Luming1, Song Jianbo1,2,3, Xu Xiaofeng4, Yang Haiqi1, Mo Xiaowei4, Song Jun2, and Mo Beixin1

1) Shenzhen Key Laboratory of Microbial Genetic Engineering, College of Life and Oceanography, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China 2) College of Optoelectronic Engineering, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China 3) College of Science, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, Jiangxi Province, P.R.China 4)Guangdong Provincial Key Laboratory for Plant Epigenetics, College of Life and Oceanography, Shenzhen University, Shenzhen 518060, Guangdong Province, P.R.China

AGO family proteins play an important role in small RNA-mediated post-transcriptional regulation. Analyzing the domain and evolution of AGO family proteins in diverse plant species, we revealed that the structural organization of AGOs is evolutionally conserved between different plant species. Based on the experimental data, someAGOgeneswerespecificallyexpressedinvarioustissuesinArabidopsis.Sequenceanalysisshowedthatthereareabioticstressrelatedcis-actingelementsinthepromotorsofAGOgenes,microarrayandRT-PCRdataalsoindicatedtheexpressionsofAGO2,AGO3andAGO7genesareinducedundersaltandotherabioticstressconditions.ThisisthefirststudytodemonstratethedifferentialexpressionpatternsofAGOsundersaltstressinArabidopsis.

plant physiology;Arabidopsisthaliana;smallRNA;AGOproteins;post-transcriptionalregulation;abioticstress

：Yue Luming, Song Jianbo, Xu Xiaofeng, et al. Bioinformatical and experimental analysis ofAGOgenes in response to salt stress[J]. Journal of Shenzhen University Science and Engineering, 2017, 34(4): 352-357.(in Chinese)

Q

A

10.3724/SP.J.1249.2017.04352

國家自然科學基金資助項目(31571332; 31560076)

岳路明(1990—)， 男， 深圳大學碩士研究生.研究方向： 生物化學與分子生物學.E-mail： 1510211663@qq.com宋劍波(1983—)， 男， 深圳大學博士后研究人員、江西農(nóng)業(yè)大學講師. 研究方向：植物學與分子生物學.E-mail：thinkskier@163.com岳路明、宋劍波為共同第一作者.

Foundation：National Natural Science Foundation of China (31571332; 31560076)

引 文：岳路明，宋劍波，徐曉峰，等. 擬南芥AGO基因家族分析及鹽脅迫下的表達驗證[J]. 深圳大學學報理工版，2017，34(4)：352-357.