蛆癥異蚤蠅幼期石蠟切片的制備

馮典興, 關(guān)明慧, 賈志紅, 杜新麗, 岳國華, 肖順圓(沈陽大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 遼寧 沈陽 110044)

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蛆癥異蚤蠅幼期石蠟切片的制備

馮典興, 關(guān)明慧, 賈志紅, 杜新麗, 岳國華, 肖順圓
(沈陽大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院, 遼寧 沈陽 110044)

探討適合蛆癥異蚤蠅幼期的石蠟切片制作方法,并對其幼期內(nèi)部主要組織結(jié)構(gòu)進行了觀察.結(jié)果顯示,Carnoy固定液(V(無水乙醇)∶V(氯仿)∶V(冰醋酸)=6∶3∶1)適于蛆癥異蚤蠅幼期的固定.將蛹頭部或整體蛹殼剝離,有利于固定、脫水和包埋,蛹需過夜浸蠟.在切片上可清楚的顯示3齡幼蟲的口器、唾液腺、脂肪體、中腸以及36 h蛹的腦組織、復(fù)眼、卵巢和腹部肌肉等主要內(nèi)部結(jié)構(gòu).

蛆癥異蚤蠅; 石蠟切片; 幼期

蛆癥異蚤蠅Megaseliascalaris(Loew)隸屬于雙翅目Diptera、蚤蠅科Phoridae、裂蚤蠅亞科Metopininae、異蚤蠅屬MegaseliaRondani.該物種主要生活于熱帶和亞熱帶,也分布于溫帶地區(qū);隨著人類的經(jīng)濟活動, 已遍布世界各大區(qū)[1].它是一種重要的法醫(yī)昆蟲,通常是第一批次出現(xiàn)在相對密閉空間人尸體上的蠅類[2-5].Reibe和Madea認為在密閉的室內(nèi)條件下,利用蛆癥異蚤蠅Megaseliascalaris(Loew)估計死亡時間(post-mortem interval,PMI)要比麗蠅更準確,因為麗蠅很難進入到密閉的室內(nèi).在麗蠅活動能力遲緩的溫度下,蛆癥異蚤蠅也是一個很好的選擇[6].

目前,蛆癥異蚤蠅已建立發(fā)育歷期、基于外部形態(tài)的幼蟲發(fā)育速率和蛹發(fā)育資料[7-9].但對于一些外部形態(tài)變化不明顯的時期,如幼蟲的離食期、蛹早期、蛹黃眼期等,推斷日齡還有困難,但在這些時期其內(nèi)部組織器官可能存在明顯變化,常規(guī)解剖會破壞標本內(nèi)部結(jié)構(gòu)造成無法觀察,而利用組織切片技術(shù)可實現(xiàn)對內(nèi)部組織器官連續(xù)觀察,鑒于此,本研究旨在建立適于癥異蚤蠅幼期組織切片的制作方法,為后續(xù)開展蛆癥異蚤蠅幼期內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)育形態(tài)隨時間的變化規(guī)律奠定基礎(chǔ).

1 材料和方法

1.1 材 料

蛆癥異蚤蠅Megaseliascalaris(Loew)為沈陽大學(xué)遼寧省城市有害生物治理與生態(tài)安全重點實驗室飼養(yǎng)的種群.

在24 ℃,相對濕度75%條件下,利用豬肉飼養(yǎng)蛆癥異蚤蠅Megaseliascalaris(Loew),收集3齡幼蟲和發(fā)育至36h的蛹作為試材,蛹去除頭部或整體的蛹殼.

1.2 方 法

參考了褚夢穎的方法[10],并作一定修改.

(1) 固定:按V(無水乙醇)∶V(氯仿)∶V(冰醋酸)=6∶3∶1或V(無水乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1制成Carnoy固定液,固定試材12 h以上.固定后可退回70%乙醇內(nèi)保存.

(2) 脫水:體積分數(shù)分別為70%、80%、90%、95%、100%(二次)的乙醇依次進行脫水,70%～95%乙醇分別脫水30 min,100%乙醇脫水15 min.

(3) 透明:體積分數(shù)分別 分別在二甲苯與乙醇體積比為1∶2、1∶1和2∶1的試劑中依次進行30 min透明處理,再放入純二甲苯中進行10 min兩次透明處理.

(4) 浸蠟:將透明后的試材放入Leica EG1150H包埋機內(nèi),溫度為60 ℃,先放入石蠟與二甲苯體積比為1∶1混合的左箱浸蠟2 h,再將其取出放入純石蠟右箱中浸蠟4 h,蛹需過夜.

(5) 包埋:將試材取出,用包埋盒包埋,轉(zhuǎn)移至Leica EG1150C冷卻臺(-6 ℃)上,待其完全冷卻凝固后,即可進行切片制作.

(6) 切片:將凝固好的蠟塊放在Leica RM2235切片機上,先將提前在體積分數(shù)為70%乙醇浸泡過夜的載玻片預(yù)熱,再用蛋清、甘油與水楊酸鈉按50 mL∶50 mL∶1 g的比例制成的貼片劑的均勻地涂在載玻片上,然后將連續(xù)切片貼在其上.切片厚度7～8 μm.

(7) 干燥:將切片在37 ℃干燥箱中干燥12 h.

(8) 染色:將干燥好的切片依次用純二甲苯Ⅰ、純二甲苯Ⅱ、純二甲苯Ⅲ、體積分數(shù)分別為100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、95%乙醇、90%乙醇、80%乙醇、70%乙醇、蒸餾水浸泡切片各5 min;之后是蘇木精染液5 min,返藍液1 min,分化液1 min,伊紅染液2 min進行染色;其次是蒸餾水、體積分數(shù)分別為70%乙醇、80%乙醇、90%乙醇、95%乙醇、100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ、純二甲苯Ⅰ、純二甲苯Ⅱ、純二甲苯Ⅲ浸泡各5 min.

(9) 封片與干燥:切片染色完成,用樹膠將蓋玻片粘于載玻片上,完成封片.將封好的切片放在室溫條件下干燥24 h以上.

(10) 鏡檢觀察:將干燥好的組織切片放在Olympus BX41顯微鏡下進行觀察,并利用Olympus DP71成像系統(tǒng)拍照.

2 實驗結(jié)果

本研究在褚夢穎的方法基礎(chǔ)上作了一定的修改,通過比較發(fā)現(xiàn)Carnoy固定液采用V(無水乙醇)∶V(氯仿)∶V(冰醋酸)=6∶3∶1,效果好于V(無水乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1,固定迅速.樣本經(jīng)二甲苯與乙醇按1∶2,1∶1和2∶1比例配制成的溶液依次進行透明,通過延長浸蠟時間,特別是蛹浸蠟過夜,可有效防止脫片.通過上述方法的改進制備了干凈、清晰的幼蟲和蛹早期切片.對于3齡取食期的幼蟲,可觀察到一對唾液腺、大量的脂肪體、肌肉、表皮和中腸等主要結(jié)構(gòu)(見圖1),也可以觀察到口器,如圖1插圖箭頭所示.

圖1 3齡幼蟲內(nèi)部主要結(jié)構(gòu)
Fig.1 The main structures inside the 3 instar larva
C—口器; SG—唾液腺; EP—脂肪體; M—肌肉; CU—表皮; MG—中腸.

對發(fā)育至36 h雌蛹的切片進行觀察,可見腹部分層,如圖2a箭頭所示,腦組織逐漸形成,形狀已不同于幼蟲階段的神經(jīng)節(jié),可見復(fù)眼(見圖2b),氣管貫穿整個蟲體(見圖2c);在腹部可見一對較大的卵巢(見圖2d),腹部兩側(cè)出現(xiàn)肌肉(見圖2e).

圖2 36h蛹內(nèi)部主要結(jié)構(gòu)Fig.2 The main structures inside the 36h pupa(a)—胸腹部; (b)和(c)—頭部; (d)和(e)—腹部; BT—腦組織; CE—復(fù)眼; T—氣管; O—卵巢; M—肌肉.

3 結(jié) 論

蠅類幼蟲和蛹是案發(fā)現(xiàn)場經(jīng)常發(fā)現(xiàn)的蟲態(tài),建立其詳細的發(fā)育資料將會使利用其發(fā)育規(guī)律推斷PMI更為準確.對于蛆癥異蚤蠅目前缺乏幼期內(nèi)部發(fā)育資料.石蠟切片技術(shù)可實現(xiàn)對幼期內(nèi)部組織結(jié)構(gòu)的觀察.由于蚤蠅幼蟲表皮和蛹殼的阻隔,對固定、透明、浸蠟這些步驟都會產(chǎn)生一定的影響,常會導(dǎo)致脫片現(xiàn)象的發(fā)生,所以制作切片難度要大于成蟲.本研究參考了褚夢穎的方法[10],并在固定、透明、浸蠟步驟作了修改,Carnoy固定液采用V(無水乙醇)∶V(氯仿)∶V(冰醋酸)=6∶3∶1,效果好于V(無水乙醇)∶V(冰醋酸)=3∶1,固定迅速,短時間內(nèi)即可起到固定的作用,否則蛹還可以繼續(xù)發(fā)育.對于大型蠅類,往往需要將整體切割成2～3段再制片[11].而蚤蠅個體較小,可實現(xiàn)對其整體進行切片研究.但為了取得較好的切片,對于蛹,特別是呼吸角伸出后的蛹,將頭部或整體蛹殼剝離,有利于后續(xù)的實驗操作.為了使蠟?zāi)苓M入組織,幼蟲和蛹浸蠟的時間較長,特別是蛹,需過夜. 3齡幼蟲階段內(nèi)部結(jié)構(gòu)變化不明顯,未發(fā)現(xiàn)性腺,但在36 h雌蛹內(nèi)可見一對發(fā)育較成熟的卵巢,其經(jīng)歷了由0～36 h不斷變大的過程,可作為蛹早期日齡推斷的指標.蛹腦組織的形狀也不同于幼蟲,它的改變也可以作為一個時間節(jié)點用于日齡的推斷.此外,腹部肌肉的出現(xiàn)也是一個很好的指標.

[ 1 ] DISNEY R H. Natural history of the scuttle fly,Megaseliascalaris[J]. Annual Review of Entomology, 2008,53(53):39-60.

[ 2 ] SMITH K G V. A manual of forensic entomology[J]. American Journal of Archaeology, 1986,92(2):287.

[ 3 ] GREENBERG B,WELLS J D. Forensic use ofMegaseliaabditaand M. scalaris (Phoridae: Diptera): case studies, development rates, and egg structure[J]. Journal of Medical Entomology, 1998,35(3):205-209.

[ 4 ] SUKONTASON K,SUKONTASON K,VICHAIRAT K,et al. The first documented forensic entomology case in Thailand[J]. Journal of Medical Entomology, 2015,38(5):746-748.

[ 5 ] OLIVA A. Insects of forensic interest in Buenos Aires (Argentina)[J]. Addenda et corrigenda, 2004,1:43-50.

[ 6 ] REIBE S,MADEA B. Use ofMegaseliascalaris(Diptera: Phoridae), for post-mortem interval estimation indoors[J]. Parasitology Research, 2010,106(3):637-640.

[ 7 ] 馮典興,劉廣純. 尸食性蚤蠅幼蟲活體測量的新方法[J]. 沈陽大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版), 2012,24(2):23-25. (FEGN D X,LIU G C. A new method of measuring living body length during growth of carrion-breeding phorid flies larvae[J]. Shenyang University(Natural Science), 2012,24(2):23-25.)

[ 8 ] ZUHA R M,RAZAK T A,AHMAD N W,et al. Interaction effects of temperature and food on the development of forensically important fly,Megaseliascalaris(Loew)(Diptera: Phoridae)[J]. Parasitology Research, 2012,111(5):2179-2187.

[ 9 ] FENG D X,LIU G C. Pupal age estimation of forensically importantMegaseliascalaris(Loew) (Diptera: Phoridae)[J]. Forensic Science International, 2014,236(3):133-137.

[10] 褚夢穎. 蚤蠅內(nèi)部解剖結(jié)構(gòu)研究[D]. 沈陽:沈陽大學(xué), 2016. (CHU M Y. Study on internal anatomy of fleas[D]. Shenyang: Shenyang University, 2016.)

[11] DAVIES K,HARVEY M L. Internal morphological analysis for age estimation of blow fly pupae (Diptera: Calliphoridae) in postmortem interval estimation[J]. Journal of Forensic Sciences, 2013,58(1):79-84.

【責任編輯: 胡天慧】

Paraffin Section Preparation of Immatures ofMegaseliascalaris(Loew)

FengDianxing,GuanMinghui,JiaZhihong,DuXinli,YueGuohua,XiaoShunyuan

(College of Life Science and Bioengineering, Shenyang University, Shenyang 110044, China)

The proper method of preparing the paraffin section of immatures ofMegaseliascalaris(Loew)is discussed, and their internal tissue structures are observed.The results show that Carnoy fixative(V(alcohol)∶V(chloroform)∶V(acetic acid)=6∶3∶1)is suitable to fix the immatures. The head or the shell of the whole body of pupa should be peeled off, which is helpful for fixation, dehydration and embedding of pupa. Pupa needs overnight paraffin. The main internal structures, such as the cephalo skeleton, salivary glands and midgut of 3 instar larva, and brain tissue, compound eye, ovary and abdomen muscles of 36 h pupa could be clearly observed on the slices.

Megaseliascalaris(Loew); paraffin section; immatures

2016-12-28

國家自然科學(xué)基金資助項目(81102296); 2016年大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計劃省級甲類資助項目(201611035000011).

馮典興(1979-),男,遼寧沈陽人,沈陽大學(xué)副教授,博士.

2095-5456(2017)03-0189-03

D 919

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