松材線蟲(chóng)CYP450基因與松樹(shù)蒎烯類(lèi)物質(zhì)代謝的相關(guān)性*

王 璇 理永霞 劉振宇 呂 全 賈秀貞 張星耀

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所 北京100091； 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所國(guó)家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091； 3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 泰安 271018)

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松材線蟲(chóng)CYP450基因與松樹(shù)蒎烯類(lèi)物質(zhì)代謝的相關(guān)性*

王 璇1理永霞2劉振宇3呂 全2賈秀貞2張星耀2

(1.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院林業(yè)新技術(shù)研究所 北京100091； 2.中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所國(guó)家林業(yè)局森林保護(hù)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 100091； 3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué) 泰安 271018)

【目的】 通過(guò)比較松材線蟲(chóng)CYP450基因和寄主萜烯類(lèi)物質(zhì)代謝的時(shí)間特異性，研究松材線蟲(chóng)解毒相關(guān)CYP450基因與寄主蒎烯類(lèi)物質(zhì)代謝之間的相關(guān)性，為該病致病機(jī)制的深入研究提供基礎(chǔ)?！痉椒ā?松材線蟲(chóng)接種5年生馬尾松后，通過(guò)實(shí)時(shí)定量PCR研究松材線蟲(chóng)CYP450基因和寄主萜烯合成酶基因表達(dá)模式，同時(shí)通過(guò)氣相色譜法檢測(cè)寄主松樹(shù)主要萜烯類(lèi)物質(zhì)代謝規(guī)律?！窘Y(jié)果】 松材線蟲(chóng)接種5年生馬尾松后，松樹(shù)蒎烯合成酶基因分別在第6天和第21天上調(diào)表達(dá)，而寄主松樹(shù)體內(nèi)α-蒎烯和β-蒎烯也具有2個(gè)峰值，分別在第9天和第27天時(shí)含量最高。松材線蟲(chóng)CYP-33C9基因在第12天和第15天大量表達(dá)，CYP-33C4基因在接種后第21天表達(dá)量最高。【結(jié)論】 松材線蟲(chóng)的入侵引起松樹(shù)蒎烯合成酶基因上調(diào)表達(dá)，生物合成大量蒎烯類(lèi)物質(zhì)，松材線蟲(chóng)CYP450基因響應(yīng)松樹(shù)蒎烯類(lèi)物質(zhì)的大量積累而上調(diào)表達(dá)。因此，根據(jù)松材線蟲(chóng)CYP450基因與松樹(shù)蒎烯類(lèi)物質(zhì)代謝在時(shí)間上的相關(guān)性，推測(cè)CYP450基因可能參與了松材線蟲(chóng)蒎烯類(lèi)物質(zhì)代謝過(guò)程，可能是松材線蟲(chóng)致病相關(guān)基因之一。

松材線蟲(chóng)； 蒎烯代謝； 細(xì)胞色素P450； 致病機(jī)制

松材線蟲(chóng)病，即松樹(shù)萎蔫病(pine wilt disease，PWD)，是一種以松材線蟲(chóng)(Bursaphelenchusxylophilus)(Nickleetal., 1981)為病原，墨天牛屬昆蟲(chóng)(Monochamusspp.)(Mamiya, 1983)為主要媒介，綜合人為參與、寄主松樹(shù)、相關(guān)伴生菌和環(huán)境因素互作的復(fù)雜病害系統(tǒng)(張星耀等, 2003)。該病傳播蔓延迅速，防治難度極大，是我國(guó)目前最為嚴(yán)重的森林災(zāi)害。

松材線蟲(chóng)侵入寄主松樹(shù)后取食松樹(shù)薄壁細(xì)胞，從而誘導(dǎo)薄壁細(xì)胞生物合成大量的蒎烯類(lèi)物質(zhì)(Kuroda, 1989)，研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)和海岸松(Pinuspinaster)共培養(yǎng)后，其揮發(fā)物主要是α-蒎烯和β-蒎烯(Wangetal., 2010)，該類(lèi)揮發(fā)性的蒎烯類(lèi)物質(zhì)在負(fù)壓條件下汽化形成氣泡(Ikedaetal., 1992)，在管胞內(nèi)形成空洞阻斷水柱的形成，同時(shí)其疏水性防止水分重新回到管胞中，從而引起薄壁細(xì)胞的空洞逐漸擴(kuò)大，最終導(dǎo)致水分運(yùn)輸受阻，松樹(shù)因缺水而死亡(Fariaetal., 2015)。因此，揮發(fā)性蒎烯類(lèi)物質(zhì)是寄主空洞化病理學(xué)過(guò)程中的特征性物質(zhì)。

松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)入侵產(chǎn)生的次生代謝產(chǎn)物是松樹(shù)防御的重要手段，高濃度的蒎烯類(lèi)化合物是松樹(shù)主要次生代謝產(chǎn)物，也是松材線蟲(chóng)在松樹(shù)體內(nèi)成功定殖必須面對(duì)的主要逆境之一。談家金等(2009)測(cè)定了松樹(shù)主要蒎烯類(lèi)物質(zhì)對(duì)松材線蟲(chóng)的影響，結(jié)果表明β -蒎烯、β-水芹烯等抑制松材線蟲(chóng)繁殖且β -水芹烯和莰烯具有殺松材線蟲(chóng)活性。Niu(2012)發(fā)現(xiàn)α-蒎烯和β-蒎烯等在低濃度條件下抑制松材線蟲(chóng)的繁殖，高濃度下可以促進(jìn)松材線蟲(chóng)的繁殖。因此，在寄生過(guò)程中，松材線蟲(chóng)必須面對(duì)寄主次生代謝產(chǎn)物脅迫，對(duì)松樹(shù)次生代謝產(chǎn)物的降解就顯得至關(guān)重要。

細(xì)胞色素P450(cytochrome P450，CYP450)代謝途徑是生物體內(nèi)有毒物質(zhì)降解的重要代謝途徑(Arltetal., 2008； Zhaoetal., 2007)，也是寄生性線蟲(chóng)外源物質(zhì)代謝中的重要代謝通路(Laingetal., 2015)。因此本研究通過(guò)松材線蟲(chóng)接種5年生馬尾松(Pinusmassoniana)基礎(chǔ)上，檢測(cè)松樹(shù)主要蒎烯類(lèi)物質(zhì)的積累與松材線蟲(chóng)CYP450基因表達(dá)模式之間的關(guān)系，從而探究松材線蟲(chóng)細(xì)胞色素CP450基因在松材線蟲(chóng)致病過(guò)程中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 松材線蟲(chóng)接種

1.1.1 松材線蟲(chóng)處理 供試松材線蟲(chóng)蟲(chóng)株來(lái)自于本實(shí)驗(yàn)所保存的Nxy61蟲(chóng)株，該蟲(chóng)株分離于2012年10月浙江寧波當(dāng)年發(fā)病的馬尾松枝條，通過(guò)貝爾曼漏斗法分離后用灰葡萄孢(Botrytiscinerea)玉米培養(yǎng)基長(zhǎng)期保存。試驗(yàn)接種線蟲(chóng)為混合蟲(chóng)態(tài)松材線蟲(chóng)(包括蟲(chóng)卵、2～4齡幼蟲(chóng)以及成蟲(chóng))，在灰葡萄孢PDA培養(yǎng)基上25 ℃黑暗培養(yǎng)5天后，貝爾曼漏斗法收集分離線蟲(chóng)，無(wú)菌水沖洗3次后，再用0.5%硫酸鏈霉素溶液處理2 min后，無(wú)菌水沖洗3次，調(diào)整線蟲(chóng)懸浮液濃度20頭·μL-1后備用。

1.1.2 松材線蟲(chóng)接種及取樣 本試驗(yàn)接種所用松樹(shù)來(lái)自于中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院科研溫室所培養(yǎng)的5年生馬尾松，參照Otoguro等(1988)的方法，在馬尾松側(cè)枝距離主干1 cm處，剪斷側(cè)枝，將1.5 mL離心管的底部剪斷，用封口膜固定于切口處，往離心管注入1 mL NXY61線蟲(chóng)液(10 000頭)，以1 mL無(wú)菌水(CK)作為對(duì)照。分別在接種后1個(gè)月內(nèi)，每隔3天取1次樣，共10次。每天3個(gè)重復(fù)。截取接種點(diǎn)以下1～5 cm部位枝條，用以檢測(cè)樹(shù)體內(nèi)蒎烯含量； 截取距離接種處5 cm處枝條用以檢測(cè)松樹(shù)蒎烯合成酶apin基因表達(dá)模式研究； 收集接種點(diǎn)及接種松樹(shù)體內(nèi)松材線蟲(chóng)，用以松材線蟲(chóng)CYP450基因表達(dá)模式研究。

1.2 松樹(shù)蒎烯合成酶apin基因表達(dá)模式研究

1.2.1 松樹(shù)RNA提取及反轉(zhuǎn)錄第1鏈合成 截取距離接種處5 cm處約1 cm長(zhǎng)松枝，迅速剪碎裝于1.5 mL離心管內(nèi)，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，根據(jù)多酚植物RNA提取試劑盒(RNAprep pure Tissue Kit，TIANGEN, BeiJing)操作步驟提取松樹(shù)總RNA，通過(guò)電泳檢測(cè)其完整性，再用cDNA第1鏈合成試劑盒(FastQuant RT Kit，TIANGEN, BeiJing)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA模板，其中總RNA的量統(tǒng)一為1 000 ng。

1.2.2 Real-time PCR檢測(cè)松樹(shù)蒎烯合成酶apin基因表達(dá) 本試驗(yàn)所用儀器為ABI 7500 Real-time PCR 擴(kuò)增儀。根據(jù)松樹(shù)蒎烯合成酶apin基因序列設(shè)計(jì)檢測(cè)引物，以松樹(shù)actin基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)SYBR PreExTaqTM(TaKaRa code： DRR0820A)操作步驟進(jìn)行熒光定量檢測(cè)。

擴(kuò)增特異性分析： 設(shè)置5個(gè)梯度，分別將松樹(shù)cDNA模板稀釋為1，5，10，15，20倍，執(zhí)行RT-PCR反應(yīng)，通過(guò)擴(kuò)增曲線Ct值對(duì)起始模板的定量分析，確定最適宜模板應(yīng)進(jìn)行10倍稀釋。根據(jù)融解曲線和PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，確認(rèn)目的基因和內(nèi)參基因的特異擴(kuò)增引物如表1所示。

RT-PCR： 以接種后不同時(shí)間點(diǎn)的松材線蟲(chóng)cDNA樣品為模板，并將模板稀釋10倍后，進(jìn)行松樹(shù)apin基因Real-time PCR相對(duì)定量分析，反應(yīng)體系為20 μL，每個(gè)樣品設(shè)4次重復(fù)，用 2-ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，確定基因相對(duì)表達(dá)量。

表1 apin基因Real-time PCR引物序列Tab.1 Real-time PCR primer sequences of apin gene

1.3 松樹(shù)蒎烯類(lèi)物質(zhì)含量檢測(cè)

1.3.1 α-蒎烯的提取方法 稱取1 g接種點(diǎn)1～5 cm處枝條，迅速剪成微小碎塊，放入5 mL離心管中，加入4 mL正己烷，蓋好管蓋，密閉浸泡24 h。然后將溶液振蕩搖勻，用0.45 μm濾膜過(guò)濾，裝入氣相瓶中待測(cè)。

1.3.2 氣相色譜法檢測(cè)α-蒎烯含量 通過(guò)氣相色譜儀(Agilent(GC-FID，7890A))檢測(cè)，手性柱(Cycoldex-B(30 m×0.25 mm× 0.25 μm))上樣。檢測(cè)條件為： 50 ℃保持3 min，以4 ℃·min-1的速度升至200 ℃，保持10 min； 載氣： 氮?dú)猓?流速： 1.5 mL·min-1； 進(jìn)樣溫度： 250 ℃； 進(jìn)樣量0.5 μL； 無(wú)分流進(jìn)樣； 保留時(shí)間： 3.68 min。將(-)-α-蒎烯和β-標(biāo)準(zhǔn)品按梯度稀釋，稀釋濃度為20，40，60，80，100 μL·L-1進(jìn)氣相色譜儀檢測(cè)，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品峰面積對(duì)樣品進(jìn)行定量分析。

1.4 松材線蟲(chóng)CYP450基因表達(dá)模式檢測(cè)

1.4.1 松材線蟲(chóng)RNA提取及反轉(zhuǎn)錄第1鏈合成 收集接種松樹(shù)體內(nèi)松材線蟲(chóng)，液氮速凍后保存于-80 ℃冰箱，根據(jù)動(dòng)物總RNA提取試劑盒(RNAprep pure Tissue Kit，TIANGEN, BeiJing)操作步驟提取線蟲(chóng)總RNA，cDNA第1鏈合成同1.2.1。

1.4.2 Real-time PCR檢測(cè)松材線蟲(chóng)CYP450基因表達(dá) 以不同接種時(shí)間點(diǎn)的松材線蟲(chóng)cDNA為模板，松材線蟲(chóng)β-actin基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)松材線蟲(chóng)CYP-33C9和CYP-33C4基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，操作步驟同1.2.2。最后選定引物序列見(jiàn)表2。

表2 CYP450基因 Real-time PCR引物序列Tab.2 Real-time PCR primer sequences of CYP450 gene

2 結(jié)果與分析

2.1 松樹(shù)蒎烯合成酶apin基因表達(dá)模式

如圖1所示，松樹(shù)蒎烯合成酶apin基因在松材線蟲(chóng)接種5年生馬尾松后1個(gè)月內(nèi)表達(dá)量有2個(gè)高峰，分別在第6天和第21天大量表達(dá)且其表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于無(wú)菌水接種的對(duì)照處理。對(duì)照組表達(dá)量較低且波動(dòng)幅度較小。松材線蟲(chóng)的入侵誘導(dǎo)了松樹(shù)蒎烯合成酶的大量表達(dá)，為后期蒎烯類(lèi)物質(zhì)的大量生物合成提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

圖1 松樹(shù)apin基因相對(duì)表達(dá)量Fig.1 The apin gene relative expression

2.2 松材線蟲(chóng)接種馬尾松后主要蒎烯類(lèi)含量檢測(cè)

2.2.1 松材線蟲(chóng)接種馬尾松后α-蒎烯含量檢測(cè) 松材線蟲(chóng)接種5年生馬尾松后，松樹(shù)α-蒎含量有2個(gè)峰值，分別在9和27天時(shí)大量積累，在18和30天時(shí)含量最低。不同時(shí)期松材線蟲(chóng)接種后松樹(shù)α-蒎烯含量均高于對(duì)照組含量。接種無(wú)菌水的對(duì)照組α-蒎烯含量21天時(shí)最高，12天時(shí)最低，整體變化幅度較小，趨于平行，而松材線蟲(chóng)接種后松樹(shù)α-蒎烯含量變化明顯(圖2)。

圖2 α-蒎烯含量Fig.2 The content of α-pinene

2.2.2 松材線蟲(chóng)接種馬尾松后β-蒎烯含量檢測(cè) 松材線蟲(chóng)接種馬尾松后松樹(shù)β-蒎烯含量也在9和27天時(shí)大量積累，呈現(xiàn)2個(gè)峰值，在18天時(shí)含量最低，21天時(shí)含量有所增加，27天時(shí)含量最高。對(duì)照組3天時(shí)β-蒎烯含量最高，9天時(shí)含量增加但小于3天的含量，隨后趨于不變，30天時(shí)有小幅度的增加(圖3)。

圖3 β-蒎烯含量Fig.3 The content of β-pinene

2.3 松材線蟲(chóng)CYP450基因表達(dá)模式

2.3.1 松材線蟲(chóng)CYP-33C9基因表達(dá)模式 松材線蟲(chóng)CYP-33C9基因在松材線蟲(chóng)接種后9天之前與對(duì)照組表達(dá)量相近，12和15天時(shí)超量表達(dá)，15天時(shí)最高，18天后幾乎不表達(dá)(圖4)。松樹(shù)α-蒎烯及β-蒎烯含量檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)松樹(shù)主要蒎烯類(lèi)物質(zhì)在9天是含量大幅增加，而CYP-33C9基因在12和15天時(shí)突然大量表達(dá)，因此，松材線蟲(chóng)CYP-33C9基因響應(yīng)松樹(shù)α-蒎烯及β-蒎烯含量的第1次大量積累，可能參與其蒎烯類(lèi)物質(zhì)的代謝過(guò)程，以便于松材線蟲(chóng)的松樹(shù)體內(nèi)的成功定殖和大量繁殖。

圖4 CPY-33C9相對(duì)表達(dá)量Fig.4 The CPY-33C9 relative expression

圖5 CPY-33C4相對(duì)表達(dá)量Fig.5 The CPY-33C4 relative expression

2.3.2 松材線蟲(chóng)CYP-33C4基因表達(dá)模式 松材線蟲(chóng)CYP-33C4基因在接種后21天時(shí)表達(dá)量最高，18和30天時(shí)沒(méi)有檢測(cè)到表達(dá)量； 在9天之前，其表達(dá)量逐漸增加，12天時(shí)有所降低，15天表達(dá)量與9天表達(dá)量相近，但在第18天時(shí)表達(dá)量很低，以至于沒(méi)有檢測(cè)到，21天時(shí)表達(dá)量急劇增至最高，隨后降低(圖5)。松樹(shù)蒎烯類(lèi)物質(zhì)是在9天時(shí)大量積累，而CYP-33C4基因在12～21天之間表達(dá)量呈現(xiàn)上升趨勢(shì)。因此，該基因可能響應(yīng)蒎烯類(lèi)物質(zhì)的積累而大量表達(dá)，可能參與了松材線蟲(chóng)蒎烯類(lèi)物質(zhì)代謝。

3 討論

Myers(1986)首次提出松材線蟲(chóng)病空洞化理論，該理論認(rèn)為，松樹(shù)萎蔫主要是由于管胞中出現(xiàn)的空洞影響了松樹(shù)水分輸導(dǎo)造成的。松樹(shù)感染了松材線蟲(chóng)后，樹(shù)體內(nèi)單蒎烯和倍半蒎烯的含量急劇增加，這類(lèi)物質(zhì)易汽化、表面張力低，滲入管胞后，在管胞中形成空洞，致使水分輸導(dǎo)受阻，從而引起松樹(shù)萎蔫(楊寶君, 2002)。Kuroda(1995)通過(guò)聲波發(fā)射(acoustic emission，AE)技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲(chóng)接種后1～2個(gè)星期AE信號(hào)突然增加，并且在晚上和白天均有信號(hào)。接種3～4個(gè)星期后，AE信號(hào)比正常低，癥狀可見(jiàn)，老葉變黃，尖端萎蔫。這一時(shí)期1/2～2/3的枝條由于空洞化而功能紊亂，形成層和射線部分壞死，松樹(shù)接近死亡。因此，空洞化的形成是松材線蟲(chóng)病典型的病理學(xué)特征。

松樹(shù)蒎烯特別是單萜類(lèi)物質(zhì)的積累是松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)入侵的主要防御反應(yīng)，高濃度松樹(shù)單萜揮發(fā)物對(duì)松材線蟲(chóng)具有生理毒性，被認(rèn)為是松樹(shù)防御反應(yīng)的重要化合物(Seyboldetal., 2006)。松材線蟲(chóng)侵染感病松樹(shù)海岸松時(shí)，蒎烯次級(jí)代謝(包括殺線蟲(chóng)活性物質(zhì))基因大量表達(dá)，松樹(shù)產(chǎn)生大量蒎烯類(lèi)物質(zhì)等次級(jí)代謝產(chǎn)物，抵御松材線蟲(chóng)的入侵(Santosetal., 2012)。松材線蟲(chóng)入侵后，寄主釋放的揮發(fā)性物質(zhì)主要是α-蒎烯、β-蒎烯和長(zhǎng)葉烯三種蒎烯類(lèi)物質(zhì)，其比例為1∶0.1∶0.1，α-蒎烯和β-蒎烯是主要的單萜類(lèi)物質(zhì)(Zhaoetal., 2007)。松材線蟲(chóng)接種黑松(Pinusthunbergii)后，單萜和倍半萜含量顯著增加： α-蒎烯含量是健康松樹(shù)的2～4倍，β-蒎烯和其他幾種單萜是2～3倍(Kuroda, 1989)。α-蒎烯是松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)入侵的主要蒎烯類(lèi)次生代謝產(chǎn)物，Takeuchi等(2006)發(fā)現(xiàn)自然感病的松樹(shù)和人工接種松材線蟲(chóng)的松樹(shù)體內(nèi)蒎烯類(lèi)物質(zhì)如α-蒎烯釋放量大量積累。本研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)接種后，松樹(shù)蒎烯合成酶(apin)基因大量表達(dá)，蒎烯類(lèi)物質(zhì)大量積累，且都具有2個(gè)峰值。松樹(shù)apin基因大量表達(dá)的時(shí)間早于蒎烯類(lèi)物質(zhì)大量積累的時(shí)間，說(shuō)明松材線蟲(chóng)接種后，激發(fā)松樹(shù)蒎烯合成酶大量表達(dá)，大量合成蒎烯類(lèi)物質(zhì)。松材線蟲(chóng)入侵后，分泌纖維素酶等細(xì)胞壁相關(guān)蛋白(Maetal., 2011)，類(lèi)毒液過(guò)敏原蛋白(Lietal., 2016)等激發(fā)寄主防御反應(yīng)，從而引起蒎烯類(lèi)次級(jí)代謝產(chǎn)物大量積累。因此，松材線蟲(chóng)接種后馬尾松蒎烯類(lèi)物質(zhì)第1次大量增加是松樹(shù)響應(yīng)松材線蟲(chóng)的入侵而進(jìn)行的主動(dòng)防御反應(yīng)； 而蒎烯類(lèi)物質(zhì)的第2次大量積累可能是因?yàn)樗刹木€蟲(chóng)大量繁殖后，通過(guò)其他致病基因干擾松樹(shù)蒎烯類(lèi)物質(zhì)代謝，從而使松樹(shù)蒎烯類(lèi)物質(zhì)代謝紊亂的結(jié)果。

松材線蟲(chóng)入侵后，分泌一系列代謝相關(guān)蛋白通過(guò)結(jié)合、氧化還原等作用降低寄主次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)松材線蟲(chóng)的危害。松材線蟲(chóng)對(duì)寄主松樹(shù)次級(jí)代謝產(chǎn)物的代謝利用預(yù)計(jì)有3個(gè)不同階段： 1) 給次級(jí)代謝產(chǎn)物加上功能團(tuán)，使其更適合作為下游反應(yīng)的底物； 2) 分解代謝過(guò)程； 3) 排出體外。而CYP450可能是第1階段最重要的酶(Kikuchi, 2011)。松材線蟲(chóng)接種黑松后，CYP450等致病相關(guān)的基因高量表達(dá)(Urlacheretal., 2012)。Hirao等(2012)通過(guò)抑制消減雜交技術(shù)分析不同抗性黑松接種不同致病性線蟲(chóng)的轉(zhuǎn)錄組發(fā)現(xiàn)，抗性黑松接種松材線蟲(chóng)后CYP450蛋白和細(xì)胞壁相關(guān)水解酶類(lèi)蛋白等轉(zhuǎn)錄組水平迅速減少，CYP450表達(dá)下調(diào)可能與松材線蟲(chóng)入侵后樹(shù)脂道內(nèi)產(chǎn)生蒎烯類(lèi)化合物有關(guān)。

CYP450家族的酶在次級(jí)代謝產(chǎn)物生物轉(zhuǎn)化過(guò)程中有重要作用。Yan等(2012)通過(guò)松材線蟲(chóng)和擬松材線蟲(chóng)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析結(jié)果顯示CYP450是外源物質(zhì)分解利用的主要代謝途徑。本研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)CYP-33C9和CYP-33C4基因響應(yīng)松樹(shù)蒎烯類(lèi)物質(zhì)的增加而表達(dá)量增加，推測(cè)CYP450基因可能參與了松材線蟲(chóng)蒎烯類(lèi)物質(zhì)代謝過(guò)程。但隨著松材線蟲(chóng)的入侵，松樹(shù)體內(nèi)蒎烯類(lèi)物質(zhì)再次積累，還存在其他致病基因的作用，有助于松材線蟲(chóng)躲避松樹(shù)次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)松材線蟲(chóng)的抑制作用。Lindblom等(2006)認(rèn)為線蟲(chóng)體內(nèi)的外源物質(zhì)代謝相關(guān)基因主要包括CYP450、短鏈脫氫酶(SDR)、谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶(GST)和糖醛酸脫氫酶(UGT)等。Kikuchi(2011)通過(guò)KEGG分析，松材線蟲(chóng)的細(xì)胞色素P450的基因拷貝數(shù)明顯大于秀麗隱桿線蟲(chóng)(C.elegans)，是進(jìn)行外源物質(zhì)和有毒物質(zhì)代謝最主要的路徑之一，可能是CYP450基因的下游基因。

通過(guò)松材線蟲(chóng)與松樹(shù)互作早期特異表達(dá)基因研究中發(fā)現(xiàn)有7種CYP450基因顯著變化，4種基因上調(diào)表達(dá)，3種基因下調(diào)表達(dá)，其中CYP-33C4和CYP-33C9變化最明顯(Qiuetal., 2013)。Xu等(2015)通過(guò)RACE技術(shù)克隆了松材線蟲(chóng)CYP-33C9、CYP-33C4、CYP-33D3基因，RNAi沉默這些基因后，松材線蟲(chóng)活性、遷移率、繁殖率、致病性和對(duì)阿維菌素等殺蟲(chóng)劑耐受性降低。本研究發(fā)現(xiàn)接種松材線蟲(chóng)后CYP-33C4基因表達(dá)量均低于對(duì)照組，這可能是因?yàn)镃YP-33C4基因與CYP-33C9基因存在同工酶的關(guān)系，CYP-33C9基因大量表達(dá)可能抑制CYP-33C4基因的表達(dá)。也有可能是因?yàn)槿訒r(shí)間間距太大，CYP-33C4表達(dá)量最高點(diǎn)不在各個(gè)取樣時(shí)間點(diǎn)之內(nèi)。松材線蟲(chóng)CYP-33C9基因響應(yīng)松樹(shù)α-蒎烯和β-蒎烯大量積累而超量表達(dá)，說(shuō)明該基因有可能參與了松材線蟲(chóng)對(duì)松樹(shù)蒎烯類(lèi)物質(zhì)降解過(guò)程。

4 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲(chóng)接種后，松樹(shù)主要揮發(fā)性物質(zhì)α-蒎烯和β-蒎烯的大量積累與松材線蟲(chóng)CYP-33C4和CYP-33C9基因的大量表達(dá)在時(shí)間上存在緊密聯(lián)系，因此推測(cè)CYP450基因可能參與了松材線蟲(chóng)蒎烯類(lèi)物質(zhì)代謝過(guò)程，可能是松材線蟲(chóng)致病過(guò)程中的相關(guān)基因之一。此結(jié)果為進(jìn)一步深入研究CYP450在松材線蟲(chóng)致病機(jī)制中的作用提供了重要的參考依據(jù)。

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(責(zé)任編輯 朱乾坤)

Relationship between the Cytochrome P450 Gene of Pine WoodNematode and the Accumulation of Pine Pinene

Wang Xuan1Li Yongxia2Liu Zhenyu3Lü Quan2Jia Xiuzhen2Zhang Xingyao2

(1.ResearchInstituteofForestryNewTechnology,CAFBeijing100091; 2.KeyLaboratoryofForestProtectionofStateForestryAdministrationResearchInstituteofForestEcology,EnvironmentandProtection,CAFBeijing100091;3.ShandongAgriculturalUniversityTai’an271018)

By comparing the expression pattern of cytochrome P450 (CYP450) genes of Pine Wood Nematode (PWN) (Bursaphelenchusxylophilus)and the accumulation of pine terpene, the relationship between the CYP450 genes of PWN and the metabolism of pine pinene was analyzed to provide fundamental information for PWN pathogenic mechanisms study. 【Method】Five-yearsPinusmassonianawere inoculated with PWN. Real-time Quantitative PCR was conducted to detect expression patterns ofapingene of pine trees and CYP450 family genes of PWN. Terpene metabolism in infectedP.massonianawas detected by Gas Chromatography. 【Result】The expression of pinene synthase genes were dramatically induced at 6 dpi (days post inoculation) and 21 dpi. Both α-pinene and β-pinene were accumulated with two peaks at 9dpi and 27dpi, respectively. Correspondingly, the expression of PWNCYP-33C9 dramatically increased at 12dpi and 15dpi, and the expression ofCYP-33C4 were highest at 21dpi. 【Conclusion】The pine tree pinene synthase gene was highly induced by PWN inoculation which resulted in sharp accumulation of the α-pinene and β-pinene. In responding to the accumulation of pine terpene, the expression of PWN CYP450 genes dramatically increased. Therefore, according to the temporal correlation between the pinene metabolism and the PWN CYP450 genes expression we inferred that the PWN CYP450 genes might participate in the terpene metabolism and might be one of the pathogenic genes in the PWN pathogenic process.

pine wood nematode； terpene metabolism； cytochrome P450； pathological mechanisms

10.11707/j.1001-7488.20170612

2015-11-16；

2016-03-10。

浙江省省院合作林業(yè)科技項(xiàng)目(2014SY17)； 林業(yè)公益性行業(yè)科研專項(xiàng)經(jīng)費(fèi)(201204501)。

S763.11

A

1001-7488(2017)06-0105-06

*理永霞為通訊作者。