現(xiàn)代月季6個(gè)表型性狀和SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

周俐宏，王金剛，王志剛，張 興，龔束芳，樊金萍，車代弟

（1．遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，遼寧沈陽 110161； 2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030； 3．黑龍江省科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 163000）

現(xiàn)代月季6個(gè)表型性狀和SSR標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析

周俐宏1，王金剛2，王志剛1，張 興3，龔束芳2，樊金萍2，車代弟2

（1．遼寧省農(nóng)業(yè)科學(xué)院花卉研究所，遼寧沈陽 110161； 2東北農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，黑龍江哈爾濱150030； 3．黑龍江省科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 163000）

對(duì)80個(gè)現(xiàn)代月季品種進(jìn)行標(biāo)記和復(fù)雜數(shù)量性狀之間的關(guān)聯(lián)分析，分析的6個(gè)表型性狀包括香味、葉絨光、葉質(zhì)、葉長、葉寬和花徑。利用SPSS軟件統(tǒng)計(jì)分析了每對(duì)性狀間的相關(guān)性，其中，葉質(zhì)和葉寬（R＝－0．370，P＜0．01）、葉長和葉寬（R＝0．917，P＜0．01）、葉寬和花徑（R＝0．561，P＜0．01）、葉長和花徑（R＝0．558，P＜0．01）成極顯著相關(guān)；現(xiàn)代月季24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的平均等位基因數(shù)量和PIC值分別為11．42（2～31）和0．70，異質(zhì)性為0～0．98，說明所選群體的遺傳變異較大；用Powermarker軟件分析現(xiàn)代月季表型性狀和標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)，成功的找到了與現(xiàn)代月季6個(gè)表型性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記。

現(xiàn)代月季；表型性狀；SSR；關(guān)聯(lián)分析

現(xiàn)代月季（Rose hybrida Hort．）隸屬于薔薇科（Rosaceae）薔薇屬（Rosa）多年生木本花卉，是世界上應(yīng)用最普遍的觀賞植物之一。月季的生產(chǎn)和應(yīng)用主要包括切花月季、庭院月季和盆栽月季（Honrand-Saint Oyant L．et al．，2007）。盡管月季具有巨大的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，但對(duì)于月季屬植物的表型性狀遺傳研究卻知之甚少。

解決性狀的遺傳是探索許多問題的前提，其中一個(gè)重要的步驟是找到控制表型性狀的基因在基因組所處的位置，而分子標(biāo)記正是一個(gè)有效的工具。找到基因附近的標(biāo)記，就可以進(jìn)行標(biāo)記的輔助選擇育種（Kraakman A．T．W．，2005；蘇成付，2014）。SSRs標(biāo)記穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，共顯性并廣泛存在和分布于高等植物的整個(gè)基因組中（Morgante and Olivieri，1993；李桂東，2015）。SSRs位點(diǎn)廣泛存在于月季基因組中，基因組SSR標(biāo)記在月季上已經(jīng)得到了應(yīng)用（Esselinket al．，2003；Yanet al．，2005；Zhanget al．，2006；周青，2014；邱彤，2015），月季基因組中大約每19 Kb就有一個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)（Zhanget al．，2006），應(yīng)用SSRs標(biāo)記去解釋標(biāo)記性狀關(guān)系的問題比其他類型的標(biāo)記更能解決問題。

文中主要研究了現(xiàn)代月季6個(gè)性狀（香氣、葉絨光、葉質(zhì)、葉長、葉寬和花徑）間及6個(gè)性狀和SSR標(biāo)記間的關(guān)聯(lián)性，找到與6個(gè)現(xiàn)代月季表型性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記位點(diǎn)，為現(xiàn)代月季的標(biāo)記輔助選擇育種提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和田間試驗(yàn)

為了獲得最大可能的遺傳多樣性和最小的群體樣本，最終選擇80個(gè)現(xiàn)代月季品種作為試驗(yàn)材料。2015年調(diào)查現(xiàn)代月季香氣、葉絨光、葉質(zhì)、葉長、葉寬和花徑性狀，每個(gè)品種不少于5株至少3次重復(fù)。在性狀的數(shù)量化上，采用等級(jí)數(shù)量編碼方法，具體參照賈元義（2005）《月季品種資源的收集、分類和評(píng)價(jià)》。

1.2 表型性狀的統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS軟件分析現(xiàn)代月季6個(gè)表型性狀的遺傳參數(shù)和相關(guān)系數(shù)。

1.3 SSR分析

應(yīng)用改良的CTAB法提取現(xiàn)代月季基因組DNA（Torres A Met al．，1993）。共篩選102對(duì)SSR引物，其中71對(duì)引物（引物命名參照原文獻(xiàn)）參考S．Rajapakse（2001），Z．Yan（2005），另外，本研究根據(jù)EST數(shù)據(jù)庫開發(fā)了31對(duì)EST-SSR引物（引物命名為NEA1-31）。本試驗(yàn)所用24對(duì)引物情況見表1。

反應(yīng)體系（總體積20 μl）包括3 pmol引物，0．2 mM dNTPs，0．5U Taq酶，1×緩沖液，3 mM MgCl2和30 ngDNA。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4℃2 min；94℃45 s，退火（溫度見表1）30 s，72℃45 s（35個(gè)循環(huán)）和72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物在6%的變性聚丙烯酰胺凝膠電泳上檢測(cè)，銀染法染色（曹立成，2006），照相。

1.4 數(shù)據(jù)處理

Powermarker軟件（Liu K and Muse S．，2005）計(jì)算每個(gè)SSR標(biāo)記的基因多樣性、等位基因頻率、PIC值以及性狀與標(biāo)記的關(guān)聯(lián)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 表型性狀的評(píng)定

對(duì)現(xiàn)代月季的6個(gè)主要表型性狀進(jìn)行相關(guān)性分析的結(jié)果見表2，其中相關(guān)系數(shù)極顯著的有：葉質(zhì)與葉寬（R＝－0．370，P＜0．01）、葉長與葉寬（R＝0．917，P＜0．01）、葉寬與花徑（R＝0．561，P＜0．01）、葉長與花徑（R＝0．558，P＜0．01）。

表1 現(xiàn)代月季多態(tài)性SSR引物對(duì)性質(zhì)（F，正向；R，反向）Table 1 Properties of rose polymorphic SSR primer pairs（F，forward；R，reverse）

表2 現(xiàn)代月季9個(gè)性狀的相關(guān)性Table 2 Correlations between nine traits in modern rose

2.2 SSRs多態(tài)性

102個(gè)SSRs標(biāo)記共有59個(gè)SSR位點(diǎn)擴(kuò)增出多態(tài)性，其中36個(gè)SSRs引物來自于基因組DNA，23個(gè)SSRs引物來自于現(xiàn)代月季EST數(shù)據(jù)庫自行設(shè)計(jì)獲得。隨機(jī)選擇24個(gè)SSRs引物用于本研究（表1）。在所有材料中，SSR反應(yīng)擴(kuò)增的條帶分子量一般在200～1 000 bp（圖1、圖2）。

24對(duì)SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù)量和頻率根據(jù)基因頻率用Powermarker軟件進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。

等位基因頻率是基因雜合度、多態(tài)信息含量等多個(gè)尺度的函數(shù)。由表3可以看出，對(duì)于所選群體，24個(gè)SSRs共檢測(cè)出274個(gè)等位基因，等位基因的數(shù)量從2到31，平均11．42。其中NEA16和Rw5G14等位基因最多，檢測(cè)出了31個(gè)。本試驗(yàn)SSR位點(diǎn)的雜合度從0到0．98，平均0．55。其中NEA26雜合度最大為0．98。

每個(gè)標(biāo)記的相關(guān)信息可以根據(jù)他的PIC值進(jìn)行評(píng)估。根據(jù)Nei（1973），每個(gè)SSR的PIC值反映了基因的多樣性，PIC≥0．5為高度多態(tài)，PIC≤0．3為低度多態(tài)，0．3～0．5為中度多態(tài)。根據(jù)表3可知，所有位點(diǎn)的平均PIC值為0．70（PIC＞0．5），為高度多態(tài)，遺傳變異大，最高PIC值的SSR為NEA16和Rw5G14（0．95），說明群體內(nèi)基因一致性差，變異性大，選擇的潛力也大。本試驗(yàn)所用的24個(gè)微衛(wèi)星標(biāo)記多態(tài)信息含量豐富，可作為有效遺傳標(biāo)記用于下一步的遺傳分析。

圖1 引物NEA17對(duì)部分現(xiàn)代月季的SSR擴(kuò)增結(jié)果M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000Figure 1 SSR amplification results of primer NEA17 in part of modern rose

圖2 引物NEA28對(duì)部分現(xiàn)代月季的SSR擴(kuò)增結(jié)果 M：DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000Figure 2 SSR amplification results of primer NEA28 in part of modern rose

表3 現(xiàn)代月季24個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)的遺傳參數(shù)Table 3 Genetic parameter of 24 satellite loci in modern roses

2.3 與性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記

從表4可以看出，與香氣相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記有3個(gè)，分別為NEA06，NEA20和NEA25；與葉絨光相關(guān)聯(lián)的分子標(biāo)記有7個(gè)，分別為NEA10、NEA17、NEA22、NEA26、NEA29、Rw5G14和Rw15D15；與葉質(zhì)相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有2個(gè)，分別為NEA25和Rw5G14；與葉長相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有9個(gè)，分別為NEA06，NEA10，NEA15，NEA17，NEA20，NEA21，NEA25，NEA29和Rw15D15；與葉寬相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記主要有8個(gè)，分別為NEA06、NEA15，、NEA17、NEA20、 NEA21、NEA25、NEA29和Rw15D15；與花徑相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記有6個(gè)，分別為NEA02、NEA10、NEA17、NEA26、NEA29和Rw15D15。

綜合分析發(fā)現(xiàn)：與現(xiàn)代月季6個(gè)主要表型性狀相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)累計(jì)有13個(gè)，其中與葉長相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)最多為9個(gè)，與葉質(zhì)相關(guān)聯(lián)的位點(diǎn)最少為2個(gè)。同一位點(diǎn)與多個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)情況很普遍，例如NEA17和Rw15D15同時(shí)與葉長、葉寬和花徑相關(guān)聯(lián)。這表明現(xiàn)代月季性狀表型的相關(guān)是確有其內(nèi)在遺傳因素的。

表4 與現(xiàn)代月季6個(gè)表型性狀相關(guān)聯(lián)的標(biāo)記Table 4 Markers correlated to nine phenotype traits in modern rose

3 結(jié)論與討論

3.1 所選群體的遺傳變異

多態(tài)信息含量的差異能夠反映物種間遺傳多樣性的差異，是衡量現(xiàn)代月季基因片段多態(tài)性和變異程度較好的指標(biāo)。同時(shí)多態(tài)性信息含量關(guān)系到該座位可用性及使用效率。在一個(gè)群體中，多態(tài)信息含量越大，該座位雜合子比例則越大，提供的遺傳信息就越高。本研究的80個(gè)現(xiàn)代月季的24個(gè)位點(diǎn)平均多態(tài)信息含量為0．70，最高多態(tài)性信息含量為NEA16和Rw5G14（0．95），最低為NEA19（0．32）。其所有位點(diǎn)多態(tài)性信息含量PIC＞0．25，都達(dá)到多態(tài)水平，表明所選現(xiàn)代月季群體具有豐富的遺傳多樣性。

基因雜合度又稱基因多樣度，反映群體在多個(gè)基因座位上的遺傳變異，一般認(rèn)為它是度量遺傳變異的一個(gè)最適參數(shù)。平均雜合度可以近似反映群體遺傳結(jié)構(gòu)變異程度的高低，雜合度越大，群體的變異越大。一個(gè)沒有進(jìn)行過人工選擇的群體平均基因多樣度越高，該群體就越接近于一個(gè)平衡的自然群體。如果某個(gè)位點(diǎn)的基因多樣度在所有品種中都較大，說明這個(gè)位點(diǎn)的遺傳多樣性比較豐富，可能是該物種中最原始最保守的位點(diǎn)，就更適合做遺傳關(guān)系的研究。遺傳雜合度通常認(rèn)為是度量群體遺傳變異的最適參數(shù)，雜合度越高，群體的遺傳變異就越豐富，可選擇的范圍就廣，若群體雜合度高于0．5，表明該群體沒有受到高強(qiáng)度的選擇，擁有豐富的遺傳多樣性。從研究的24個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)反映出的信息來看，平均遺傳雜合度為0．55，說明了本實(shí)驗(yàn)群體遺傳變異的程度較高，可做進(jìn)一步選擇。

有效等位基因數(shù)和多態(tài)信息含量一樣，都可以用來度量群體遺傳多樣性。有效等位基因數(shù)是基因純合度的倒數(shù)，它表明等位基因間所謂的相互影響。如果等位基因在群體中分布越均勻，有效等位基因越接近實(shí)際檢測(cè)到的等位基因的絕對(duì)數(shù)。有效等位基因數(shù)目和實(shí)際檢測(cè)到的數(shù)目是有差距的，這時(shí)因?yàn)橛行┗蝾l率相對(duì)很高，有些基因頻率相對(duì)很低，基因分布不均勻。本研究中24個(gè)位點(diǎn)平均11．42個(gè)等位基因。強(qiáng)海平等（2014）用SSR標(biāo)記分析中美紫花苜蓿品種遺傳多樣性，40對(duì)全基因組SSR標(biāo)記平均每個(gè)位點(diǎn)等位基因數(shù)為11．2；王鳳格等（2014）對(duì)328個(gè)玉米品種進(jìn)行SSR分析，40對(duì)引物的平均等位基因變異為8．10；李鶴等（2014）對(duì)砧用南瓜種質(zhì)資源進(jìn)行SSR分析，結(jié)果表明平均每個(gè)SSR位點(diǎn)的等位基因數(shù)為4．18個(gè)。

3.2 標(biāo)記性狀的關(guān)聯(lián)性分析

分子標(biāo)記從分子水平上跟蹤基因組中各染色體區(qū)段或位點(diǎn)的遺傳規(guī)律，結(jié)合性狀表現(xiàn)型的遺傳規(guī)律，確定與某一性狀的連鎖關(guān)系，并進(jìn)行QTL定位。標(biāo)記性狀連鎖分析在概念上是根據(jù)標(biāo)記位點(diǎn)的基因型以及性狀的表型對(duì)個(gè)體進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，差異顯著則說明標(biāo)記與數(shù)量性狀存在關(guān)聯(lián)性。在實(shí)質(zhì)上是利用標(biāo)記與影響性狀位點(diǎn)之間的連鎖。因此，如果一個(gè)群體的性狀差異顯著，就可以通過標(biāo)記與性狀的相關(guān)性分析，找出性狀與一個(gè)或多個(gè)標(biāo)記的遺傳相關(guān)，從而實(shí)現(xiàn)從表型到基因型選擇育種的轉(zhuǎn)變。

在本研究中，找到了與現(xiàn)代月季9個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記。同一位點(diǎn)與多個(gè)性狀相關(guān)聯(lián)情況很普遍，而這些性狀多是同一類性狀，這可能是由于性狀相關(guān)乃至一因多效的遺傳基礎(chǔ)，如標(biāo)記NEA21、NEA25、NEA29與葉長、葉寬相關(guān)聯(lián)，而表型性狀間的相關(guān)性分析也表示出這2個(gè)性狀是極顯著相關(guān)的。

找到與表型性狀相關(guān)聯(lián)的SSR標(biāo)記只是第一步，還需對(duì)SSR標(biāo)記進(jìn)一步進(jìn)行定位，確定其在現(xiàn)代月季染色體上的具體位置，找到每個(gè)標(biāo)記與其相關(guān)聯(lián)性狀的遺傳距離，才能更有效的進(jìn)行現(xiàn)代月季的分子標(biāo)記輔助育種。

［1］Honrand-Saint Oyant L，Crespel L，Rajapakse S，et al．．Genetic linkage maps of rose constructed with new microsatellite markers and locating QTL controlling lowering traits［J］．Tree Genetics＆Genomes，2007．

［2］Kraakman A T W．Mapping of yield，yield stability，yield adaptability and other traits in barley using linkage disequilibrium mapping and linkage analysis［D］．Wageningen University Ph．D，2005，140pp．

［3］蘇成付．分子標(biāo)記輔助選擇育種發(fā)展策略［J］．安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（15）：4591～4592．

［4］Morgante M，Olivieri A M．PCR-amplified microsatellites as markers in plant genetics［J．Plant J，1993（3）：175～182．

［5］李桂東．小麥3個(gè)重要農(nóng)藝性狀的SSR標(biāo)記全基因組關(guān)聯(lián)分析［D］．西北農(nóng)林科技大學(xué)碩士學(xué)位論文，2015．

［6］Esselink G D，Smulders M J M，Vosman B．Identification of cut rose（Rose hybrid）and rootstock varieties using robust sequence tagged microsatellite site markers［J］．Theor Theor Appl Genet，2003，106：277～286．

［7］Yan Z，Denneboom C，Hattendorf A，et al．．Construction of an integrated map of rose with AFLP，SSR，PK，RGA，RFLP，SCAR and morphological markers［J］．Theor Appl Genet，2005，110：766～777．

［8］Zhang L H，Byrne DH，Ballard R E，et al．．Microsatellite marker development in rose and its application in tetraploid mapping［J］．J Am Soc Hortic 1993es A M et al．．Sci，2006，131：380～387．

［9］周青．高通量SSR標(biāo)記開發(fā)及二倍體月季分子連鎖圖譜構(gòu)建［D］．武漢：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2014．

［10］邱彤，張軍，張文林，等．基于SSR標(biāo)記的現(xiàn)代月季遺傳多樣性研究［J］．北方園藝，2015，14：115～117．

［11］賈元義．月季品種資源的收集、分類和評(píng)價(jià)［D］．泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2005．

［12］Torres A M，Weeden NF，Martin A．Linkage among isozyme，RFLP and RAPD markers in Vicia faba［J］．Theor Appl Genet，1993，85：937～945．

［13］Rajapakse S，Byrne D H，Zhang L，et al．．Two genetic linkage maps of tetraploid roses［J］．Theor Appl Genet，2001，103：575～583．

［14］曹立成．甜菜M14品系分子標(biāo)記的研究［D］．哈爾濱：黑龍江大學(xué)碩士學(xué)位論文，2006．

［15］Liu K，Muse S．PowerMarker：an integrated analysis environment for genetic marker analysis［J］．Bioinformatics，2005， 21：2128～2129．

［16］Nei M．Analysis of gene diversity in subdivided populations［J］．Proc of the National Acad Sci USA，1973，70：3321～3323．

［17］強(qiáng)海平，余國輝，劉海泉，等．基于SSR標(biāo)記的中美紫花苜蓿品種遺傳多樣性研究［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（14）：2853～2862．

［18］王鳳格，田紅麗，趙久然，等．中國328個(gè)玉米品種（組合）SSR標(biāo)記遺傳多樣性分析［J］．中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，47（5）：856～864．

［19］李鶴，郭世榮，束勝，等．砧用南瓜種質(zhì)資源形態(tài)學(xué)性狀與SSR標(biāo)記分析［J］．園藝學(xué)報(bào)，2014，41（7）：1379～1390．

Association Analysis of Six Phenotype Traits and SSR Markers in Modern Roses

ZHOU Li-hong1，WANG Jin-gang2，WANG Zhi-gang1，ZHANG Xing3，GONG Shu-fang2FAN Jin-ping2，CHE Dai-di2

（1．Flower Institute，Liaoning Academy of Agricultural Sciences，Shenyang，Liaoning 110161； 2．College of Horticulture Science，Northeast Agriculture University，Harbin，Heilongjiang 150030； 3．Daqing branch court，Heilongjiang Academy of Sciences，Daqing，Heilongjiang 163000）

Association analysis between molecular markers and six complex quantitative traits including fragrance，velour，leaf texture，leaf length，leaf width，and flower diameter were carried out in 80 modern roses varieties collected in our study，for which the correlations between each trait were analyzed by SPSS software procedure．The result showed that the significant correlations were detected between leaf texture and leaf width（R＝－0．370，P＜0．01），leaf length and leaf width（R＝0．917，P＜0．01），leaf width and flower diameter（R＝0．561，P＜0．01），leaf length and the flower diameter（R＝0．558，P＜0．01）．The average values of alleles number and PIC of 24 microsatellite loci were 11．42（2～31）and 0．70．The heterozygosity was from 0 to 0．98 in modern roses，which showed the abundant genetic variations in the group tested．The association between phenotype traits and SSR markers were analyzed by Powermarker software procedure，and SSR markers associated with six traits were successfully found．

Modern rose；Phenotype traits；SSR；Association analysis

S685．12

A

1002－1728（2017）03－0009－06

10．3969／j．issn．1002－1728．2017．03．002

2017－04－11

東北農(nóng)業(yè)大學(xué)創(chuàng)新項(xiàng)目（CXZ004）；黑龍江省教育廳海外學(xué)人科研資助項(xiàng)目（1154h04）

周俐宏（1984－），女，遼寧蓋州人，助理研究員，博士，主要從事花卉資源與育種研究。E-mail：vickyzlh＠1663．com

車代弟（1964－），女，黑龍江哈爾濱，教授，博士，主要從事花卉育種與栽培研究。E-mail：898462546＠qq．com