哮喘患者支氣管肺泡灌洗液的差異蛋白表達(dá)及分析

趙蘊偉 鄒曉婷 李爽

·呼吸病研究·

哮喘患者支氣管肺泡灌洗液的差異蛋白表達(dá)及分析

趙蘊偉 鄒曉婷 李爽

目的 探討支氣管哮喘患者與健康人肺泡灌洗液(broncho alveolar lavage fluid，BALF)中蛋白質(zhì)表達(dá)的差異性，選出目標(biāo)上調(diào)蛋白。方法 選擇30例支氣管哮喘患者及30例健康志愿者，行支氣管肺泡灌洗，將灌洗液回收后離心、留取上清液后保存，應(yīng)用雙向凝膠電泳技術(shù)與質(zhì)譜技術(shù)對肺泡灌洗液行蛋白質(zhì)表達(dá)差異性的鑒定及分析。結(jié)果 支氣管哮喘組BALF的巨噬細(xì)胞移動抑制因子(macrophagemigrat ioninhibitory factor,MIF)和嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(eosinophil cationic pro-tein,ECP)含量明顯高于健康對照組(P<0.05),差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 MIF與ECP在哮喘肺泡灌洗液中是表達(dá)上調(diào)的蛋白，對支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展起到一定的促進(jìn)作用。

支氣管哮喘(bronchial asthma)，多以反復(fù)發(fā)作的喘息、氣促及胸悶為特點，是臨床的多發(fā)病、常見病，因其發(fā)病機制及臨床診治一直是醫(yī)學(xué)的重點和難點而受到廣大研究者的關(guān)注。目前研究認(rèn)為，哮喘跟許多炎癥細(xì)胞及炎癥因子有關(guān)，是一種以嗜酸性粒細(xì)胞為主的非特異性炎癥性疾病，其中，有涉及到大量蛋白質(zhì)的含量及種類變化，而支氣管肺泡灌洗液中的蛋白成分主要來源于氣道及肺泡上皮表層,在一定程度上，這些蛋白成分能反映哮喘發(fā)病的整個病理過程。本研究主要是以蛋白質(zhì)組學(xué)[1]為基礎(chǔ)，先用雙向凝膠電泳技術(shù)[2]得到標(biāo)本的電泳圖譜，然后應(yīng)用電泳圖譜分析軟件對其進(jìn)行匹配分析,同時對差異蛋白質(zhì)斑點的信息進(jìn)行統(tǒng)計，最后用質(zhì)譜技術(shù)對其進(jìn)一步鑒定，選出新的生物學(xué)蛋白標(biāo)志物，為哮喘發(fā)病的機制提供新的線索，為支氣管哮喘的臨床診斷提供新的依據(jù)，并能為哮喘獲取新的治療靶點研究提供參考依據(jù)，從而為研究及診療支氣管哮喘帶來新希望。

資料與方法

一、本次實驗收集2015年9月至2016年9月我院收治的30例哮喘患者為研究對象為觀察組，同時收集30例健康志愿者為對照組，兩組研究對象在種族、年齡、性別等一般性資料沒有顯著差異。選取支氣管哮喘患者的標(biāo)準(zhǔn)：根據(jù)中華醫(yī)學(xué)會呼吸病學(xué)分會哮喘學(xué)組在2008年制訂的支氣管哮喘防治指南[3]中確診為支氣管哮喘的患者，診斷這些患者在慢性緩解期，做支氣管鏡檢查之前，患者病情平穩(wěn)，年齡在20歲到60歲。選取病例時，排除標(biāo)準(zhǔn)如下：① 在急性發(fā)作期的患者;② 凝血功能較差的患者;③ 有妊娠、惡性腫瘤及嚴(yán)重的心肝腎疾病的患者;④ 合并自身免疫性疾病患者。所有患者及志愿者均簽署《經(jīng)電子支氣管鏡操作知情同意書》和《實驗研究知情同意書》。

本次研究所需要應(yīng)用的主要試劑以及工具儀器主要有：購自Amersham Pharmaeia Bioteeh公司的三氯乙酸(TCA)、丙烯酰胺、瓊脂(Agarose)、溴酚藍(lán)，Bio-Rad公司的IPG緩沖液、TEMED、固相pH梯度預(yù)制膠條，80-1上海手術(shù)器械廠的離心機，美國的Bio-Rad laboratories凝膠成像儀，美國安發(fā)瑪西亞公司的雙向凝膠電泳儀，Amersham pharmcia Biotech公司的image Master TM 2D version:5.0圖像分析軟件，日本島津公司的質(zhì)譜儀。

二、方法

1 標(biāo)本采集：所有參加實驗研究者均完成了心電圖、凝血功能，肝腎功能等常規(guī)檢查，在禁食8小時以后，清晨給予2%利多卡因局部吸入麻醉，兩小時后經(jīng)電子支氣管鏡行肺泡灌洗，收集所有的灌洗液置冰浴,1500prm離心30min,留取上清液，用1.5mL EP管分裝,標(biāo)記后儲存于-80℃冰箱中備用。

2 BALF中蛋白樣品的提?。翰捎萌纫宜?TCA)沉淀法提取蛋白樣品。具體過程:分別取上述BALF樣品1.5lm,加入TCA0.15g,使樣品溶液的TCA終濃度為10%；充分混勻后冰浴20min,3500prm離心15min；棄除上清液,沉淀物以事先預(yù)冷的丙酮溶解,再次3500prm離心15min，將殘留的TCA和丙酮去除；蛋白沉淀物風(fēng)干幾分鐘后,加水化上樣緩沖液充分溶解,使樣品溶液中蛋白質(zhì)濃度為0.6mg/mL；4℃下,100000g離心60min去除雜質(zhì),上清液即為實驗所需的BALF蛋白樣品, 置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

3 雙向凝膠電泳及凝膠圖像的分析： 此次實驗研究將同組BALF樣本進(jìn)行等量混合，取300μL的BALF蛋白樣品，先除去BALF中的高豐度蛋白，再將其充分地進(jìn)行水化，將 ph 值為 3-10 的 17cm非線性膠條作為樣品，進(jìn)行第一向等電聚焦，等待其處于平衡之后，用硝酸銀對其進(jìn)行銀染后，開始用雙向凝膠電泳進(jìn)行第二向的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[4]，染色后的雙向電泳凝膠用掃描儀透射掃描,將這些凝膠圖像逐一進(jìn)行點檢測，將它們的背景進(jìn)行削減與匹配，蛋白點豐度的比較在組間進(jìn)行，如果測到的蛋白點豐度高于或者是低于正常值的3倍，就把這類蛋白視作是差異蛋白。

4 質(zhì)譜檢測與數(shù)據(jù)庫檢索：將以上重復(fù)性比較好、形態(tài)相對完整的差異蛋白膠點進(jìn)行切取，萃取之后再用質(zhì)譜儀開始質(zhì)譜檢測與分析，最終得到一個肽質(zhì)量的指紋圖譜，將強度在10個單位以上、有10個以上離子信號的譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，鑒定出相關(guān)的多肽和蛋白。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

應(yīng)用醫(yī)學(xué)統(tǒng)計軟件 SPSS 11.0對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析，實驗中各種BALF蛋白質(zhì)含量變化的數(shù)據(jù)資料采用百分比表示，兩組數(shù)據(jù)間的樣本均數(shù)的比較采用配對資料t檢驗，當(dāng)P<0.05 時，組間數(shù)據(jù)比較具有很大的差異。

結(jié) 果

進(jìn)行凝膠電泳技術(shù)和質(zhì)譜技術(shù)分析后的BLAF，電泳圖譜(見圖1)，共鑒定出相關(guān)9種差異表達(dá)的蛋白質(zhì)，這些蛋白斑點相對集中，其染色深淺及大小差異性較大，其中protein2(MIF)跟protein3(ECP)是研究的目標(biāo)蛋白，跟健康對照者相比，支氣管哮喘患者的移動抑制因子和嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白豐度明顯較高，具有較大差異，P<0.05。具體差異蛋白含量的比較(見表1)。

圖1 聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜

組別nBALF中MIF值(ng/mL)BALF中ECP值(ng/mL)哮喘組3010.57±4.5320.68±5.23對照組304.58±1.546.79±2.36

注：P<0.05，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

目前認(rèn)為，哮喘的發(fā)病不僅受環(huán)境因素的影響，基因遺傳因素也起到了重要作用，并且可能與多種基因遺傳有關(guān)[5]。上個世紀(jì)以來,國際上將挑選哮喘候選基因一直視為重點，使得哮喘的分子遺傳學(xué)研究得到廣泛的關(guān)注，越來越多的臨床實驗得到開展。遺傳信息的根本源頭是基因, 而蛋白質(zhì)才是生物體具體功能的執(zhí)行者。研究表明，蛋白質(zhì)的表達(dá)比基因序列在致病因素上更具有主導(dǎo)地位，跟其有關(guān)的疾病占所有疾病的98%，高出跟基因序列有關(guān)的疾病49倍。因此，在疾病的發(fā)病機制本質(zhì)上，異常表達(dá)的蛋白質(zhì)比基因更有揭示意義，本次實驗正是在蛋白質(zhì)組學(xué)的基礎(chǔ)上，研究了哮喘患者與健康人的BALF中差異蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)MIF和ECP的蛋白豐度在哮喘患者中顯著升高。

哮喘是一種以多種炎癥細(xì)胞及炎癥因子為主的非特異性炎癥性疾病[6]，炎癥細(xì)胞在氣道內(nèi)聚集，釋放炎癥因子，導(dǎo)致粘液分泌增加，血管通透性增加，支氣管平滑肌收縮，引起哮喘的急性發(fā)病。MIF作為一種前炎癥因子,主要來源于嗜酸性粒細(xì)胞，哮喘患者M(jìn)IF的高表達(dá)，會引起嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生增加，與嗜酸性粒細(xì)胞呈明顯正相關(guān)關(guān)系，因此MIF作為一種細(xì)胞因子，能明顯調(diào)節(jié)嗜酸性粒細(xì)胞的產(chǎn)生。MIF涉及到多方面的疾病，在免疫與炎癥等方面都有了很多的研究，將MIF作為靶點可以為哮喘的治療開辟新途徑。Yamaguchi[7]等研究了哮喘患者與健康對照者痰液中MIF的蛋白豐度,實驗結(jié)果顯示在哮喘患者中，MIF的豐度明顯高于健康者,且跟嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白呈正相關(guān),該研究者還應(yīng)用雙重免疫熒光染色法進(jìn)一步證實了在痰液嗜酸性粒細(xì)胞胞液中，MIF與嗜酸性粒細(xì)胞過氧化酶共同存在。MIF能正向調(diào)控哮喘的細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)，有學(xué)者[8]在基因敲除技術(shù)的基礎(chǔ)上，對哮喘大鼠模型進(jìn)行了相關(guān)研究,結(jié)果表明MIF基因敲除后的大鼠肺組織及肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13等炎癥因子的含量明顯低于正常對照組,說明MIF有上調(diào)輔助性Th2優(yōu)勢性細(xì)胞因子的可能,在哮喘的發(fā)病過程中起到了促進(jìn)作用。Yamaguchi等[9]對有明顯喘息、氣促及咳嗽等癥狀的哮喘患者與處于緩解期的哮喘患者進(jìn)行了血清MIF的檢測,結(jié)果顯示，有癥狀哮喘患者的MIF含量明顯高于無癥狀哮喘患者,因此說明，MIF與哮喘患者癥狀的發(fā)生有內(nèi)在的密切聯(lián)系。

ECP是一種堿性蛋白質(zhì)，在嗜酸性粒細(xì)胞中合成并分泌到細(xì)胞外，能導(dǎo)致氣道上皮的損傷及上皮細(xì)胞的脫落，抑制纖毛的異物清除作用，并釋放大量炎性介質(zhì)，ECP是哮喘發(fā)病過程的關(guān)鍵致病因子。Wever[10]等做了相關(guān)實驗，研究顯示嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(ECP)水平可以作為氣道炎癥活動指標(biāo)之一,ECP引起炎癥的主要作用機制有：① 對氣管上皮細(xì)胞和角質(zhì)細(xì)胞有很強的毒性作用；② 誘導(dǎo)肥大細(xì)胞釋放組胺、白三烯、前列腺素、血栓烷素A2等炎性介質(zhì)，導(dǎo)致氣道粘液分泌增多，微血管及黏膜的通透性增加，黏膜充血水腫，并使感覺神經(jīng)纖維暴露，導(dǎo)致氣道高反應(yīng)性。

綜上所述，巨噬細(xì)胞移動抑制因子和嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白作為嗜酸性粒細(xì)胞合成并分泌的蛋白質(zhì)，都可作為嗜酸細(xì)胞活性標(biāo)志物，能在支氣管哮喘的發(fā)生發(fā)展過程都起到重要的促進(jìn)及調(diào)節(jié)作用，因此，MIF和ECP的水平可反映哮喘氣道炎癥的活動情況及疾病嚴(yán)重程度，可以為支氣管哮喘的臨床診斷及獲取新的治療靶點研究提供參考依據(jù)，具有較高的臨床應(yīng)用價值。

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10.3969/j.issn.1009-6663.2017.08.044

黑龍江省科學(xué)技術(shù)研究面上項目(教育廳、校級)，基金(No JMSUJCMS2016-041) 黑龍江省衛(wèi)生計生委科研課題(No 2016-299)

154007 黑龍江 佳木斯，佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院

李爽，E-mail：vivianlee1981@163.com

2017-02-15]