廣東漢族人群HBV基因型、基本核心啟動子/前C區(qū)突變與肝癌易感相關(guān)性研究

劉樹旺 張麗芬 劉利平 劉林森 張悅 李琪 彭公澤 鮑世韻

廣東漢族人群HBV基因型、基本核心啟動子/前C區(qū)突變與肝癌易感相關(guān)性研究

劉樹旺 張麗芬 劉利平 劉林森 張悅 李琪 彭公澤 鮑世韻

目的 研究廣東漢族肝癌HBV基因型、基本核心啟動子(BCP)/前C區(qū)突變與肝癌易感性的相關(guān)關(guān)系。方法 按照病例對照研究設(shè)計方法，納入HBV合并肝癌患者(病例組)100例和HBV攜帶者(對照組)100 例，收集血清樣本，提取HBV DNA，采用巢式PCR擴(kuò)增HBV S區(qū)、BCP及前C區(qū)片段，雙向測序，分析HBV基因型、BCP/前C區(qū)基因突變與HBV合并肝癌易感性的相關(guān)性。結(jié)果 病例組BCP區(qū)A1762T/G1764A突變及前C區(qū)T1858C突變高于對照組，分別為92.0%和73.0%(P<0.05)、52.0%和32.0%(P<0.05)；對照組A1775G突變發(fā)生率高于病例組，分別為31.0% 和14.0%(P<0.05)。多因素Logistic 回歸分析顯示，HBV BCP區(qū)A1762T/G1764A突變和前C區(qū)T1858C 突變與HBV合并肝癌發(fā)生獨立相關(guān)[OR 6.508(95%CI：1.287～16.739，P<0.05)和3.371(95%CI：2.268～8.163，P<0.05)]；而BCP區(qū)A1775G突變則為保護(hù)因素[OR=0.163(95%CI：0.043～0.489，P<0.05)]。結(jié)論 HBV C基因型是廣東深圳地區(qū)HBV合并肝癌的主要流行株，HBV BCP區(qū)A1762T、G1764A、A1775G、前C區(qū)T1858C基因多態(tài)性與HBV合并肝癌的易感性具有密切關(guān)系。

肝癌； 乙型肝炎病毒； HBV基因型； 突變

原發(fā)性肝癌是我國最常見的惡性腫瘤之一，高居我國腫瘤死亡率的第3位[1-2]。已經(jīng)明確的肝癌獨立危險因素有HBV感染、黃曲霉素攝入和飲用水源污染。隨著人們生活水平的改善，食過過期變質(zhì)食物和飲用污染水源兩大因素已明顯改善，但肝癌發(fā)病率仍然處在較高水平。有調(diào)查顯示，我國肝癌發(fā)病率為26.39/10萬年，且平均每年升高1.0%[3]。人群HBV感染率在短期內(nèi)仍然難以得到顯著控制，HBV感染仍是目前我國人群肝癌高發(fā)的關(guān)鍵因素[4]。HBV基因型及基因多態(tài)性在HBV合并肝癌易感性中的研究成為熱點。本研究按照病例對照研究設(shè)計，探討HBV基因型和基本核心啟動子(BCP)/前C區(qū)突變與HBV合并肝癌易感性的相關(guān)性。

對象與方法

一、對象

病例組100例，為我院肝膽外科2015年1月～2016年10月收治并確診的HBV合并肝癌患者，對照組100例，為我院體檢科同期健康HBV攜帶者，兩組對象均為廣東深圳地區(qū)原著居民(三代以上均生活在本地區(qū))。兩組性別、年齡、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。病例組中HBV DNA≥105copies/ml者35 例(35.0% )，對照組57例(57.0%)，兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

肝癌診斷依據(jù)中國抗癌協(xié)會肝癌專業(yè)委員會發(fā)布的《原發(fā)性肝癌的臨床診斷與分期標(biāo)準(zhǔn)》[5]。本研究經(jīng)深圳市人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，并取得患者簽署的知情同意書。收集血清標(biāo)本，分離后置于-80℃冰箱冷藏。

表1 兩組研究對象基本特征比較(例)

二、方法

1.血清HBV DNA水平測定：采用PCR-熒光探針法檢測HBV DNA水平，檢測下限為500 copies/ml。

2.HBV DNA提取和BCP/前C區(qū)擴(kuò)增：取血清200 μl提取HBV DNA，溶于30 μl ddH2O，巢式PCR擴(kuò)增HBV BCP/前C區(qū)和S基因，第一輪擴(kuò)增引物為Fgp1[ACTCTTGGACTYTCAGCAATG(Y=C or T)] 和Rgp2[GTCAGAAGGCAAAAAAGAGAG]，反應(yīng)條件：95℃ 2分鐘；95℃ 35秒，56℃ 30秒，72℃ 60秒，共30個循環(huán)；72℃ 10分鐘，取1 μl 產(chǎn)物作為模板，二輪擴(kuò)增引物Fgp3[TCTCAGCAATGTCAACGACCG] 和Rgp4[AGAGAGTAACTCCACAGAWGCTC(W=A or T)]，反應(yīng)條件同第一輪擴(kuò)贈。得到279 bp大小的產(chǎn)物。HBV S 區(qū)第一輪擴(kuò)增：引物Fgp5[GGGTCACCATATTCTTGGG] 和Rgp6[GACCCACAATTCTTTGACAT]，反應(yīng)條件同上；二輪擴(kuò)增引物Fgp7[GCGGGGTTTTTCTTGTTGA] 和Rgp8[GGGACTCAAGATGTTGTACAG]，反應(yīng)條件同上。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定后，送千年基因科技公司(深圳)進(jìn)行PCR產(chǎn)物純化，并經(jīng)ABI 3730xl基因分析儀進(jìn)行雙向測序。

3.HBV基因型鑒定和突變位點分析：應(yīng)用Chromas軟件采集測序峰圖。利用NCBI病毒基因分型工具(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Projects/genotyping/formpage.cgi)，比對S區(qū)序列，確定HBV基因型。應(yīng)用DNAMAN對HBV DNA的BCP/前C區(qū)進(jìn)行核苷酸突變分析。

三、統(tǒng)計學(xué)處理

結(jié) 果

1.HBV基因型：病例組和對照組HBV均為B和C兩種基因型，其中B型占24.0%(48/200，病例組22例，對照組26例)，C型占76.0%(152/200)，提示廣東深圳地區(qū)HBV合并肝癌HBV基因型以C型為主。病例組和對照組均以C基因型為主，分別為78.0%(78/100)和74.0%(74/100)。組間HBV基因型的分布比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

2.HBV BCP/前C區(qū)突變：經(jīng)測序和分析發(fā)現(xiàn)，HBV基因BCP/前C區(qū)存在多個突變位點(表2)，其中BCP區(qū)A1762T/G1764A和前C區(qū)T1858C突變在病例組中的發(fā)生率顯著高于對照組，而BCP區(qū)A1775G突變在對照組中發(fā)生率高于病例組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。其余突變位點在兩組病例中分布未見明顯差異。

3.突變位點在不同HBV基因型和不同血清DNA水平上與HBV合并肝癌發(fā)生的相關(guān)性：在B基因型中，病例組的A1762T/G1764A突變率高于對照組，提示B 基因型A1762T/G1764A 突變可能更易導(dǎo)致HBV合并肝癌的發(fā)生。此外，在C基因型中，病例組的T1858C突變率高于對照組，提示C基因型T1858C突變可能與HBV合并肝癌發(fā)生相關(guān)性更強。HBVDNA≥105copies/ml與HBV DNA<105copies/ml組中，病例組與對照組間突變率比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(表3)。

4.HBV DNA突變位點與HBV合并肝癌相關(guān)性的多因素分析：Logistic 回歸進(jìn)一步篩選HBV合并肝癌易感性的相關(guān)因素。納入因素有性別、年齡、基因型分布及A1762T/G1764A和T1858C、A1775G變異。變量賦值：性別(男=0，女=1)、年齡(<50歲=0，≥50歲=1)、基因型(B型=0，C型=1)、HBV DNA復(fù)制水平(<105=0，≥105=1)、A1762T/G1764A(未突變=0，突變=1)、A1775G(未突變=0，突變=1)、T1858C(未突變=0，突變=1)。結(jié)果顯示，A1762T/G1764A和T1858C、A1775G位點突變均與HBV合并肝癌具有獨立相關(guān)性。A1762T/G1764A和T1858C具有增加HBV合并肝癌易感性的趨勢(OR=6.508，95%CI：1.287～16.739，P<0.01；OR=3.371，95%CI：2.268～8.163，P<0.01)。A1775G突變可降低HBV合并肝癌發(fā)生風(fēng)險(OR=0.163，95% CI：0.043～0.489，P<0.01)。HBV B/C基因型分布、HBV DNA血清復(fù)制水平則被剔除回歸模型。見表4。

表2 HBV BCP/前C區(qū)主要突變位點的單因素分析

表3 HBV基因型和復(fù)制水平中各突變位點與HBV合并肝癌發(fā)生的關(guān)系

表4 A1762T/G1764A和T1858C與HBV合并肝癌關(guān)系的多因素回歸分析

討 論

在目前已經(jīng)鑒定出的10 種HBV基因型(A～J)中，中國人群以B、C型感染為主[6]。本研究發(fā)現(xiàn)廣東深圳地區(qū)HBV合并肝癌人群所感染HBV基因型僅包括B型和C型，C基因型為主要流行株，且此兩種基因型在HBV合并肝癌人群與HBV攜帶人群中的分布未見差異，提示基因型差異與本地區(qū)乙肝相關(guān)性肝癌的發(fā)病可能無相關(guān)性，與鄭丹等[7]研究結(jié)果一致。Yang等[8]研究發(fā)現(xiàn)，HBVB基因型比例較大，且C基因型的HBV合并肝癌生風(fēng)險高于B基因型，這種差異可能與研究人群不同有關(guān)。本研究顯示，病例組HBV DNA復(fù)制水平低于對照組，與文獻(xiàn)報道一致[7]，這可能是由于HBV感染后發(fā)展為肝癌的過程，HBV基因整合到肝細(xì)胞基因組后，造成病毒復(fù)制能力降低，從而導(dǎo)致外周血HBV DNA水平減少[9]。

A1762T/G1764A與HBV合并肝癌發(fā)生具有顯著相關(guān)性。Guo等[10]對比58 例HBV合并肝癌和71例慢性乙型肝炎患者發(fā)現(xiàn)，HBV合并肝癌組BCP區(qū)A1762T/G1764A雙聯(lián)突變率高于對照組，進(jìn)一步通過多因素Logistic回歸分析得出，BCP區(qū)A1762T/G1764A雙聯(lián)突變與HBV合并肝癌發(fā)生密切相關(guān)。Fang等[11]在廣西人群的研究發(fā)現(xiàn)，A1762T/G1764A雙聯(lián)突變可能是篩選男性HBV攜帶者合并肝癌發(fā)生高危人群的重要生物學(xué)標(biāo)記。鄭丹等[7]選取53例HBV合并肝癌患者及70例HBV攜帶者作為研究對象，證實了在廣西HBV合并肝癌高發(fā)人群中，A1762T/G1764A雙聯(lián)突變增加肝癌發(fā)生風(fēng)險。本研究結(jié)果也顯示，BCP 區(qū)A1762T/G1764A雙聯(lián)突變在HBV合并肝癌病例組中的突變發(fā)生率顯著高于對照組，進(jìn)一步證實了A1762T/G1764A雙突變與HBV合并肝癌發(fā)生具有密切相關(guān)性。迄今為止，A1762T/G1764A雙聯(lián)突變的確切致癌機制并不明確。有研究表明，BCP 區(qū)A1762T/G1764A雙突變可能通過上調(diào)pgRNA 轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)其衣殼化，增加HBcAg的產(chǎn)量，進(jìn)而促進(jìn)HBV的復(fù)制能力。BCP區(qū)A1762T/G1764A雙聯(lián)突變可引起其所編碼蛋白質(zhì)第130位亮氨酸變換為蛋氨酸，而131 位則由纈氨酸變換變?yōu)榱涟彼?，這使得BCP區(qū)原本用于結(jié)合內(nèi)核受體的位點轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合肝細(xì)胞核因子-1的位點，使前C區(qū)mRNA轉(zhuǎn)錄效率降低，HBeAg生成水平下降，而pgRNA轉(zhuǎn)錄水平以及HBcAg合成能力增強[12]。此外，雙聯(lián)突變恰處于p53結(jié)合區(qū)域，這可能影響p53的抑癌效應(yīng)以及DNA修復(fù)功能。

本研究結(jié)果顯示，與HBV合并肝癌相關(guān)的位點是T1858C突變，而非G1896A，與Sakamoto等[13]和鄭丹等[7]的研究結(jié)果一致，提示T1858C突變可能對莖袢結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定起到更為關(guān)鍵性的作用。針對香港人群的一項研究表明，在前C區(qū)nt1856～nt1858 位點上3個堿基為TCC代表某種特定HBV基因結(jié)構(gòu)，與C基因型其他的結(jié)構(gòu)比較，TCC結(jié)構(gòu)會導(dǎo)致更為病情更為嚴(yán)重的肝臟疾病[14]。

本研究顯示，另一個較為罕見的與HBV合并肝癌發(fā)生可能相關(guān)的突變位點A1775G。與HBV合并肝癌組比較，A1775G突變在慢性HBV攜帶者人群中更為常見。提示此突變可能為肝癌的保護(hù)因素，與鄭丹等[7]報道一致，在其他人群中未見報道。對于C 基因型或HBV DNA≥105copies/ml患者中，對照組A1775G突變率高于病例組，目前關(guān)于A1775G突變的報道比較少。一項針對兒童乙肝感染病例的研究表明，在發(fā)生HBeAg血清學(xué)轉(zhuǎn)化兒童人群中，A1775G突變率相對較高[15]。該位點的突變對HBV合并肝癌易感性的作用和機制還需要進(jìn)一步探討。

HBV合并肝癌的發(fā)生與發(fā)展與機體所處的外部環(huán)境、基因和所感染的乙肝病毒類型等多種因素相關(guān)。單一基因檢測與分析所能提供的信息有限，對多種可能與HBV合并肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的基因，包括乙肝病毒基因進(jìn)行聯(lián)合檢測，并分析它們與外界環(huán)境之間可能存在的交互作用，從而綜合評價它們與腫瘤易感性的關(guān)系具有更高的臨床應(yīng)用價值。同一種SNP在不同地區(qū)人群的頻率構(gòu)成比分布上存在差異，不同地區(qū)和人群的生活習(xí)性和對環(huán)境致癌因素的暴露水平也存在差異，導(dǎo)致了HBV合并肝癌的發(fā)生與發(fā)展存在不同的特征。本研究結(jié)果支持Yuen等[16]的觀點，他們的研究也認(rèn)為，BCP變異是HBV合并肝癌的最重要高危因素，C基因型本身與HBV合并肝癌發(fā)生不存在直接相關(guān)性，可能是由于更易導(dǎo)致BCP變異而增加HBV合并肝癌的易感風(fēng)險。此外，針對臺灣人群的研究表明，只要發(fā)生了BCP變異，無論是B或C基因型，均具有較高的HBV合并肝癌發(fā)生風(fēng)險，且兩種基因型間沒有顯著差異[17]。

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(本文編輯：楊澤平)

Hepatitis B virus genotype and BCP/Pre-C region gene polymorphisms in susceptibility to hepatocellular carcinoma among the Chinese Han population in Shenzhen，Guangdong

LIUShuwang，ZHANGLifen，LIULiping，etal.

(DepartmentofHepatobiliaryandPancreaticSurgery，ShenzhenPeople＇sHospital，SecondClinicalMedicalCollegeofJinanUniversity，Shenzhen518020，China)

Objective To investigate the relationship between hepatitis B virus (HBV)genotype，polymorphisms in basic core promoter(BCP)region/pre-core(Pre-C)region and the incidence of hepatocellular carcinoma(HCC)in Guangdong Province.Methods In this case-control study，100 HCC patients and 100 asymptomatic HBV carriers were included.Blood samples were collected from them for serum separation and HBV DNA extraction.The DNA sequences of the S region and BCP/Pre-C region of HBV was determined by direct sequencing following nested-PCR amplification.The relationship between the genotype，gene mutation of HBV and the incidence of HCC was analyzed.Results The mutation rates of the A1762T/G1764A in the BCP region and the T1858C in the Pre-C region of HBV were significantly higher in HCC group than in control group(92% vs.73%，P<0.05；52% vs.32%，P<0.05).The mutation rate of A1775G was significantly higher in control group (31%) than in HCC group (14%)(P<0.05).Binary logistic regression analysis indicated that A1762T/G1764A and T1858C mutations are the risk factors for the development of HCC(OR 6.508，95%CI：1.287～16.739，P<0.05 and 3.371，95%CI：2.268～8.163，P<0.05).A1775G is a protective factor in the development of HCC(OR=0.163，95%CI：0.043～0.489，P<0.05).Conclusion BCP A1762T/G1764A，A1775G and Pre-C T1858C mutations are correlated with the incidence of HCC in Guangdong.

hepatocellular carcinoma； hepatitis B virus； genotype of HBV； mutation

10.3969/j.issn.1005-6483.2017.06.014

深圳市科技創(chuàng)新資助項目(JCYJ20160422152408705、JCYJ20150403101028198)

518020 暨南大學(xué)第二臨床醫(yī)學(xué)院(深圳市人民醫(yī)院)肝膽胰外科

鮑世韻，Email：baomi94@163.com

2017-02-21)