寬體金錢蛭新鮮藥材抗凝血有效成分分析※

劉 君張麗艷

寬體金錢蛭新鮮藥材抗凝血有效成分分析※

劉 君1張麗艷2

目的對中藥水蛭品種之一的寬體金錢蛭鮮品藥材中抗凝血的活性成分進行提取、分離及純化，并進行抗凝活性檢測。方法采用凝膠色譜等方法對活性成分進行提取、分離及純化；采用HPLC對單體蛋白進行純度檢查；采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法和質(zhì)譜法測定蛋白單體的分子量；通過單體蛋白對家兔全血凝固時間的影響和對家兔血漿復鈣時間的影響進行抗凝血活性檢測。結(jié)果從寬體金錢蛭新鮮藥材中分離出3個蛋白質(zhì)單體，分子量分別為12042.57 Da、15580 Da、24416 Da，經(jīng)檢測有兩個蛋白單體具有抗凝血活性。結(jié)論從非吸血類水蛭藥材的寬體金錢蛭體內(nèi)也可分離出具有抗凝血作用的活性物質(zhì)。

水蛭；寬體金錢蛭；抗凝血有效成分；新鮮藥材；分離；純化

世界上蛭類有300多種，在我國約有近百種。水蛭為傳統(tǒng)中藥，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》。中國藥典（2015版）收載3種水蛭，分別是水蛭、尖細金錢蛭及寬體金錢蛭[1]?，F(xiàn)代研究表明，水蛭品種間存在較大種間差異，因食性不同，水蛭品種間的化學成分和藥理活性存在差異[2]。水蛭按食性可以分為吸血蛭類和非吸血蛭類，吸血蛭類主要靠吸吮動物血液為生，這類水蛭主要有日本醫(yī)蛭、歐洲醫(yī)蛭、菲牛蛭等[3]。中華人民共和國藥典（2015版）中的水蛭就屬于吸血類水蛭，目前的研究多集中于吸血類水蛭。吸血蛭類具有良好的抗凝血活性，其抗凝血的主要成分為水蛭素及其異構體[4]。非吸血蛭類不吸食動物血液，是以捕食水中小動物及吸吮螺體、蚌殼的體液為生[5]。中華人民共和國藥典（2015版）中的寬體金錢蛭和尖細金錢蛭就屬于非吸血類水蛭。有研究表明，非吸血類水蛭的抗凝血酶活性與吸血類水蛭有較大差別[6]。但有研究表明，寬體金錢蛭具有抗凝血、抗血栓形成、抗血小板聚集等藥理作用[7]。本研究就寬體金錢蛭新鮮藥材的抗凝血有效成分進行分析，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗藥材 新鮮寬體金錢蛭藥材（江蘇微山湖，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學鑒定教研室翟艷君教授鑒定為寬體金錢蛭）。

1.2 儀器與試劑 LC-10 A高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；美國Agilent公司1100系列SL離子阱質(zhì)譜儀，配有ESI源；DEAE sephadex A-50、SephacryS-200 High Resolution、Sepharose 6 FastFlow（上海鈺博生物科技有限公司）。

1.3 實驗動物 白兔，由沈陽醫(yī)學院實驗動物中心提供。

1.4 方法

1.4.1 抗凝血活性成分提取分離 取寬體金錢蛭新鮮藥材，加0.9%氯化鈉注射液提取2次，第1次6倍量，靜置2 h（冷藏），第2次4倍量，靜置1 h（冷藏），離心（4000 rpm），合并2次提取的上清液，用70%硫酸銨[（NH4）2SO4]沉淀，離心（4000 rpm），沉淀以少量純水溶解，采用Sephadex G -25柱脫鹽，收集洗脫液濃縮，濃縮液通過Sepharose 6 Fast Flow色譜柱，以0.2 mol/L（pH=6.8）的磷酸鹽緩沖溶液洗脫，收集具有抗凝活性的有效部位，再通過DEAE-SephadexA-50色譜柱進行純化。

1.4.2 分子量測定

1.4.2.1 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（SDS-PAGE） 試驗方法參照文獻[8]，掃描定位法測定溴酚蘭指示劑和蛋白遷移距離。

1.4.2.2 質(zhì)譜法（MS） MH-A的SDS-PAGE檢測結(jié)果小于14400 Da（即在標準分子量范圍之外），采用SDS-PAGE方法無法測定其相對分子量，故采用MS測定MH-A的分子量。質(zhì)譜條件：ESI源正離子模式；霧化氣流速：70 L/h；干燥氣流速：427 L/h；干燥氣溫度：150 ℃；采集質(zhì)量范圍：100～900 m/z；多極掃描碰撞氣：氦氣；溶劑：（+）0.5%甲酸，（-）0.5%氨水。

1.4.2.3 抗凝活性檢測 ①對家兔全血凝固時間的影響：從兔的頸總動脈插管采血。采用試管法，設實驗組和對照組，對照組采用0.9%氯化鈉注射液。取試管20支，先分別加入以上分離得到的3種蛋白質(zhì)單體溶液及0.9%氯化鈉注射液各0.1 ml，每個樣品5支，再每管加入新鮮兔血0.9 ml，立即開始計時。置（37.0±0.5）℃恒溫水浴中，每隔15秒鐘傾斜1次，觀察血液是否凝固，至血液成為凍膠狀不再流動為止，記錄各管凝固時間。

②對家兔血漿復鈣時間的影響：血漿制備：采集血液樣本，置于含有適量抗凝劑（8%枸櫞酸鈉溶液）的試管內(nèi)，抗凝劑與血液容積之比為1:9，緩慢搖動試管12次，以混勻血液，確定試管已封閉，避免樣本在離心過程中蒸發(fā)，以3000 rpm離心10 min（血樣采集后1 h之內(nèi)進行），將上層血漿分裝出來。

③測試方法：取試管20支，依次每管加入待測樣品及1%氯化鈣溶液，對照組加入0.9%氯化鈉注射液，每組樣品及對照組各5支，每管分別加入一定量血漿。氯化鈣溶液、待測樣品、血漿加入量分別為0.1 ml、0.4 ml、0.5 ml，立即混勻，開始計算時間，每隔15秒鐘傾斜1次，觀察血液是否凝固，至血漿成為凍膠狀不再流動為止，記錄各管凝固時間。

2 結(jié)果

2.1 分離得到的蛋白質(zhì)組分 分離得到3個蛋白質(zhì)組分，分別命名為MH-A、MH-B、MH-C。經(jīng)電泳檢測為單一化合物，SDS-PAGE方法的分子量測定結(jié)果為：MH-B相對分子量為15580D a；MH-C相對分子量為24416 Da。MH-B、MH-C相對分子量檢測電泳圖譜分別見圖1、圖2。MH-A的質(zhì)譜分析分子量為12042.57 Da，見圖3。

圖1 MH-B電泳圖譜

圖2 MH-C電泳圖譜

圖3 MH-A質(zhì)譜圖

2.2 抗凝活性檢測結(jié)果 加入MH-B、MH-C的家兔全血凝固時間與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；加入MH-A的家兔全血凝固時間與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表1。

表1 單體蛋白對家兔全血凝固時間的影響

加入MH-B、MH-C的家兔血漿復鈣時間與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；加入MH-A的家兔血漿復鈣時間與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

試驗結(jié)果初步表明，MH-A無明顯抗凝血活性；MH-B、MH-C有明顯的抗凝血活性，MH-B作用較顯著。

表2 單體蛋白對血漿復鈣時間的影響

3 討論

水蛭是中醫(yī)臨床上較為常用的活血化瘀藥物，其藥性咸、苦，平，有小毒，歸肝經(jīng)，具有破血通經(jīng)、逐瘀消癥之功效。因其療效卓著而倍受歷代醫(yī)家贊益。從吸血類的水蛭分離得到數(shù)種具有抗凝血活性的化學成分，其中最為典型的為水蛭素及其異構體。水蛭素是從吸血類水蛭的唾液腺分泌液中分離的一種具有抗凝血作用的多肽，是目前發(fā)現(xiàn)的、最強的天然凝血酶抑制劑，作用強于肝素，而且不易引起出血。天然水蛭素是由65或66個氨基酸組成的單鏈多肽，相對分子量為7000，水蛭素的形狀類似蝌蚪，蝌蚪頭部是多肽的N端，富含半胱氨酸（cys），cys相互作用形成3個二硫鍵（Cys6- Cys14、Cys16-Cys28、Cys22-Cys39），使N端結(jié)合緊密，其C端含有6個酸性氨基酸。水蛭素的N末端能封阻凝血酶與纖維蛋白原專一性作用的陰離子結(jié)合位點R，而C末端的酸性氨基酸可以與帶正電的凝血酶識別位點形成許多離子鍵。N末端和C末端兩個功能區(qū)域以協(xié)同的方式結(jié)合到凝血酶上，在凝血酶的活性部位形成一個帽子，阻止凝血酶與底物結(jié)合[9]，從而發(fā)揮抗凝血作用。由于水蛭素的穩(wěn)定性高，在極端和熱條件下均能保持活性，而且抗凝作用強，因此在醫(yī)學上有著廣泛的應用前景。1986年，重組水蛭素成功合成，相比天然水蛭素，其活性略低，但其他性質(zhì)基本相同。

而在非吸血水蛭中，是否存在抗凝血活性成分，其活性成分的作用機制是什么，是目前許多學者關注的問題。

現(xiàn)代研究表明，寬體金錢蛭具有抗血小板聚集、抗凝血、抗血栓形成、改善血液流變性等藥理作用[7]。在中醫(yī)臨床上，水蛭藥用的主要品種就是寬體金錢蛭，占70%～80%。為了進一步探討其藥效物質(zhì)基礎，本研究對寬體金錢蛭抗凝血的活性成分進行了分離和純化，從寬體金錢蛭中分離出3個蛋白質(zhì)單體，體外凝血實驗表明，有二個蛋白質(zhì)單體具有抗凝血活性。

水蛭藥材在夏、秋二季采集后通常是以沸水燙死后，晾干或低溫干燥，藥典法定的炮制方法是滑石粉燙。在加工炮制過程中，水蛭中的化學成分尤其是蛋白質(zhì)及肽類成分的結(jié)構及生物活性會發(fā)生改變[10]。本研究采用新鮮寬體金錢蛭藥材，即秋季捕捉后洗凈，置-20 ℃冰箱中冷凍保存?zhèn)溆?。中醫(yī)臨床一般是采用干品藥材或炮制品入藥，經(jīng)高溫處理后的水蛭臨床使用仍然有較好的療效，為了更好的探討寬體金錢蛭臨床藥用的物質(zhì)基礎，應當進一步的研究其干品藥材的化學成分和干燥及炮制前后其有效成分的變化，以及由此產(chǎn)生的藥理活性的變化，以便指導臨床用藥。另外，對其活性成分的結(jié)構測定及作用機制研究也有待于進一步探討。

[1] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典(一部)[M].北京:化學工業(yè)出版社,2015:50-51.

[2] 李穎,袁繼偉,焦躍軍.入藥水蛭品種探析[J].中國中醫(yī)藥咨訊,2010,2(2):97.

[3] 張彬,汪波,龔元,等.幾種水蛭抗凝血物質(zhì)提取及活性分析[J].中山大學學報(自然科學版),2012,51(4):92-96.

[4] 鄧妙麗,李寶紅,程怡,等.水蛭的研究概況[J].海峽藥學,2012,24(3):5-8.

[5] 張漢貞,聶詩明,張麗萍,等.不同食性的水蛭抗凝血酶活性的比較[J].中藥材,1998,21(12):599-600.

[6] 梁進權,王寧生,宓穗卿.水蛭抗凝抗血栓活性及其與品種、提取方法的關系[J].中西醫(yī)結(jié)合心血管病雜志,2009,7(9):1096-1098.

[7] 楊洪雁,杜智恒,白秀娟.水蛭藥理作用的研究進展[J].東北農(nóng)業(yè)大學學報,2012,43(3):128-133.

[8] 陳彥琳,杜杰,白宗利,等.十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS)比較加熱前后蛋白成分的變化[J].世界科學技術(中醫(yī)藥現(xiàn)代化),2010,12(6):948-951.

[9] 林曉洋.天然水蛭素分離純化研究[D].南寧:廣西大學,2007:6-7.

[10] 劉麗芳,金蓉鸞,徐國鈞,等.中藥水蛭經(jīng)炮制后的成分變化研究[J].中成藥,2001,23(12):880-882.

Study on anticoagulant components in fresh Whitmania pigra Whitman

Liu Jun Zhang Yanli

ObjectiveExtract, separate,purify and detect the active components in fresh Whitmania pigra Whitman.MethodsAdopt gel chromatography to extract,separate,purify;adopt HPLC to test purity;adopt SDS-PAGE and MS to determine the molecular weight; detected preliminarily anticoagulant activity by effect on rabbit whole blood clotting time and effect on rabbit plasma recalcification time.ResultsSeparated three proteins from fresh Whitmania pigra Whitman,the molecular weight are 12042.57Da、15580Da、24416Da,two proteins have anticoagulant activity.ConclusionThere are anticoagulant components in Whitmania pigra Whitman of no blood sucking Hirudo.

Leech;Whifmania pigra;Anticoagulant active ingredient;Fresh medicinal materials;Isolation;Purification

10.12010/j.issn.1673-5846.2017.06.006

1遼寧省中醫(yī)藥研究院臨床藥理實驗室，遼寧沈陽 110034

2遼寧中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，遼寧沈陽 110032

遼寧省教育廳課題項目（編號：2006B058）

劉君（1971-），博士學位，副研究員。研究方向：中藥藥效物質(zhì)基礎研究