甘肅甘南野生羊肚菌液體發(fā)酵生長動力學(xué)研究

王龍，秦鵬，郭瑞，趙玉卉，王潔，路等學(xué)

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

甘肅甘南野生羊肚菌液體發(fā)酵生長動力學(xué)研究

王龍，秦鵬，郭瑞，趙玉卉，王潔，路等學(xué)

（甘肅省科學(xué)院生物研究所，甘肅蘭州730000）

以甘肅甘南地區(qū)野生羊肚菌（Morchella esculenta）為研究對象，運用遺傳算法進行了羊肚菌M.esculenta液體菌種發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)估計，通過對不同初始串集的多次實驗，各動力學(xué)參數(shù)估計收斂值結(jié)果基本一致。此外，運用Monod模型、Logistic模型以及1stOpt（FirstOptimization）軟件對羊肚菌M.esculenta生長過程進行了擬合，通過對方程模擬結(jié)果的誤差分析、相關(guān)性分析、中位數(shù)檢驗以及數(shù)據(jù)分布檢驗最終選擇Logistic模型和1stOpt擬合模型作為此次實驗羊肚菌M.esculenta液體菌種深層發(fā)酵生長動力學(xué)模型。

羊肚菌；液體發(fā)酵；生長動力學(xué)

羊肚菌（Morchella esculentaspp.）俗稱羊雀菌、羊肚菜或草笠竹，隸屬于子囊菌亞門（Ascomycotina），盤菌綱（Discomycetes），盤菌目（Pezizales），羊肚菌科（Morchellacea），羊肚菌屬（Morchella），因其菌蓋表面具有棱脊型的網(wǎng)狀體，外觀極似羊肚而得名[1-2]。羊肚菌富含各類氨基酸和維生素，又因其肉質(zhì)脆嫩，風(fēng)味獨特，自古以來一直被奉為宴席上的美味佳肴，在國內(nèi)外是食（藥）用真菌中的珍品之一。中醫(yī)認(rèn)為其具有理氣化痰、壯陽補腎、提神醒腦的功效；而西醫(yī)認(rèn)為此菌可降血脂，調(diào)節(jié)免疫功能，具有抗疲勞、抗輻射和抗腫瘤的作用[3-4]。自1897年BOUDIER首次建立羊肚菌屬以來，菌物學(xué)家們在羊肚菌的分類、分布、生態(tài)、菌種保育及栽培技術(shù)等方面做了大量的研究工作[5-8]。目前，由于尚未解決羊肚菌人工栽培工業(yè)化生產(chǎn)的問題，液體菌種深層發(fā)酵在一定程度上解決了羊肚菌資源缺乏的現(xiàn)狀。當(dāng)前，羊肚菌的研究多集中于液體菌種深層發(fā)酵生產(chǎn)菌絲體和多糖為目的，但對其發(fā)酵動力學(xué)研究較為少見[9]。本實驗主要以羊肚菌液體菌種為研究對象，利用遺傳算法進行參數(shù)估計，預(yù)測其菌絲體生長的宏觀狀態(tài)隨時間的變化情況，為發(fā)酵過程優(yōu)化控制及發(fā)酵規(guī)模的進一步擴大奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株采自甘肅甘南地區(qū)的迭部縣境內(nèi)，并經(jīng)上海基康生物技術(shù)有限公司測序后，通過Genbank比對，最終確定為羊肚菌（Morchella esculenta）。參照周麗偉[10]篩選出的羊肚菌M.esculenta最佳液體發(fā)酵培養(yǎng)基為本實驗所用，其配方為麩皮5%，蔗糖4%，KH2PO40.15%，MgSO40.15%，酵母膏0.5%，初始pH6.0，接種量為2%。

1.2 儀器與設(shè)備

BSD-WX（F）3350臥式搖床：上海博迅實業(yè)有限公司；SZK-750紫外可見分光光度計：深圳歐克儀表科技有限公司；DHG-9070A型立式鼓風(fēng)干燥箱：上海捷呈實驗儀器有限公司；JA2603B電子精密天平：上海精科天美貿(mào)易有限公司；TDL-60B低速臺式離心機：上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌絲培養(yǎng)方法

將羊肚菌M.esculenta斜面菌株在無菌環(huán)境下直接接入三角瓶液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，裝液量為200 mL/500 mL，培養(yǎng)溫度23℃，搖床轉(zhuǎn)速160 r/min條件下振蕩培養(yǎng)120 h。

1.3.2 菌絲生物量測定

參照王瑩等[11]的取樣方法，每隔12 h取發(fā)酵液一次（20 mL），3 000 r/min離心15 min；沉淀菌絲用無菌水沖洗2～3次，置于鼓風(fēng)干燥箱，50℃烘干至質(zhì)量恒定；然后用分析天平稱質(zhì)量，計算菌絲體生物量，生物量的測定公式見（1），實驗設(shè)3個重復(fù)。

1.3.3 生長動力學(xué)模型

微生物液體菌種的生長隨發(fā)酵時間的進行，其菌絲體生物量呈現(xiàn)非線性的變化[12-13]。依據(jù)本實驗菌絲體深層培養(yǎng)的具體情況對羊肚菌M.esculenta生長條件進行一定的假設(shè)：假設(shè)1，菌絲體的生長為均衡式生長，即菌絲體細(xì)胞內(nèi)各種成分呈相同比例增加，描述生長的唯一變量是菌絲生物量；假設(shè)2，培養(yǎng)基組分中只有碳源是限制菌絲生長的因素，其他組分均為過量且不影響其生長；假設(shè)3，在一定的發(fā)酵時間內(nèi)，菌絲體生長得率為一常數(shù)。

真菌生長動力學(xué)模型常用Monod模型和Logistic模型進行描述[14]?；谏鲜龅募僭O(shè)，本實驗運用以上兩種模型對羊肚菌M.esculenta生長過程進行擬合；再運用綜合優(yōu)化分析軟件1stOpt（first optimization）對羊肚菌M.esculenta生長過程進行非線性模型擬合。通過分析三個模型預(yù)測值誤差，檢驗預(yù)測值與實驗值得相關(guān)性，中位數(shù)及分布類型，最終確定適合本實驗羊肚菌M.esculenta的生長動力學(xué)模型。

（1）Monod模型：Monod模型是從經(jīng)驗得出的，常稱為形式動力學(xué)。Monod模型是目前應(yīng)用最廣泛、形式最簡單的微生物生長動力學(xué)模型。Monod模型描述培養(yǎng)基組分中只有碳源作為唯一的限制性因素（其他營養(yǎng)組分均為過量且不影響菌絲體生長）前提下，液體發(fā)酵基質(zhì)中碳源質(zhì)量濃度和羊肚菌菌絲體生物量的關(guān)系，其形式見（2）。

式中：Cx為菌絲體生物量，g/L；t為發(fā)酵時間，h；umax為最大生長速率，h-1；Cs為發(fā)酵液中碳源質(zhì)量濃度，g/L；Ks為飽和常數(shù)，g/L。

（2）Logistic模型：Logistic模型主要用途之一就是預(yù)測，在建立了logistic模型后，可以根據(jù)模型預(yù)測在不同的自變量情況下，發(fā)生某種情況的概率大小。本實驗Logistic模型以描述菌絲體生長速率與營養(yǎng)物質(zhì)之間非線性的經(jīng)驗?zāi)Ｐ?，其形式見?）。

式中：umax′為最大生長速率，h-1；Cxmax為最大菌絲生物量，g/L。

（3）1stOpt軟件：1stOpt是目前唯一能以任何初始值而求得美國國家標(biāo)準(zhǔn)與技術(shù)研究院（National Institute of StandardsandTechnology，NIST）非線性回歸測試題集最優(yōu)解的軟件包。在非線性回歸，曲線擬合及非線性復(fù)雜工程模型參數(shù)估算求解等領(lǐng)域首屈一指，而1stOpt憑借其超強的尋優(yōu)，容錯能力，在＞90%情況下，從任一隨機初始值開始，都能求得正確結(jié)果[15]。

1.3.4 遺傳算法的參數(shù)估計

遺傳算法（genetic algorithms，GA）是一種基于生物自然選擇與遺傳機理的隨機搜索算法，以其高效、自適應(yīng)及益于全局搜索的優(yōu)勢在很多領(lǐng)域中得到應(yīng)用。它的搜索面廣，尋優(yōu)速度快，得到的結(jié)果能以較大概率接近全局最優(yōu)解，對于解決發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)估計問題具有不可比擬的優(yōu)勢[16]。

本實驗利用Matlab 2010a對Monod和Logistic模型進行參數(shù)估計，根據(jù)該語言特點和GA算法的基本原理以及所研究體系的具體情況，制定相應(yīng)的操作方案[17]。

（1）初始化種群：個體是由二進制串組成染色體的基因碼，可以隨機產(chǎn)生一定數(shù)目的個體組成初始種群，種群的大小決定遺傳算法GA參數(shù)估計的質(zhì)量。種群規(guī)模若過小，其所含的信息太少，不能發(fā)揮遺傳算法GA的效力；若過大，計算量隨之增加，收斂時間延長。本試驗選用的群體個數(shù)為隨機產(chǎn)生的60個個體，數(shù)據(jù)類型為雙精度浮點型。

（2）參數(shù)范圍：參考相關(guān)資料[18]，為了盡可能擴大參數(shù)的尋優(yōu)范圍，又避免盲目搜索及減少計算量，設(shè)定相關(guān)參數(shù)范圍為umax，umax′∈[0.01，1]，Yx/s∈[0.1，1]，ks∈[50，200]，Cxmax∈[13，16]，m0∈[0.0001，0.1]。

（3）適應(yīng)度：遺傳算法GA依據(jù)個體與適應(yīng)度的比較而確定，預(yù)測值的誤差（d值）越小，其適應(yīng)度就越大，說明存活和生殖機會越高，被選擇到下一代的概率也就越大。本實驗的適應(yīng)度用實驗值與模型預(yù)測值的離均差平方和的倒數(shù)表示，其形式見（4）。

若y為實驗值，y′為預(yù)測值，則

（4）遺傳代數(shù)、選擇、交叉和變異：A、遺傳代數(shù)為達(dá)到100為準(zhǔn)；B、選擇則依據(jù)適應(yīng)度優(yōu)秀的個體作為下一代，本實驗采用輪盤賭選擇法，適應(yīng)度越高的個體在父代中被選中的概率越大；C、交叉則指父代的部分基因進行交叉而得到下一代新的個體的操作，交叉體現(xiàn)了信息交換的思想，是遺傳算法GA獲取新優(yōu)良個體的最重要的手段。本實驗采用單點交叉法，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)交叉概率pc選擇0.4時擬合程度較好；D、變異則指在群體中選中一個個體后，通過隨機變化該個體的基因型而得到新的個體，經(jīng)試驗發(fā)現(xiàn)取單點變異概率pm為0.05時最適宜。

綜合上述條件的建立，最后確定求解條件，其形式見（5）。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌絲生物量測定

該實驗羊肚菌M.esculenta菌絲體生物量的測定結(jié)果（表1）可以看出，在設(shè)定溫度下，羊肚菌菌絲生物量與發(fā)酵時間有一定的正相關(guān)性，即發(fā)酵時間越長，菌絲產(chǎn)量越大。

表1 羊肚菌M.esculenta液體菌種菌絲體生物量的測定結(jié)果Table 1 Determination results of mycelium biomass ofM.esculenta liquid culture

2.2 模擬結(jié)果與誤差分析

表2 實驗值與Monod，Logistic和1stOpt擬合預(yù)測結(jié)果Table 2 Fitting predicting results of the experiment value,and predicting results of Monod,Logistic&1stOpt model

Monod模型和Logistic模型利用Matlab 2010a遺傳算法GA進行參數(shù)估計，利用Matlab語言進行編程，設(shè)定交叉概率pc=0.4，變異概率pm=0.05，初始種群數(shù)為60，遺傳代數(shù)為100代；利用1stOpt軟件的全局搜索功能直接進行模型擬合。經(jīng)上述操作后得到三個預(yù)測模型，預(yù)測值與實驗值的進化過程和擬合結(jié)果匯總見表2所示。由表2可知，從進化過程中可以看出Logistic方程及1stOpt軟件擬合進化速度比Monod方程快，菌絲產(chǎn)量較高；而且前兩者測量誤差值也較Monod方程誤差值小。

1stOpt擬合的模型預(yù)測值誤差為4.6185，分別小于Logistic模型的6.5922和Monod模型的9.720 3，說明這三種模型在數(shù)據(jù)擬合過程中，1stOpt軟件的擬合程度最好，且誤差最??；其次是Logistic模型，Monod模型擬合效果不太理想。

2.3 檢驗分析

2.3.1 相關(guān)性分析

相關(guān)性分析是指對兩個或多個具備相關(guān)性的變量元素進行分析，從而衡量兩個變量因素的相關(guān)密切程度。由表3可以看出，通過皮爾遜相關(guān)系數(shù)（pearson correlation）分析時發(fā)現(xiàn)，在N（number）=11，即多個變量共11個數(shù)據(jù)參加運算中，Monod模型、Logistic模型和1stOpt軟件預(yù)測值與發(fā)酵時間、實驗值之間的絕對值均＞0.978，說明檢驗的多個變量之間相關(guān)密切程度很強。并且相關(guān)顯著性系數(shù)Sig.（2-tailed）=0.01，說明在99.99%的幾率上，皮爾遜相關(guān)系數(shù)成立，呈極顯著相關(guān)（P＜0.01）。

表3 Monod，Logistic和1stOpt相關(guān)性分析Table 3 Correlation analysis of Monod,Logistic&1stOpt

2.3.2 中位數(shù)檢驗

假設(shè)：（1）H0：各模型預(yù)測值與實驗值的中位數(shù)在總體上相等；（2）H1：各模型預(yù)測值與實驗值的中位數(shù)在總體上不相等。

表4 Mann-Whitney U非參數(shù)檢驗表Table 4 Non-parametric test of Mann-Whitney U

在實驗值和預(yù)測值數(shù)據(jù)為小樣本且數(shù)據(jù)分布未知時，則首先應(yīng)對各模型預(yù)測值與實驗值之間運用獨立樣本Mann-Whitney U方法進行中位數(shù)檢驗，由表4可知，在0.01和0.05顯著性水平下，對于三種模型都不拒絕H0，認(rèn)為3種模型的預(yù)測值和實驗值的中位數(shù)在總體上無顯著差異（P＞0.05）。

2.3.3 數(shù)據(jù)分布檢驗

假設(shè)：（1）H0：各模型預(yù)測值與實驗值的分布類型在總體上相同；（2）H1：各模型預(yù)測值與實驗值的分布類型在總體上不同。

運用獨立樣本K-S檢驗對預(yù)測值和實驗值的分布進行分析，結(jié)果見表5。結(jié)果表明，在0.01和0.05顯著性水平下，對于三種模型也都不拒絕H0，認(rèn)為3種模型預(yù)測值和實驗值的分布在總體上無顯著性差異（P＞0.05）。

表5 K-S檢驗表Table 5 Inspection table of K-S

綜上所述，1stOpt擬合模型和Logistic模型較Monod模型更能實際的反映本實驗數(shù)據(jù)的真實情況，見圖1。因此，最終采用1stOpt擬合模型和Logistic模型作為此次實驗羊肚菌M.esculenta生物量及其生長趨勢的預(yù)測模型，其形式分別見（6）和（7）。

圖1 實驗值,Logistic&1stOpt數(shù)據(jù)分布圖Fig.1 Distribution diagram of experiment value,Logistic&1stOpt data

1stOpt擬合模型：

（t=12，24，……，120，t為正整數(shù)；Cx∈（1.231 3，13.767），Cx為實數(shù)）

Logistic模型：

（t=12，24，……，120，t為正整數(shù)；Cx∈（1.230 1，13.418 9），Cx為實數(shù)）

3 結(jié)論

鑒于羊肚菌M.esculenta的生理功效和醫(yī)學(xué)價值，希望進一步了解羊肚菌在深層發(fā)酵情況下的生長規(guī)律。本實驗運用遺傳算法進行了羊肚菌M.esculenta液體菌種發(fā)酵動力學(xué)參數(shù)估計，整個過程充分體現(xiàn)了遺傳算法的高效性，通過對不同初始串集的多次實驗，各動力學(xué)參數(shù)估計收斂值與上述結(jié)果基本一致?？梢哉J(rèn)為，所得到的結(jié)果以較大的概率接近全局最優(yōu)解。此外，本實驗運用Monod模型、Logistic模型以及1stOpt軟件對羊肚菌M.esculenta生長過程進行擬合，需求最優(yōu)解。最終選擇Logistic模型和1stOpt擬合模型作為此次實驗羊肚菌M.esculenta深層發(fā)酵生長模型。

[1]黃年來，林志彬，陳國良.中國食藥用菌學(xué)[M].上海：上海科學(xué)技術(shù)文獻出版社，2010：1375-1391.

[2]黃年來.中國大型真菌原色圖鑒[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，1998：473-512.

[3]李娟，王臻，姚良同，等.羊肚菌多糖研究進展[J].微生物學(xué)雜志，2005，25（4）：89-91.

[4]張志華，余漢新，李顯軍，等.我國綠色食品產(chǎn)業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略研究[J].中國農(nóng)業(yè)資源與區(qū)劃，2015，36（3）：35-38.

[5]任桂梅，張少剛.羊肚菌的研究進展[J].延安大學(xué)學(xué)報·自然科學(xué)版，1999，18（1）：57-64.

[6]HU W S,SWARTZ J R.Biochemical engineering fundamentals:the foundations of our profession[J].Biotechnol Progr,2010,14(1):1-2.

[7]KIRK P M,CANNON P F,DAVID J C,et al.Dictionary of the fungi[M]. 9th ed.London:CAB International Wallingford,2001:655p.

[8]謝占玲，謝占青.羊肚菌研究綜述[J].青海大學(xué)學(xué)報·自然科學(xué)版，2007，25（2）：36-40.

[9]武秋立，安家彥.羊肚菌胞外多糖發(fā)酵動力學(xué)模型[J].南開大學(xué)學(xué)報：自然科學(xué)版，2005，38（1）：43-48.

[10]周麗偉.羊肚菌培養(yǎng)條件優(yōu)化及其多糖生物活性的研究[D].合肥：安徽大學(xué)，2007.

[11]王瑩，樸美子，孫永海.基于遺傳算法的羊肚菌液體發(fā)酵動力學(xué)模型的建立[J].生物工程學(xué)報，2008，24（8）：1454-1457.

[12]BAIEY J E,OLLIS D F.Biochemical engineering fundamentals[M]. New York:McGrawl Hill Book Company,1996:1170-1174.

[13]張建國，宋淵，李季倫.靈芝寶外多糖分批發(fā)酵動力學(xué)[J].生物工程學(xué)報，2007，23（6）：1065-1070.

[14]王東陽，王健，陳寧.基于遺傳算法的谷氨酸發(fā)酵動力[J].生物技術(shù)通訊，2005，16（4）：407-408.

[15]李姣玉，何建軍.Lingo和1stOpt在結(jié)構(gòu)優(yōu)化設(shè)計中的應(yīng)用比較[J].價值工程，2012，24：9-10.

[16]雷英杰，張善文，李續(xù)武.MATLAB遺傳算法工具箱及應(yīng)用[M].西安：西安電子科技大學(xué)出版社，2005：103-107.

[17]飛思科技產(chǎn)品研發(fā)中心.MATLAB6.5輔助優(yōu)化計算與設(shè)計[M].北京：電子工業(yè)出版社，2003：281-289.

[18]陳宏文，方柏山，胡宗定.遺傳算法應(yīng)用于分批發(fā)酵動力學(xué)模型參數(shù)估算[J].華僑大學(xué)學(xué)報·自然科學(xué)版，2000，21（1）：71-75.

Liqiud fermentation growth kinetics ofMorchella esculentafrom Gannan region in Gansu province

WANG Long,QIN Peng,GUO Rui,ZHAO Yuhui,WANG Jie,LU Dengxue
(Institute of Biology,Gansu Academy of Science,Lanzhou 730000,China)

Using wildMorchella esculentafrom Gannan region in Gansu as research object,the liquid fermentation kinetic parameters ofM.esculenta was estimated using genetic algorithm.Through several experiments on different initial string sets,the results of kinetic parameters estimated value was basically identical.In addition,the growth process ofM.esculentawas fitted by Monod model,Logistic model and 1stOpt software.Through the error analysis,correlation analysis,median analysis and data distribution analysis of the simulated results by the equation,finally,Logistic model and 1stpt software were fitting for the experiments of the liquid fermentation growth kinetics ofM.esculenta.

Morchella esculenta;liquid fermentation;growth kinetics

S646.9

0254-5071（2017）06-0099-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.06.020

2016-12-21

甘肅省科學(xué)院青年科技創(chuàng)新基金項目（2016QN-07）；甘肅省科學(xué)院青年科技創(chuàng)新基金項目（2013QN-05）

王龍（1981-），男，副研究員，博士，研究方向為菌類作物育種與栽培。

*通訊作者：王潔（1979-），女，助理研究員，本科，研究方向為生物信息學(xué)。