芪參益氣滴丸對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制研究

陳君，李蕾，陳國(guó)華，劉傳亮，李文通

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院 研究生院，山東 濰坊 261042；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院 保健三科，

山東 濰坊 261041；3.山東省濰坊市人民醫(yī)院 健康管理中心，山東 濰坊 261041）

芪參益氣滴丸對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷的作用機(jī)制研究

陳君1，李蕾2，陳國(guó)華3，劉傳亮2，李文通1

（1.濰坊醫(yī)學(xué)院 研究生院，山東 濰坊 261042；2.山東省濰坊市人民醫(yī)院 保健三科，

山東 濰坊 261041；3.山東省濰坊市人民醫(yī)院 健康管理中心，山東 濰坊 261041）

目的 探討芪參益氣滴丸（QS）對(duì)大鼠心肌缺血再灌注時(shí)，心肌細(xì)胞尿路上皮癌胚抗原1（UCA1）長(zhǎng)鏈非編碼RNA、凋亡及凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法結(jié)扎SD大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支，造成心肌缺血40 min后剪斷結(jié)扎線，再灌注120 min，復(fù)制實(shí)驗(yàn)性心肌缺血再灌注模型，將36只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組（只穿刺不結(jié)扎，Control組）、缺血再灌注組（I/R組）、QS干預(yù)組（QS+I/R組），術(shù)后采用原位末端標(biāo)記法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，采用熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)分析并檢測(cè)3組大鼠心臟組織中UCA1的表達(dá)，Western blot檢測(cè)p27蛋白表達(dá)水平。結(jié)果QS+I/R組的細(xì)胞凋亡數(shù)與I/R組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；與I/R組比較，QS+I/R組UCA1整體表達(dá)水平上升，而p27蛋白減少（P＜0.05）；并且UCA1與p27蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。結(jié)論QS能降低大鼠缺血再灌注心肌細(xì)胞凋亡率，其可能通過(guò)上調(diào)UCA1水平，減少p27蛋白表達(dá)，保護(hù)損傷的心肌細(xì)胞。

芪參益氣滴丸；心肌缺血再灌注；細(xì)胞凋亡；尿路上皮癌胚抗原1；p27蛋白

缺血性心臟病是冠狀動(dòng)脈疾病死亡的最常見(jiàn)原因。對(duì)缺血心肌的血流再恢復(fù)雖然能降低整體死亡率，但是增加了再灌注損傷，即心肌缺血再灌注損傷（myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI），這極易導(dǎo)致心力衰竭、心律失常，甚至猝死，嚴(yán)重影響患者心功能。目前，中藥制劑防治MIRI研究已取得長(zhǎng)足進(jìn)展[1-2]。大量研究表明，芪參益氣滴丸（qishenyiqi dripping pills，QS）對(duì) MIRI具有一定保護(hù)作用[3]，但其作用機(jī)制卻少有研究。本實(shí)驗(yàn)以SD大鼠復(fù)制MIRI模型，進(jìn)一步探索研究芪參益氣滴丸對(duì)MIRI的保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 復(fù)制心肌缺血再灌注模型

健康雄性SD大鼠36只，體重210～240g，由濰坊醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室提供。36只大鼠隨機(jī)分成3組，即假手術(shù)組（Control組）、缺血再灌注組（I/R組）及芪參益氣滴丸（天津天士力股份有限公司）干預(yù)組（QS+I/R組）。常規(guī)復(fù)制大鼠缺血再灌注模型[4]。Control組只穿線不結(jié)扎，用生理鹽水灌胃，3次/d，持續(xù)4周；I/R組：缺血40 min后再灌注120 min，復(fù)制心肌缺血再灌注模型前給予生理鹽水灌胃，3次/d灌服，連續(xù)4周；QS+I/R組：復(fù)制模型同I/R組，復(fù)制模型前給予芪參益氣滴丸1.5 g/（kg·次）灌胃，溶于2 ml生理鹽水中，3次/d灌胃，連續(xù)灌服4周。

1.2 觀察指標(biāo)

1.2.1 心肌細(xì)胞凋亡測(cè)定 大鼠再灌注后2%戊巴比妥鈉麻醉（40 mg/kg，腹腔注射），采取靜脈血2.5 ml，快速取出心臟，摘除血管、脂肪等多余組織，10%甲醛固定，30%蔗糖脫水，取心肌組織約5 mm厚，石蠟包埋，制成5 μm切片。每只大鼠隨機(jī)取5張切片，根據(jù)末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的帶熒光的dUTP缺口末端標(biāo)記法，嚴(yán)格照說(shuō)明書(shū)步驟對(duì)進(jìn)行操作。切片放置光鏡下觀察，高倍鏡下正常心肌細(xì)胞核呈深藍(lán)色，顯示棕色核者為凋亡細(xì)胞（見(jiàn)圖1）[5]。細(xì)胞凋亡測(cè)定設(shè)備購(gòu)自德國(guó)寶靈曼公司。每張切片中各選取5個(gè)高倍鏡下視野，觀察并計(jì)算心肌細(xì)胞凋亡率（心肌細(xì)胞凋亡率=鏡下心肌細(xì)胞凋亡數(shù)/鏡下心肌細(xì)胞總數(shù)×100%）。

1.2.2 心肌組織中尿路上皮癌胚抗原1（urothelial carcinoma antigen 1，UCA1）的表達(dá) 提取新鮮心肌組織中總RNA，逆轉(zhuǎn)為cDNA后，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）分析并檢測(cè) 3 組大鼠心臟組織中UCA1的表達(dá)，具體操作步驟參考文獻(xiàn)[6]。

1.2.3 Western blot檢測(cè)p27蛋白的表達(dá) 各組大鼠處死后取出心臟，取結(jié)扎線以下的左心室心肌組織，加入蛋白裂解液中研磨，取其變性后的上清液進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜，10%脫脂奶粉、三羥甲基氨基甲烷緩沖鹽溶液（tris buffered saline and tween 20，TBST）洗滌，加入 p27一抗，4℃過(guò)夜，加入相應(yīng)二抗孵育30 min，用增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法試劑顯影，凝聚成像系統(tǒng)進(jìn)行掃描處理。Quality one軟件對(duì)顯色后結(jié)果進(jìn)行灰度分析，并計(jì)算出p27蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較用單因素方差分析，方差齊則兩兩比較用SNK-q檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 芪參益氣滴丸對(duì)大鼠心肌細(xì)胞凋亡的影響

在熒光顯微鏡下，I/R組、QS+I/R組及Control組細(xì)胞凋亡率比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。QS+I/R組大鼠的細(xì)胞凋亡率低于I/R組，但兩組均高于Control組。見(jiàn)附表和圖1、2。

附表 3組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、UCA1及p27蛋白表達(dá)的比較 （n=12，±s）

附表 3組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率、UCA1及p27蛋白表達(dá)的比較 （n=12，±s）

組別p27蛋白Control組 2.34±0.25 1.03±0.13 0.58±0.08 I/R 組 10.03±0.97 0.39±0.04 1.23±0.12 QS+I/R 組 4.18±0.59 0.72±0.11 0.75±0.10 F值 8.330 26.590 10.350P值 0.002 0.007 0.015細(xì)胞凋亡率/%UCA1

2.2 芪參益氣滴丸對(duì)大鼠心肌細(xì)胞UCA1表達(dá)水平的影響

I/R組、QS+I/R組及Control組長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long noncoding RNA，LncRNA）UCA1表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。QS+I/R組和I/R組大鼠UCA1表達(dá)較Control組下降，但QS+I/R組大鼠UCA1表達(dá)下降程度低于I/R組。見(jiàn)附表和圖3。

圖1 3組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況 （熒光顯微鏡×200）

圖2 3組大鼠心肌細(xì)胞凋亡率比較 （n=12，±s）

圖3 3組大鼠心肌細(xì)胞UCA1相對(duì)表達(dá)量 （n=12，±s）

圖4 3組大鼠心肌細(xì)胞p27蛋白相對(duì)表達(dá)量（n=12，±s）

2.3 芪參益氣滴丸對(duì)大鼠心肌細(xì)胞p27蛋白表達(dá)的影響

I/R組、QS+I/R組及Control組p27蛋白表達(dá)水平比較，經(jīng)方差分析，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。QS+I/R組和I/R組大鼠p27蛋白表達(dá)較Control組升高，但QS+I/R組大鼠p27蛋白表達(dá)水平低于I/R組。見(jiàn)附表和圖4、5。

圖5 p27蛋白的表達(dá)

3 討論

心肌缺血再灌注損傷是臨床上冠狀動(dòng)脈內(nèi)溶栓、冠狀動(dòng)脈搭橋及心血管介入治療中常見(jiàn)的嚴(yán)重并發(fā)癥，其發(fā)生機(jī)制復(fù)雜[7]。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞凋亡參與MIRI過(guò)程，并在缺血再灌注誘導(dǎo)的病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用[8]。抑制心肌細(xì)胞凋亡可顯著縮減I/R后心肌梗死體積，減輕心肌損傷，改善心功能[9-10]。因此，減少或抑制MIRI中心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)臨床治療和預(yù)防MIRI，改善心肌梗死患者預(yù)后具有重要意義。最新研究發(fā)現(xiàn)，LncRNA UCA1可通過(guò)下調(diào)腫瘤抑制基因p27，對(duì)心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響[11]。這對(duì)研究MIRI中有關(guān)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡程序的分子成分提供新的視角。

LncRNA UCA1是最近幾年發(fā)現(xiàn)的一種長(zhǎng)鏈非編碼RNA，其最早在人膀胱移行細(xì)胞癌中發(fā)現(xiàn)，并在膀胱癌患者的尿液中檢出[12]。在正常成人中，UCA1基因僅在心臟、脾臟表達(dá)，并且心臟表達(dá)水平較高，表明其可能是潛在的心血管疾病的標(biāo)志物[13-14]。有研究表明，在膀胱惡性腫瘤細(xì)胞中，膀胱癌細(xì)胞中UCA1下調(diào)能夠降低膀胱癌細(xì)胞的增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示心肌組織中UCA1表達(dá)下調(diào)可能起抑制心肌細(xì)胞增殖，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡的作用，表明UCA1可能在心臟保護(hù)方面發(fā)揮重要作用[15]。

p27蛋白作為一種腫瘤抑癌基因，可參與多種基因和蛋白的調(diào)控，主要是通過(guò)抑制細(xì)胞周期或者其他不確定機(jī)制來(lái)實(shí)現(xiàn)[16]，TAMAMORI-ADACHI等[17]報(bào)道，p27蛋白表達(dá)的下調(diào)能夠促進(jìn)大鼠新生心肌細(xì)胞的增殖。本研究結(jié)果表明，I/R組大鼠不僅細(xì)胞凋亡數(shù)增加，而且心肌細(xì)胞p27蛋白表達(dá)也上升，提示p27上調(diào)與細(xì)胞凋亡緊密相關(guān)。有研究證實(shí)，p27蛋白的過(guò)度表達(dá)抑制心肌活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[18]。

本實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)，UCA1水平在大鼠缺血性心肌再灌注后降低，而p27蛋白的表達(dá)卻增加，p27蛋白的過(guò)度表達(dá)抑制心肌活性，促進(jìn)細(xì)胞凋亡。研究表明，p27引發(fā)細(xì)胞凋亡機(jī)制與Caspase-3的激活有一定關(guān)聯(lián)[19]。心肌細(xì)胞凋亡潛在的確切分子機(jī)制可能包括依賴于UCA1下調(diào)的p27過(guò)度表達(dá)[11]。

參益氣滴丸是純中藥制劑，是中醫(yī)理論基礎(chǔ)上取自黃芪、丹參、降香及三七4味中藥精制而成的益氣活血處方。方中重用黃芪為君，取其補(bǔ)氣血、促血行和培元固本之效；丹參活血調(diào)血，兼養(yǎng)心血，安神定志，用之為臣；三七活血散瘀，助丹參祛瘀止痛，為佐藥；最后輔以降香行氣解郁，溫通行滯。諸藥合用，發(fā)揮良好協(xié)同作用，起到通絡(luò)止痛、益氣活血之效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，黃芪能夠增強(qiáng)心肌收縮，擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈，并能夠使患者的血漿內(nèi)皮素、腫瘤壞死因子、心鈉素、血管緊張素下降，有效修復(fù)心肌供血，調(diào)理患者血壓，對(duì)缺血心肌有保護(hù)作用[20]。丹參具有抗氧化、清除自由基和抑制細(xì)胞內(nèi)鈣超載、維持心肌能量代謝、減少血小板聚集、降低血液黏度、降低細(xì)胞凋亡因子的表達(dá)等作用，有效緩解冠狀動(dòng)脈痙攣，改善心肌血供和代謝，臨床廣泛應(yīng)用于心血管疾病的治療[21]。三七中的三七總皂成分具有擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈、增加冠狀動(dòng)脈血流量的作用，還能夠降低血壓，改善心肌供血，提高心功能；降香能夠降低炎癥反應(yīng)，抑制細(xì)胞壞死，抑制血栓形成，改善局部微循環(huán)[22-23]。綜上所述，芪參益氣滴丸通過(guò)多層面、多體系的參與，對(duì)心肌缺血再灌注損傷起到一定保護(hù)作用。

本研究重點(diǎn)觀察芪參益氣滴丸對(duì)缺血再灌注模型大鼠心肌UCA1和p27蛋白表達(dá)的影響，結(jié)果顯示，芪參益氣滴丸治療組的細(xì)胞凋亡數(shù)少于I/R組。與I/R組比較，QS+I/R組UCA1表達(dá)水平上升，同時(shí)p27蛋白降低。并且發(fā)現(xiàn)UCA1與p27蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，提示芪參益氣滴丸可能通過(guò)上調(diào)UCA1水平，減少p27蛋白表達(dá)，減少心肌細(xì)胞凋亡。已有研究證實(shí)，UCA1可通過(guò)下調(diào)腫瘤抑制基因p27，對(duì)心肌細(xì)胞凋亡產(chǎn)生影響[11]。

綜上所述，芪參益氣滴丸可減少心肌細(xì)胞凋亡，對(duì)缺血再灌注心肌損傷有一定保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與上調(diào)UCA1水平、減少p27蛋白表達(dá)相關(guān)。

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（童穎丹 編輯）

Protective effect of Qishenyiqi Dripping Pills on rats with myocardial ischemia-reperfusion injury

Jun Chen1,Lei Li2,Guo-hua Chen3,Chuan-liang Liu2,Wen-tong Li1
(1.Graduate School,Weifang Medical University,Weifang,Shandong 261042,China;2.The Third Department of Health,3.Health Management Center,Weifang People's Hospital of Shandong,Weifang,Shandong 261041,China)

ObjectiveTo investigate the effect of Qishenyiqi Dripping Pills on urothelial carcinoma antigen 1 (UCA1)LncRNA,apoptosis and apoptosis related gene expression of myocardial cells in rats with myocardial ischemia reperfusion.MethodsIschemia reperfusion injury model of SD rats was established by ligating left anterior descending branch of coronary artery for 40 min followed by reperfusion for 120 min.Thirty-six rats were randomly divided into sham operation group(only puncture wihout ligation),ischemia-reperfusion group(IR group)and Qishenyiqi intervention group (QS+IR group).After operation,the apoptosis index was detected by TUNEL method;fluorescence quantitative PCR technique and Western blot were used to detect the expression levels of UCA1 and p27 protein respectively.ResultsThe number of apoptosis in the QS+IR group was significantly smaller than that in the IR group(P＜0.05).The overall level of UCA1 expression significantly increased and p27 protein markedly decreased in the QS+IR group compared with the IR group(P＜0.05);and the expression of UCA1 was negatively correlated with the expression of p27 protein.ConclusionsQishenyiqi Dripping Pills can reduce myocardial apoptosis rate in rats with myocardial ischemia and reperfusion,which may protect the injured myocardial cells by increasing the level of UCA1 and reducing the expression of p27protein.

Qishenyiqi Dropping Pill;myocardial ischemia reperfusion;apoptosis;urothelial carcinoma antigen 1;p27 protein

R285

A

10.3969/j.issn.1005-8982.2017.12.006

1005-8982（2017）12-0030-05

2016-11-23

陳國(guó)華，E-mail：13022783557@163.com