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    骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化水平與Fas蛋白表達(dá)的相關(guān)性

    2017-07-18 11:50:13
    中國(guó)老年學(xué)雜志 2017年13期
    關(guān)鍵詞:增強(qiáng)子骨關(guān)節(jié)炎甲基化

    陳 夏 彭 丹 陶 懷 沈 奕 周 政

    (中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院骨科,湖南 長(zhǎng)沙 410011)

    骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨細(xì)胞Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化水平與Fas蛋白表達(dá)的相關(guān)性

    陳 夏 彭 丹 陶 懷1,2沈 奕 周 政

    (中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院骨科,湖南 長(zhǎng)沙 410011)

    目的 通過(guò)觀察骨關(guān)節(jié)炎(OA)軟骨細(xì)胞中Fas基因甲基化水平與Fas蛋白表達(dá)的相關(guān)性,探討Fas基因增強(qiáng)子區(qū)異常甲基化在OA發(fā)生和發(fā)展中的作用。方法 采用亞硫酸氫鈉方法處理基因組DNA,甲基化特異性PCR技術(shù)和免疫組織化學(xué)法分別檢測(cè)14例健康人和35例OA患者軟骨細(xì)胞中Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化水平和相關(guān)蛋白表達(dá)情況。結(jié)果 OA組Fas基因增強(qiáng)子區(qū)低甲基化率及軟骨細(xì)胞Fas蛋白表達(dá)陽(yáng)性率均明顯高于健康對(duì)照組(P<0.01),且Fas基因低甲基化及蛋白表達(dá)與性別,年齡無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。Fas增強(qiáng)子低甲基化與Fas蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(P<0.01)。結(jié)論 OA患者關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞Fas基因增強(qiáng)子區(qū)呈低甲基化狀態(tài),通過(guò)上調(diào)Fas蛋白表達(dá)參與OA的發(fā)生發(fā)展。

    骨關(guān)節(jié)炎;Fas增強(qiáng)子;甲基化

    近年研究證實(shí)軟骨細(xì)胞過(guò)度凋亡與骨關(guān)節(jié)炎(OA)發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)〔1〕。在某些病理?xiàng)l件下,軟骨細(xì)胞中一系列表達(dá)調(diào)控基因被激活,通過(guò)死亡受體途徑介導(dǎo)凋亡的發(fā)生。Fas/FasL信號(hào)傳導(dǎo)通路是介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要死亡受體途徑。已有研究表明,F(xiàn)as/FasL通路介導(dǎo)的軟骨細(xì)胞凋亡在關(guān)節(jié)軟骨損傷機(jī)制中起著重要的作用,而Fas基因表達(dá)受甲基化調(diào)控〔2〕。Petak等〔3〕用甲基化特異性PCR檢測(cè)了結(jié)腸癌患者癌組織細(xì)胞中的Fas基因增強(qiáng)子甲基化情況,發(fā)現(xiàn)Fas基因增強(qiáng)子甲基化降低了Fas蛋白的表達(dá)并且抑制了Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,表明甲基化在Fas蛋白表達(dá)調(diào)控上發(fā)揮著重要的作用。 de Andrés等〔4〕也報(bào)道OA的發(fā)生發(fā)展過(guò)程與軟骨細(xì)胞的DNA甲基化有一定相關(guān)性。 因此,DNA甲基化異常是影響細(xì)胞Fas表達(dá)及Fas介導(dǎo)OA中軟骨細(xì)胞凋亡的一個(gè)重要機(jī)制。本文采用亞硫酸氫鈉測(cè)序法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化情況,采用免疫組化法檢測(cè)關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞中Fas蛋白的表達(dá)情況,以探討Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化異常在OA發(fā)生發(fā)展中的作用及其調(diào)控機(jī)制。

    1 材料與方法

    1.1 一般材料 14例正常膝關(guān)節(jié)軟骨組織取自2012年9月至2014年7月因交通事故在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院行大腿中下段截肢的患者,男8例,女6例;年齡30~62(平均40)歲。35例OA膝關(guān)節(jié)軟骨組織取自2013年9月至2014年在中南大學(xué)湘雅二醫(yī)院就診,根據(jù)1995年美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)骨關(guān)節(jié)炎的診斷標(biāo)準(zhǔn),診斷為OA且有關(guān)節(jié)置換手術(shù)指征的患者,男16例,女19例;年齡52~79(平均65)歲。術(shù)中無(wú)菌采集標(biāo)本,每組標(biāo)本分為2份∶1份放液氮內(nèi)保存,進(jìn)行DNA甲基化檢測(cè);另 1份石蠟包埋,進(jìn)行免疫組化分析。

    1.2 亞硫酸氫鈉測(cè)序 軟骨細(xì)胞DNA提取參照TIANGEN公司的血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒具體說(shuō)明進(jìn)行操作:取軟骨組織50 mg,經(jīng)EDTA脫鈣液脫鈣后,加入組織裂解液進(jìn)行勻漿,勻漿經(jīng)蛋白酶K消化后,用吸附柱法提取軟骨組織DNA,分光光度計(jì)檢測(cè)DNA純度和濃度,瓊脂糖凝膠電泳法鑒定DNA完整性,4℃保存?zhèn)溆谩H?0 μl DNA 水溶液用EZ DNA甲基化試劑盒(北京天漠公司)進(jìn)行純化和DNA甲基化修飾,處理后的DNA儲(chǔ)存在-70℃冰箱中保存。根據(jù)文獻(xiàn)〔3〕報(bào)道的引物序列,由上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。Fas甲基化上游引物序列為5′-AGTTTCGGCGTTTTTCGGAGATTATTGC-3′,下游引物序列為5′-CACCCGCGCCGAAACGAACC-3′;Fas非甲基化上游引物序列為5′-GGTAGTTTTGGTGTTTTTTGGAGATTATTGT-3′,下游引物序列為5′-CACCCACACCAAAACAAACCTTTAAC-3′。PCR總反應(yīng)體系20 μl,DNA模板2.0 μl,上游和下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl,Taq酶10 μl,加ddH2O稀釋至總體積20 μl。取5 μl擴(kuò)增產(chǎn)物上樣,以2 μl DNA Marker作為標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照,2%瓊脂糖凝膠電泳,恒電壓(120 V)電泳25 min,溴乙啶染色,紫外燈下檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物,拍照保存圖片后,含目的樣品的PCR產(chǎn)物置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3 免疫組織化學(xué)檢測(cè) 石蠟包埋組織標(biāo)本,5 μm連續(xù)切片。采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶SP法檢測(cè),切片常規(guī)脫蠟處理后,置于抗原修復(fù)液中95℃修復(fù)10~15 min,其余步驟參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。切片經(jīng)梯度乙醇脫水、干燥、二甲苯透明,中性樹(shù)膠封固后,在顯微鏡下觀察并拍照。

    1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行χ2檢驗(yàn)或Fisher確切概率法檢驗(yàn)和Spearman等級(jí)相關(guān)分析。

    2 結(jié) 果

    2.1 DNA完整性檢測(cè) 提取的基因組DNA經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳,DNA片段大于600 bp。DNA完整,無(wú)降解,見(jiàn)圖1。

    2.2 OA患者和健康人軟骨細(xì)胞中Fas增強(qiáng)子區(qū)甲基化狀態(tài)比較 以DNA Marker作為對(duì)照,其中OA組與健康對(duì)照組軟骨細(xì)胞Fas基因增強(qiáng)子區(qū)低甲基化百分率分別為74.29%(26/35)和28.57%(4/14),兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=8.803,P=0.003),見(jiàn)圖2。

    1:DNA Marker;2~8:DNA樣品1~7圖1 基因組DNA瓊脂糖凝膠電泳條帶

    2.3 OA患者和健康人軟骨細(xì)胞中Fas蛋白表達(dá)情況 Fas 蛋白表達(dá)陽(yáng)性表現(xiàn)為胞質(zhì)或核膜出現(xiàn)棕黃色染色,經(jīng)分析,OA組與健康對(duì)照組軟骨細(xì)胞Fas蛋白陽(yáng)性率分別為77.14%(27/35)和14.29%(2/14),兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=16.356,P=0.002),見(jiàn)圖3。

    1:DNA Marker;2:Fas增強(qiáng)子區(qū)甲基化引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物(184 bp);3:Fas增強(qiáng)子區(qū)非甲基化引物擴(kuò)增后的產(chǎn)物(187 bp)圖2 兩組Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化狀態(tài)

    圖3 兩組軟骨細(xì)胞中Fas蛋白表達(dá)情況(DAB,×200)

    2.4 Fas基因甲基化及蛋白表達(dá)與性別、年齡之間的關(guān)系 Fas基因低甲基化及Fas蛋白表達(dá)與性別、年齡無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05),見(jiàn)表1。

    表1 所有研究對(duì)象Fas基因低甲基化及蛋白表達(dá)與性別、年齡的關(guān)系(n)

    2.5 OA患者軟骨細(xì)胞中Fas增強(qiáng)子區(qū)低甲基化狀態(tài)與蛋白表達(dá)的關(guān)系 26例Fas增強(qiáng)子低甲基化的OA患者中,有24例蛋白表達(dá)陽(yáng)性;而27例Fas蛋白表達(dá)陽(yáng)性的OA患者中,有24例Fas增強(qiáng)子低甲基化,F(xiàn)as增強(qiáng)子低甲基化與蛋白表達(dá)呈顯著正相關(guān)(r=0.614,P<0.01)。

    3 討 論

    OA是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和關(guān)節(jié)周?chē)琴|(zhì)增生為病理特征的慢性退行性疾病,其發(fā)病率隨年齡增長(zhǎng)逐漸增加。軟骨細(xì)胞作為成熟軟骨組織內(nèi)唯一細(xì)胞類型,在軟骨損傷及重塑過(guò)程中維持軟骨組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定,特別是軟骨細(xì)胞凋亡對(duì)OA 軟骨破壞起著關(guān)鍵性作用。已有研究表明,軟骨細(xì)胞凋亡參與了OA 的發(fā)生和發(fā)展〔5,6〕。Fas 蛋白是一種含有319個(gè)氨基酸的Ⅰ 型跨膜蛋白,可與細(xì)胞因子FasL結(jié)合傳導(dǎo)由FasL引起的細(xì)胞凋亡程序。Fas蛋白在正常軟骨細(xì)胞內(nèi)有一定水平的表達(dá),介導(dǎo)軟骨細(xì)胞處于凋亡與增殖的動(dòng)態(tài)平衡之中。Kim等〔7〕研究報(bào)道鳥(niǎo)苷代謝物通過(guò)增強(qiáng)Fas-FasL相互作用誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡,表明軟骨細(xì)胞中Fas/FasL信號(hào)傳導(dǎo)通路異常可能通過(guò)介導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡參與OA發(fā)生和發(fā)展過(guò)程。Tu 等〔8〕報(bào)道也證實(shí)OA 軟骨細(xì)胞中Fas蛋白較正常軟骨組織細(xì)胞高表達(dá)。本研究也發(fā)現(xiàn)與正常人相比,OA患者骨關(guān)節(jié)軟骨組織中Fas蛋白明顯高表達(dá)。因此,本文推測(cè)Fas蛋白表達(dá)增加可能是OA的發(fā)病機(jī)制之一。

    在某些病理情況下,基因增強(qiáng)子區(qū)域CpG島的甲基化干擾一些轉(zhuǎn)錄因子與基因調(diào)控區(qū)的結(jié)合或直接抑制RNA聚合酶活性而抑制基因的表達(dá)。Petak等〔3〕發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌患者癌組織細(xì)胞中Fas基因增強(qiáng)子區(qū)域DNA甲基化降低了Fas蛋白的表達(dá)并且抑制了Fas介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。Thaler等〔9〕發(fā)現(xiàn)小鼠原成骨細(xì)胞中Fas蛋白的表達(dá)下降與Fas基因的異常甲基化有密切關(guān)系。Jones等〔10〕發(fā)現(xiàn)Sezary綜合征中Fas基因的蛋白表達(dá)下降與Fas基因的高甲基化有關(guān)。因此,本文推測(cè)OA患者骨關(guān)節(jié)組織中Fas蛋白高表達(dá)可能與Fas基因增強(qiáng)子區(qū)甲基化異常有關(guān)。

    Fas基因低甲基化改變后,轉(zhuǎn)錄因子與低甲基化的增強(qiáng)子區(qū)域的DNA的結(jié)合,促進(jìn)Fas基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),導(dǎo)致Fas基因蛋白表達(dá)增加,而Fas蛋白的異常高表達(dá),增加了Fas/FasL介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,使軟骨細(xì)胞凋亡增加,最終參與了骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生和發(fā)展。

    1 Wang F,Wu L,Li L,etal.Monotropein exerts protective effects against IL-1β induced apoptosis and catabolic responses on osteoarthritis chondrocytes〔J〕.Int Immunopharmacol,2014;23(2):575-80.

    2 Hoa T,Hasunma T,Aono H,etal.Novel mechanisms of selective apoptosis in synovial T cells of with rheumatoid arthritis〔J〕.J Rheumatol,1996;23(7):1331-6.

    3 Petak I,Danam RP,Tillman DM,etal.Hypermethylation of the gene promoter and enhancer region can regulate Fas expression and sensitivity in colon carcinoma〔J〕.Cell Death Differ,2003;10(2):211-7.

    4 de Andrés MC,Imagawa K,Hashimoto K,etal.Loss of methylation in CpG sites in the NF-κB enhancer elements of inducible nitric oxide synthase is responsible for gene induction in human articular chondrocytes〔J〕.Arthritis Rheum,2013;65(3):732-42.

    5 Zamli Z,Robson Brown K,Tarlton JF,etal.Subchondral bone plate thickening precedes chondrocyte apoptosis and cartilage degradation in spontaneous animal models of osteoarthritis〔J〕.Biomed Res Int,2014;2014:1-10.

    6 Zamli Z,Adams MA,Tarlton JF,etal.Increased chondrocyte apoptosis is associated with progression of osteoarthritis in spontaneous Guinea pig models of the disease〔J〕.Int J Mol Sci,2013;14(9):17729-43.

    7 Kim DJ,Chung JH,Ryu EK,etal.Metabolic loading of guanosine induces chondrocyte apoptosis via the Fas pathway〔J〕.Exp Mol Med,2006;38(4):401-7.

    8 Tu Y,Xue H,Francis W,etal.Lactoferrin inhibits dexamethasone-induced chondrocyte impairment from osteoarthritic cartilage through up-regulation of extracellular signal-regulated kinase 1/2 and suppression of FASL,FAS,and Caspase 3〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2013;441(1):249-55.

    9 Thaler R,Karlic H,Spitzer S,etal.Extra-cellular matrix suppresses expression of the apoptosis mediator Fas by epigenetic DNA methylation〔J〕.Apoptosis,2010;15(6):728-37.

    10 Jones CL,Wain EM,Chu CC,etal.Downregulation of Fas gene expression in Sézary syndrome is associated with promoter hypermethylation〔J〕.Invest Dermatol,2010;130(4):1116-2.

    〔2016-01-30修回〕

    (編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

    彭 丹(1966-),男,博士,教授,博士生導(dǎo)師,主要從事骨性疾病發(fā)生機(jī)制研究。

    陳 夏(1984-),男,博士,主治醫(yī)師,主要從事骨性疾病發(fā)生機(jī)制研究。

    R684.3

    A

    1005-9202(2017)13-3188-03;

    10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.028

    1 湖南中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室

    2 湖南中醫(yī)藥大學(xué)干細(xì)胞調(diào)控與應(yīng)用實(shí)驗(yàn)室

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