胃癌組織中Mina53和Survivin基因的表達及臨床意義

阮 佼

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 宜昌 443001)

胃癌組織中Mina53和Survivin基因的表達及臨床意義

阮 佼

(三峽大學(xué)仁和醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，湖北 宜昌 443001)

目的 探討胃癌組織Mina53和Survivin的表達及臨床意義。方法 應(yīng)用RT-PCR技術(shù)檢測38例胃癌組織和對應(yīng)的癌旁組織中Mina53和Survivin mRNA表達水平，并統(tǒng)計其與胃癌臨床分期之間的關(guān)系。結(jié)果 胃癌組織中Mina53、Survivin mRNA陽性檢出率明顯高于癌旁組織，隨著胃癌臨床分期的上升，Mina53、Survivin mRNA表達水平也明顯升高。結(jié)論 Mina53和Survivin參與胃癌的發(fā)生發(fā)展，聯(lián)合檢測Mina53和Survivin可能有助于胃癌的早期臨床診斷、早期治療、病情評估及預(yù)后判定。

胃癌；Mina53；Survivin

胃癌的發(fā)生發(fā)展是一個涉及癌基因、抑癌基因、凋亡相關(guān)基因、轉(zhuǎn)移相關(guān)基因不同形式改變的復(fù)雜過程。大多數(shù)早期患者無典型的臨床癥狀，少數(shù)患者會出現(xiàn)惡心、嘔吐或是類似消化性潰瘍的上消化道不適癥狀，而待其出現(xiàn)較明顯的臨床表現(xiàn)如腹部持續(xù)性疼痛多提示腫瘤擴展已經(jīng)超出胃壁。如經(jīng)積極的手術(shù)治療、結(jié)合化療或其他輔助治療措施，早期胃癌的預(yù)后情況較好。在缺乏特異性腫瘤標(biāo)志物的情況下，X線鋇餐、胃鏡以及腹部CT在胃癌的診斷方面起到了非常重要的作用，但鋇餐和CT檢查需在有明顯形態(tài)改變的情況下方可有陽性發(fā)現(xiàn)，胃鏡可較前者更早期發(fā)現(xiàn)黏膜的形態(tài)改變并可直視下取組織活檢，但其終歸為一種有創(chuàng)檢查，過程較痛苦，而且多數(shù)健康查體人員對無痛胃鏡的接受率還不高。Mina53是新近發(fā)現(xiàn)在消化道腫瘤如結(jié)腸癌、食管癌組織中明顯高表達的一種有原癌基因c-Myc誘導(dǎo)的核抗原，已有研究表明其表達水平在胃癌組織中顯著高于正常胃黏膜組織，且同胃癌的臨床分期呈正相關(guān)〔1〕。Survivin是一種強有力的凋亡抑制因子，參與胃癌等〔2，3〕眾多腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程，胡華等〔4〕通過對胃癌患者血清中Survivin抗體的檢測發(fā)現(xiàn)胃癌組血清Survivin抗體水平明顯高于正常對照組，其與腫瘤的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、分化程度、臨床病理分期顯著相關(guān)。本研究擬對胃癌組織中原癌基因c-Myc誘導(dǎo)的核抗原Mina53和凋亡抑制因子Survivin的表達情況及其臨床意義進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料 2011年3月至2013年9月就診于三峽大學(xué)仁和醫(yī)院行手術(shù)治療且術(shù)前未行放化療的胃癌患者，并排除其他系統(tǒng)明顯疾患，手術(shù)切除胃癌組織標(biāo)本38例和距腫瘤邊緣>5 cm癌旁組織38例，男24例，女14例；年齡36～76〔平均(56.18±10.21)〕歲。組織標(biāo)本均經(jīng)病理科確診為胃癌，并根據(jù)國際抗癌聯(lián)盟TNM分級標(biāo)準(zhǔn)進行嚴格的臨床分期，其中Ⅰ期6例，Ⅱ期10例，Ⅲ期18例，Ⅳ期4例。所有標(biāo)本收集后均存放于-80℃冰箱凍存供后續(xù)實驗使用。

1.2 儀器和試劑 PCR儀(EppendofAG)，電泳槽(美國伯樂)，Trizol RNA提取試劑盒(Invitrogen)，RT-PCR試劑盒(大連寶生物工程有限公司)，低溫離心機(Eraeus instruments公司)，電子稱量儀(德國METTLER TOLEDO公司)。

1.3 PCR引物設(shè)計與合成 本實驗涉及Survivin、Mina53及內(nèi)參β-actin三條引物均由上海生工設(shè)計合成，Mina53上游：5′cccattatgatgatgtcga3′，下游：5′tgttctggtaggtgctgat3′；Survivin上游：5′caccgcatctctacattcaaga3′，下游：5′caagtctggctcgttctcagt3′；β-actin上游：5′ctgggacgacatggagaaaa3′，下游：5′aaggaaggctggaagagtgc3′。

1.4 RT-PCR檢測 將所有組織標(biāo)本逐一剪碎后置入勻漿器中，加入Trizol試劑按一步法提取各組織中總RNA，并按試劑盒中說明書測定各樣品中RNA的純度和濃度，以確保各OD260/OD280比值在1.8～2.0之間。取適量提取RNA反應(yīng)物嚴格按照試劑盒說明書進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)生成cDNA(反轉(zhuǎn)錄條件為30℃反應(yīng)10 min；42℃～60℃反應(yīng)15～30 min，95℃ 反應(yīng)5 min，5℃ 反應(yīng)5 min)，然后按試劑盒說明書反應(yīng)條件擴增：94℃預(yù)變性5 min，40個循環(huán)(94℃變性30 s，54℃退火45 s，72℃延伸10 s，共40個循環(huán))，72℃再延伸10 min。取擴增產(chǎn)物5 μl和緩沖液 2 μl混合均勻后于1.5%瓊脂糖凝膠上點樣電泳并將結(jié)果掃描成像統(tǒng)計分析，每一組織標(biāo)本重復(fù)擴增3次，產(chǎn)物量取平均值進行統(tǒng)計分析。

1.5 結(jié)果判讀 將所有組織標(biāo)本PCR電泳結(jié)果攝像分析，應(yīng)用凝膠分析系統(tǒng)處理，產(chǎn)物量以條帶光密度/面積表示，將不同標(biāo)本中Mina53和Survivin mRNA產(chǎn)物量同內(nèi)參β-actin mRNA產(chǎn)物量比值分別進行統(tǒng)計分析，計算各臨床分期胃癌組織及所有癌旁組織標(biāo)本中Mina53和Survivin mRNA陽性檢出率和平均表達水平。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件包進行χ2檢驗、單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 胃癌標(biāo)本組織和癌旁組織中Mina53、Survivin mRNA 檢出情況 癌旁組織中Mina53 mRNA、Survivin mRNA陽性檢測率分別為10.53%(4例)、18.42%(7例)，明顯低于癌組織中Mina53 mRNA〔26.11%(30例)〕、Survivin mRNA〔76.32%(29例)〕的陽性檢測率(χ2=35.98，25.54，P<0.01)。隨胃癌組織臨床分期的增高，Mina53、Survivin mRNA的檢出率并不呈逐漸增高趨勢(χ2=3.62，P>0.05)，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ期胃癌組織中Mina53和Survivin mRNA檢出率分別為50%(3例)、80%(8例)、83.33%(15例)、100%(4例)和66.67%(4例)、70%(7例)、77.78%(14例)、100%(4例)。

2.2 胃癌組織標(biāo)本和癌旁組織中Mina53和Survivin mRNA表達水平 不同臨床分期胃癌組織中Mina53 mRNA含量隨分期不斷增加(F=9.952，P<0.01)，Ⅲ期、Ⅳ期胃癌組織中Mina53 mRNA含量明顯高于癌旁組織(P=0.007和P<0.001)。不同臨床分期胃癌組織中Survivin mRNA含量也隨胃癌臨床分期的升高而不斷上升(F=9.101，P<0.01)，Ⅲ期、Ⅳ期胃癌組織中Survivin mRNA含量明顯高于癌旁組織(P=0.038和P=0.001)。見表1，圖1。

表1 不同分期胃癌組織和癌旁組織中Mina53和Survivin mRNA表達情況

與其他臨床分期胃癌組織比較：1)P<0.01；與癌旁組織比較：2)P<0.05

圖1 Mina53和Survivin mRNA在不同臨床分期胃癌組織中表達

3 討 論

Mina53為原癌基因myc誘導(dǎo)的核抗原并作為myc基因部分功能的具體行使者參與細胞增殖或分化的調(diào)節(jié)。它位于3號染色體(3q12.1)上，人類Mina53基因有12個外顯子，11個內(nèi)含子，編碼一種465個氨基酸的蛋白質(zhì)Mina53，分子量估計為52 800.28 D。其中第128～271號氨基酸序列中有一個JmjC結(jié)構(gòu)域，與DNA或染色質(zhì)結(jié)合，可能介導(dǎo)Mina53對染色質(zhì)重塑的調(diào)節(jié)作用，從而影響著基因的表達模式。研究表明Mina53的過度表達與多種腫瘤患者的預(yù)后呈負相關(guān)性，且在以結(jié)腸癌為代表的腫瘤組織中Mina53的過度表達更多地出現(xiàn)于疾病的早期階段〔5〕。王珂等〔1〕研究表明Mina53可能參與了胃癌的發(fā)生和發(fā)展，有望作為胃癌預(yù)后判斷的標(biāo)記物。而Survivin為凋亡抑制蛋白家族(IAP)中的一個新成員，結(jié)構(gòu)獨特。它只含有一個桿狀病毒IAP重復(fù)序列(BIR)結(jié)構(gòu)，羥基末端缺乏鋅指結(jié)構(gòu)，代以交織螺旋結(jié)構(gòu)(Coiled-Coil)，編碼分子量約16.5 kD的胞質(zhì)蛋白，mRNA編碼區(qū)包含426個堿基的開放閱讀框。Survivin能抑制FAS、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)、某些化療藥物、白細胞介素(IL)-3、腫瘤壞死因子(TNF)-α、X-射線誘導(dǎo)的凋亡，選擇性表達于胃癌、結(jié)直腸癌、非小細胞肺癌、膀胱癌、皮膚癌等常見惡性腫瘤，而在癌旁正常組織和成人分化組織并不表達，推測惡性腫瘤細胞Survivin的重新表達可能與獲得的某種異?？沟蛲瞿芰τ嘘P(guān)〔6〕。研究表明檢測組織中Surivin的表達情況可以協(xié)助臨床早期診斷胃癌和判定胃癌患者的預(yù)后〔2，7〕；胡華等〔4〕通過對胃癌患者血清中Survivin抗體的檢測得出血清中Survivin抗體水平有助于胃癌病情及預(yù)后的判斷。

本研究結(jié)果表明核抗原Mina53和凋亡抑制因子Survivin可能為介導(dǎo)胃癌發(fā)生和進展相關(guān)信號通路中的重要角色，其表達水平同胃癌的臨床分期明顯正相關(guān)，臨床上對其核酸或蛋白水平的檢測可能使得胃癌的早期診斷、靶向治療或預(yù)后判斷更加方便。本實驗結(jié)果有待后續(xù)大樣本量和蛋白水平、細胞水平、組織水平等多水平的多中心隨機對照實驗的進一步證實。后續(xù)研究可探索胃癌患者和健康志愿者體液標(biāo)本中Mina53和Survivin的表達情況及其與胃癌臨床分期和預(yù)后之間的關(guān)系，以期能夠進一步易化檢驗流程、提高胃癌早期診斷率，從而更早進行干預(yù)，提高胃癌患者的生活質(zhì)量，延長胃癌患者的生存時間。

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3 黃國福，冷曉玲，陸 紅.結(jié)腸癌組織中Survivin、Caspase-3、Ki-67表達水平〔J〕.中國老年學(xué)雜志，2012；32(18)：4083.

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5 Tsuneoka M，F(xiàn)ujita H，Arima N，etal.Mina53 as a potential prognosticfactor for esophageal squamous cell carcinoma〔J〕.Clin Cancer Res，2004；10(21)：7347-56.

6 Tamm I，Wang Y，Sausville E，etal.IAP-family protein Survivin inhibits caspase activity and apoptosis induced by Fas(CD95)，Bax，caspases and anticancer drugs〔J〕.Cancer Res，1998；58(23)：5315.

7 王 彬，譚逸然.Surivin表達在胃癌診斷中的作用研究〔J〕.陜西醫(yī)學(xué)雜志，2013；42(12)：1579-80.

〔2016-02-10修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢園)

阮 佼(1980-)，男，主治醫(yī)師，主要從事重癥醫(yī)學(xué)研究。

R604

A

1005-9202(2017)13-3179-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.024