抗Aβ42單鏈抗體對阿爾茨海默病小鼠腦中淀粉樣沉積的改善作用

劉 秦 方勇濤 陳 源 陳曉云

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510000)

抗Aβ42單鏈抗體對阿爾茨海默病小鼠腦中淀粉樣沉積的改善作用

劉 秦 方勇濤1陳 源2陳曉云3

(廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，廣東 廣州 510000)

目的 探討以β淀粉樣蛋白(Aβ)42為靶抗原篩選人源天然單鏈抗體(scFv)噬菌體抗體庫中的特異性抗體對阿爾茨海默病(AD)模型鼠中淀粉樣沉積的影響。方法 以Aβ42抗原包被免疫管，對人源天然scFv噬菌體抗體庫進(jìn)行篩選，經(jīng)過3輪吸附-洗脫-擴增淘選富集，制備單克隆噬菌體抗體顆粒，用酶聯(lián)免疫吸附(ELISA)法檢測scFv的結(jié)合活性，得到一株陽性克隆scFv23。采用Western印跡和免疫組化的方法檢測了scFv23與Aβ42單體、寡聚體、纖維和鼠腦中Aβ沉積的結(jié)合能力。并通過甲氮甲唑藍(lán)(MTT)法檢測scFv23對Aβ42寡聚體引起細(xì)胞毒性的影響，同時采用硫黃素-T熒光法(ThT-F)測定scFv23對Aβ42聚集形成纖維的影響。最后，通過體內(nèi)實驗檢測了scFv23對AD鼠模型腦中Aβ42沉積的影響。結(jié)果 通過對人源天然scFv噬菌體抗體庫進(jìn)行篩選得到一株與Aβ42具有高親和力的克隆scFv23。實驗發(fā)現(xiàn)scFv23可以特異性識別Aβ42寡聚體，纖維聚集體和鼠腦中Aβ42沉積，但是不能與Aβ42單體特異性結(jié)合。根據(jù)體外實驗結(jié)果，scFv23可以有效抑制Aβ42寡聚體所誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，并且scFv23可以抑制Aβ42纖維聚集體的形成。體內(nèi)實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，scFv23可以有效清除AD鼠模型中Aβ42沉積。結(jié)論 通過噬菌體文庫篩選得到的scFv23能夠特異性識別腦組織中的淀粉樣沉積，并且有效抑制轉(zhuǎn)基因鼠中淀粉樣沉積的形成。體外實驗表明scFv23可以有效抑制Aβ42寡聚體所誘導(dǎo)的細(xì)胞毒性。特異性識別Aβ42的scFv可能會成為治療AD的一種有效策略。

阿爾茨海默??；β淀粉樣蛋白；單鏈抗體；免疫治療

阿爾茨海默病(AD)是一個與年齡有很大關(guān)系的神經(jīng)退行性疾病〔1〕。β淀粉樣蛋白(Aβ)積累形成的老年斑(SP)和tau蛋白的過度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)(NFT)是病理上的主要特征〔2〕。淀粉樣沉積的主要組成是Aβ肽段。Aβ與其前體蛋白(APP)在AD的病理過程中發(fā)揮著重要作用，在轉(zhuǎn)基因鼠中過度表達(dá)突變的APP可以導(dǎo)致類似AD的病理學(xué)特征：β淀粉樣沉積。研究發(fā)現(xiàn)通過向這些AD模型鼠中注射合成的Aβ1～42肽段可以阻止和減輕腦內(nèi)的Aβ沉積，并且緩解記憶和學(xué)習(xí)能力的丟失〔3〕。臨床試驗表明，當(dāng)用Aβ肽段免疫患者的時候會引起患者腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)，這使臨床試驗不得不中止，而這種炎癥反應(yīng)可能是由T細(xì)胞或者Fc所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)〔4〕。與此同時，人們發(fā)現(xiàn)用Aβ抗體去免疫AD模型鼠同樣會引起腦中Aβ沉積的清除〔5〕。但是，盡管抗體的濃度低于血清濃度，還是會引起炎癥反應(yīng)。隨后人們選擇用只包含F(xiàn)(ab′)2的抗體片段去免疫AD鼠模型，人們發(fā)現(xiàn)免疫后的小鼠腦中的Aβ沉積被有效清除〔6〕。這說明不包含有Fc片段的抗體對于清除Aβ沉積也有效果。這使得不包含F(xiàn)c片段的抗體成為了一個可能治療AD的策略。

在本研究中，通過用Aβ與人源的單鏈抗體庫進(jìn)行雜交，篩選出能與Aβ寡聚體和大腦中淀粉樣斑塊特異性反應(yīng)的單鏈抗體。這個單鏈抗體可以抑制Aβ纖維聚集體的形成并且抑制Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)毒性；并且檢測了人源單鏈抗體在AD鼠模型中的作用。由于單鏈抗體中缺少Fc片段，所以人源單單抗體在用于治療AD患者的過程中可能不會伴有腦內(nèi)的炎癥反應(yīng)。本研究就此問題進(jìn)行觀察分析。

1 材料和方法

1.1 主要的試劑及材料 植物乙烯(ETH-2) human antibody phage library購自MRC HGMP Resource Centre，Cambridge UK。大腸桿菌(TG1)購自STRATGENE公司；輔助噬菌體(M13K07)購自Invitrogen公司；Aβ(1～42)肽、六氟異丙醇(HFIP)購自Sigma公司；辣根過氧化物酶(HRP)-anti-M13抗體，6E10，anti-His抗體，抗兔IgG，生物素抗兔二抗，HRP標(biāo)記鏈親和素購買自Santa Cruz；HRP標(biāo)記的增強型化學(xué)發(fā)光試劑(碧云天)；3，3′，5，5′-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)，噻唑藍(lán)(MTT)，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)試劑盒購買自Sigma公司；免疫管(Immuno-tube)購自丹麥NUNC公司；人胚腎細(xì)胞株(HEK293)細(xì)胞購于German Collection of Microorganisams and Cell Cultures；青霉素和鏈霉素購買自Sigma公司；胎牛血清(BSA)和DMEM培養(yǎng)基購買于GIBCO，Tg2576轉(zhuǎn)基因鼠購買自北京博泰宏達(dá)生物技術(shù)有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人胚腎細(xì)胞293(HEK293)培養(yǎng)于添加10% BSA，1%青霉素和鏈霉素雙抗，2 mmol/L谷氨酰胺的DMEM培養(yǎng)液中，放入5% CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長到80%左右進(jìn)行細(xì)胞傳代培養(yǎng)，加入適量的磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗除去未貼壁的細(xì)胞，加入1 ml 0.25%的胰蛋白酶室溫消化，細(xì)胞變圓后用彎頭滴管加入新鮮的培養(yǎng)液吹打瓶壁進(jìn)行細(xì)胞重懸，并對細(xì)胞進(jìn)行計數(shù)，根據(jù)所做實驗需要的細(xì)胞數(shù)對細(xì)胞進(jìn)行稀釋，將稀釋后的細(xì)胞傳到培養(yǎng)瓶，96孔板，24孔板或者6孔板進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3 Aβ單體和寡聚體的制備及鑒定 將Aβ1～42無菌條件下溶解于1 mg/ml的HIFP，水浴超聲10 min，真空干燥，-20℃凍存。使用時將Aβ42用二甲基亞砜(DMSO)溶解至1 mg/ml，再將Aβ42稀釋到終濃度為10 μmol/L的PBS中，終濃度為20 μmol/L，此條件下為Aβ42單體。在37℃孵育12 h，形成Aβ42寡聚體。然后通過透射電子顯微鏡觀察確認(rèn)其聚集狀態(tài)。Aβ42單體和寡聚體的制備和聚集體結(jié)構(gòu)的透射電鏡形態(tài)參考文獻(xiàn)〔7〕。由于Aβ42形成聚集體的不可逆性，Aβ42寡聚體的使用均為現(xiàn)用現(xiàn)制備，若短期使用置于-80℃儲存。

1.4 抗Aβ單鏈抗體的淘選 包被4 ml的20 μg/ml的Aβ42寡聚體與5 ml的免疫試管中(包被液為PBS)4℃過夜。棄掉包被液，PBS洗滌3次。2%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，PBS洗3次。加入1012ETH-2噬菌體展示單鏈抗體文庫，37℃孵育2 h。PBS(0.1% Tween20)洗滌10次。用1 ml 0.2 mol/L的甘氨酸-鹽酸緩沖液(pH2.2)洗脫掉特異性結(jié)合的噬菌體，然后加入0.5 ml 1 mol/L的Tris·HCl(pH9.1)中和洗脫液。隨后用洗脫下來的噬菌體感染大腸桿菌TG1(E.coli TG1)(OD600=0.4)，37℃放置30 min，取出部分被感染的TG1進(jìn)行10-4、10-3、10-2、10-1逐級稀釋，涂布于TYE平板(100 μg/ml青霉素和1%葡萄糖)37℃過夜培養(yǎng)，測定洗脫下來的噬菌體滴度(cfu)。將余下感染的E.coli TG1涂布于TYE平板(同上)，37℃過夜培養(yǎng)。第二天刮下平板上的菌落加到100 ml 2×TY(100 μg/ml青霉素和1%葡萄糖)中，用于擴增噬菌體。擴增后的噬菌體用輔助噬菌體M13K07挽救后用于第二輪淘選。如此進(jìn)行3次淘選，然后進(jìn)行ELISA鑒定。

1.5 單鏈抗體噬菌體的ELISA鑒定 淘選完成后，從噬菌體感染的E.coli TG1平板上隨機挑選96個單菌落加到96孔板，每孔加入150 μl 2×TY(同上)培養(yǎng)基，37℃孵育12 h。每孔轉(zhuǎn)移2 μl至新96孔板(含150 μl 2×TY培養(yǎng)基)繼續(xù)培養(yǎng)，剩余放置4℃保存。于96孔板加入異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)，37℃培養(yǎng)2 h，加25 μl 2×TY(109cfu輔助噬菌體M13K07)，培養(yǎng)30 min，1 800 r/min離心10 min，棄去上清。每孔加入180 μl 2×TY懸細(xì)菌沉淀，加入IPTG，37℃過夜培養(yǎng)。1 800 r/min離心10 min，取100 μl上清用于單鏈抗體ELISA。

Aβ42寡聚體(10 μg/ml)以100 μl/孔包被96孔板，4℃，16～18 h。棄抗原液，每孔加100 μl 1%的BSA，37℃封閉1 h。PBS(0.1%吐溫-20)洗板3次，每孔加入100 μl上述收集的上清液，37℃孵育2 h。陽性對照孔中加入商品化的Aβ抗體B4，陰性對照孔中加BSA。PBS洗板6次。加入100 μl(1∶2 000)HRP-anti-M13抗體，37℃孵育1 h。PBS洗板六次。加入TMB 50 μl/孔，室溫避光15 min，每孔加30 μl 2 mol/L H2SO4終止反應(yīng)，酶標(biāo)儀(ELX800，Bio-Tek)測OD值(波長為450 nm)。

1.6 單鏈抗體的表達(dá)純化 挑取ELISA親和性最高的噬菌體克隆，加到3 ml 2×TY培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD600約0.8，加入輔助噬菌體，37℃孵育30 min。3 300 r/min離心10 min，菌體重懸于1.5 ml 2×TY培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)，10 800 r/min 4℃離心30 min，收集上清。加入1/5體積PEG/NaCl(20% PEG6000，2.5 mol/L NaCl)，混合后放置1 h以上，10 800 g，4℃離心10 min，去上清。沉淀重懸于300 μl PBS中，離心收集上清。將上述制備的陽性克隆噬菌體上清15 μl(約106pfu)感染200 μl處于對數(shù)生長期的HB2151。37℃水浴靜置30 min。梯度稀釋鋪板，37℃過夜培養(yǎng)挑去生長良好的單克隆，將其接種于3 ml 2×TY培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)。以1∶100的比例接種，37℃培養(yǎng)OD600約0.8后加入IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，37℃過夜培養(yǎng)。1 800 r/min離心30 min收集上清。將收集到的上清通過組氨酸鎳柱進(jìn)行純化。純化后的單鏈抗體保存在-80℃。

1.7 免疫組化檢測scFv23對鼠腦中Aβ42沉積的識別 12個月的Tg2576鼠的腦組織取出后于4%的多聚甲醛中浸泡24 h固定，然后經(jīng)過脫水、透明、浸蠟、包埋，并制成5 μm厚度的切片。將切片固定載玻片上后進(jìn)行干燥處理。將石蠟切片放入二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)中進(jìn)行脫蠟，然后逐級放置于100%的純酒精(Ⅰ)(Ⅱ)、95%、80%、70%的酒精和水中各5 min進(jìn)行水化。水化后的片子放于3%的H2O2中室溫孵育10 min，PBS洗滌3次。將片子放入檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L，pH6.0)中，加熱至沸騰改中火(92℃以上)，室溫下復(fù)溫，PBS洗滌3次。吸干多余液體，滴加山羊血清封閉液，37℃孵育30 min。陽性實驗組用6E10抗體處理切片，陰性對照組用PBS處理切片。實驗組分別用scFv+Aβ42混合物和scFV孵育載玻片，4℃ 16 h。滴加anti-His抗體(1∶2 000)4℃過夜，取出后在37℃烤箱中復(fù)溫30 min，用PBS洗3次。滴加生物素抗兔二抗，37℃孵育1 min，PBS洗滌3次。滴加HRP標(biāo)記鏈親和素，37℃孵育15 min，PBS洗滌3次。用DAB試劑盒進(jìn)行顯色，顯色終止后清洗片子。滴加蘇木素室溫染液3 min，清水洗掉蘇木素染液，鹽酸酒精分化1 s，氨水返藍(lán)5 min。將片子分別放入70%、80%的酒精各1 min，90%的酒精2 min，95%的酒精3 min，100%的酒精(Ⅰ)(Ⅱ)各3 min。二甲苯(Ⅰ)(Ⅱ)中各放置15 min，取出晾干后用中性樹膠封片。每個標(biāo)本以只滴加PBS的為陰性對照，在顯微鏡(CK30-F200，日本Olympus公司)下觀察各切片著色。

1.8 Western印跡檢測單鏈抗體對Aβ42單體，寡聚體，纖維的識別 4℃分離12個月Tg2576鼠的鼠腦，稱重后按2.5 ml/g鼠腦中加入相當(dāng)體積的冰生理鹽水，勻漿器研磨組織后冰浴下超聲波粉碎制成勻漿。4℃，10 000 r/min離心10 min，取上清。二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白質(zhì)濃度。各組取30 μg總蛋白上樣，經(jīng)非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(Native-PAGE)分離后，轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜上，80 V轉(zhuǎn)膜 90 min。5%脫脂牛奶-PBS(0.1%Tween-20)封閉1 h，PBS洗膜。將膜置于雜交袋中，孵育制備的單鏈抗體，對照組加入6E10抗體(1∶1 000)，室溫雜交1 h后，PBS洗膜。將膜置于雜交袋中，實驗組加入anti-His抗體(1∶1 000)，室溫雜交1 h后，PBS洗膜。加入HRP標(biāo)記的IgG(羊抗鼠，1∶10 000)，室溫雜交1 h。洗膜后，采用辣根過氧化物酶標(biāo)記的增強型化學(xué)發(fā)光法顯色，顯影于X光片上。

1.9 熒光染色(ThT-F)法檢測單鏈抗體對Aβ42聚集的抑制作用 將Aβ42貯液(5 mmol/L)用PBS(pH7.4)稀釋到15 μmol/L，分別于等摩爾的單鏈抗體和等體積的PBS混合，37℃孵育3 d。孵育后用ThT-F測定Aβ42的聚集程度。將樣品加入到990 μl PBS(50 mmol/L，pH6.0)中。用RF-5301PC熒光分光光度計(杭州英斯特科技有限公司)檢測其熒光強度，Ex=450 nm，Em=482 nm。

1.10 MTT法檢測單鏈抗體抑制Aβ42對細(xì)胞的毒性作用 取對數(shù)生長期細(xì)胞，以每孔 2×103個細(xì)胞(100 μl)接種在96孔板，培養(yǎng)24 h。根據(jù)實驗要求分別加入Aβ42寡聚體(1.4 μmol/L)，Aβ42寡聚體(1.4 μmol/L)+單鏈抗體，孵育24、48、72 h。Aβ42寡聚體終濃度為700 nmol/L。細(xì)胞在處理完畢之后，每孔加入5 g/L MTT 20 μl，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h，吸出培養(yǎng)液，加入DMSO 150 μl，待甲臜完全溶解后，用酶標(biāo)儀(Bio-Tek，ELX800)在波長 490 nm處讀取吸光度(A490 nm)值。

1.11 向Tg2576鼠的海馬區(qū)和皮質(zhì)區(qū)定向注射scFv 將小鼠用戊巴比妥進(jìn)行麻醉后，固定于定位儀上。在頭蓋骨前鹵偏后0.2 cm對海馬皮質(zhì)區(qū)進(jìn)行注射。每只小鼠注射4次(2 μl/次，1 μg/μl scFv23)，其中2次注射深度0.17 cm(海馬體)，2次注射深度0.07 cm(大腦皮層)。對照組注射等體積的PBS。將處理好的小鼠鼠腦取出，然后進(jìn)行固定，脫水，透明，浸蠟，包埋，脫蠟，水化，內(nèi)源性過氧化物滅活，抗原修復(fù)，封閉處理載玻片。然后分別用6E10抗體，兔抗鼠IgG抗體，HRP標(biāo)記鏈親和素，DAB試劑盒，蘇木素分別處理載玻片后，在顯微鏡下觀察切片(具體方法參見免疫組化部分)。

1.12 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS16.0軟件進(jìn)行t、χ2檢驗及單因素方差分析。

2 結(jié) 果

2.1 文庫篩選 為了篩選到與Aβ42有高親和力的抗體分子，共進(jìn)行了3輪親和篩選，新一輪的洗脫液滴度和回收率都比上一輪高，而且第3輪回收率與第2輪回收率相近，說明經(jīng)過第3輪篩選已經(jīng)富集到了與靶蛋白有親和活性的陽性噬菌體克隆。同時我們從經(jīng)過3輪篩選富集的陽性克隆噬菌體克隆中隨機挑選96個噬菌體克隆，用ELISA做進(jìn)一步的特異性結(jié)合活性測定，ELISA結(jié)果顯示96個噬菌體克隆中有1株(scFv23)能特異結(jié)合Aβ42蛋白，BSA、scFv23的OD值分別為0.10±0.02，0.67±0.03，t=27.382，P=0.000。

表1 文庫篩選結(jié)果

2.2 免疫組化鑒定scFv23對鼠腦中Aβ42沉積的識別 與陽性對照組相比，scFv23免疫染色的結(jié)果與陽性對照結(jié)果定位相同，而且免疫染色的程度也相似。如果將scFv23與Aβ42混合，孵育一段時間后再將混合物免疫染色小鼠大腦皮層組織切片，發(fā)現(xiàn)scFv23不能識別小鼠大腦中的Aβ42沉積。這說明scFv23特異性識別Aβ42沉積。見圖1。

圖1 免疫組化鑒定scFv23對Aβ42沉積的識別(×100)

2.3 Western印跡檢測單鏈抗體對Aβ42單體，寡聚體，纖維識別的分析 首先我們以購買的Aβ42制備了Aβ42單體和寡聚體，經(jīng)過非變性凝膠電泳分離Aβ42單體和寡聚體后，將目的條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，然后分別以scFv23和6E10為抗體作用PVDF膜。6E10可以特異性結(jié)合Aβ42單體和寡聚體，而scFv23與Aβ42寡聚體具有很強的結(jié)合能力，但是幾乎不能與Aβ42單體結(jié)合。隨后對12個月大的Tg2576小鼠鼠腦蛋白提取物進(jìn)行Native-PAGE以分離鼠腦中Aβ42單體和纖維聚集體。待目的條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上之后，以scFv23和6E10為抗體作用PVDF膜。6E10可以特異性結(jié)合Aβ42單體和纖維，而scFv23與Aβ42纖維特異性結(jié)合。這表明scFv23能特異性的識別Aβ42寡聚體和Aβ42纖維。見圖2。

2.4 單鏈抗體對Aβ42纖維抑制作用 將Aβ42單體分別與等摩爾的scFv23和等體積的PBS混合，37℃孵育，分別在1、2、3 d用ThT-F法測定Aβ42的聚集程度。在存在單鏈抗體的情況下，Aβ42單體孵育1、2、3 d后的聚合程度(255±15、302±14、401±19)顯著性低于單獨Aβ42的聚合度(453±28、568±20、645±18)(均P<0.01)。

圖2 Western印跡檢測單鏈抗體對Aβ42單體，寡聚體，纖維的識別

2.5 單鏈抗體抑制Aβ42對細(xì)胞的毒性作用 以HEK293為細(xì)胞模型，MTT檢測單鏈抗體抑制Aβ42對細(xì)胞的毒性作用。與對照組相比，實驗組中細(xì)胞的存活率顯著性提高。單獨用Aβ42纖維作用HEK293細(xì)胞24、48、72 h后，細(xì)胞的存活率分別為(68.3±0.53)%(P<0.05)，(45.5±0.08)%(P<0.05)，(38.5±0.78)%(P<0.05)。而經(jīng)單鏈抗體作用的實驗組細(xì)胞的存活率分別為(80.5±7.3)%(P<0.05)，(79.2±1.4)%(P<0.05)，(75.89±2.6)%(P<0.05)，明顯高于對照組的細(xì)胞存活率。

2.6 免疫組化鑒定scFv23對小鼠腦中Aβ42沉積的清除作用 為了進(jìn)一步鑒定scFv23對小鼠腦中Aβ42沉積的清除作用，將制備好的scFv23對小鼠鼠腦進(jìn)行注射，隨后我們用6E10抗體對小鼠腦切片進(jìn)行了免疫染色。與對照組相比(注射PBS)，實驗組小鼠腦切片中Aβ42沉積明顯少于對照組，這說明scFv23對于清除小鼠腦中Aβ42沉積發(fā)揮重要作用。見圖3。

圖3 免疫組化鑒定scFv23對小鼠腦中Aβ42沉積的清除作用(×100)

3 討 論

AD轉(zhuǎn)基因小鼠的培育，成為早期研究AD治療方式的重要工具。人們在用Aβ免疫小鼠的過程中發(fā)現(xiàn)可以有效清除鼠腦中的Aβ沉積。隨后，人們將這種方法用于臨床試驗。但是，在臨床治療的過程中，有一小部分病人的腦中出現(xiàn)了免疫反應(yīng)，并且研究人員推測這種免疫反應(yīng)可能是由于T-細(xì)胞或者Fc-所介導(dǎo)的免疫反應(yīng)〔7〕。另一種可能的方案是主動免疫，就是在患有AD的病人中主動注射人源抗體。為了進(jìn)一步研究這個治療方案的可能性，有些實驗室已經(jīng)從人源單鏈抗體庫中分離出可以與Aβ42特異性反應(yīng)的scFv，并且證實了這種單鏈抗體可以有效地抑制體外Aβ42的聚集和引起的神經(jīng)毒性〔8〕。為了進(jìn)一步研究scFv在治療AD病中的作用，本研究以AD模型鼠為實驗對象，研究scFV在體內(nèi)的作用，并成功地分離出能與Aβ42沉積和Aβ42寡聚體特異性反應(yīng)的scFv，并且能有效地抑制體外Aβ42纖維的聚集。同時發(fā)現(xiàn)，scFv對鼠腦中的Aβ42沉積具有很好的清除作用。

在應(yīng)用合成的Aβ1～42肽段(AN1792)免疫治療的臨床研究過程中Hock等〔9〕報道發(fā)現(xiàn)，Aβ42免疫過程中產(chǎn)生的抗體并不能與Aβ42單體和寡聚體發(fā)生交叉反應(yīng)，但是可以與腦中的Aβ42沉積發(fā)生特異性反應(yīng)。后來，Lee等〔10〕發(fā)現(xiàn)用AN1792疫苗治療AD病人的抗血清可有有效識別Aβ42單體和Aβ42沉積，但是仍然不能與Aβ42寡聚體特異性結(jié)合。而本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，scFv23并不能有效地識別Aβ42單體，但是可以有效識別Aβ42寡聚體和Aβ42纖維。相比于能有效結(jié)合Aβ42單體的單鏈抗體來說，能有效結(jié)合Aβ42寡聚體和Aβ42纖維的單鏈抗體在治療AD病的研究的過程中意義更大，這是因為Aβ42單體具有很重要的生理意義。研究表明Aβ42寡聚體比Aβ42纖維有著更強的神經(jīng)毒性〔11〕。本研究發(fā)現(xiàn)，3個月大的APP23轉(zhuǎn)基因小鼠(表達(dá)APP751基因同時伴隨著K670N，M671L雙突變)在腦中在產(chǎn)生淀粉樣沉積之前進(jìn)行水迷宮的實驗過程中已經(jīng)表現(xiàn)出記憶的缺失〔12〕。同樣，APP/IND轉(zhuǎn)基因小鼠(V717F突變)在腦內(nèi)不存在淀粉樣沉積的時候已經(jīng)表現(xiàn)出突出形態(tài)的異?！?3〕。所以，人們推測在AD的免疫治療的過程中，針對Aβ42寡聚體的治療方案比針對Aβ42單體和纖維具有更好的療效〔14〕。

對于AD鼠模型中產(chǎn)生Aβ沉積的機制并不清楚。之前有研究表明體外培養(yǎng)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以有效吞噬培養(yǎng)基中的Aβ聚集體〔15〕。并且有早期的報道推測這種神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞吞噬Aβ42聚集體可能是由Fc接受子所介導(dǎo)的〔16〕。隨后，Solomon等〔17〕報道在體外，Aβ抗體可以與Aβ沉積發(fā)生反應(yīng)，并導(dǎo)致Aβ聚集體的解聚。Bacskai等報道單獨應(yīng)用來自鼠抗Aβ抗體中的F(ab′)2片段對于清除轉(zhuǎn)基因鼠腦中Aβ沉積的效果與用完整抗體清除轉(zhuǎn)基因鼠腦中的Aβ沉積效果相似〔18〕。本實驗結(jié)果同樣支持了非Fc介導(dǎo)的體內(nèi)Aβ沉積清除機制。

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〔2017-03-22修回〕

(編輯 袁左鳴)

劉 秦(1974-)，女，碩士，副主任醫(yī)師，主要從事腦血管病、癡呆的研究。

R745.1

A

1005-9202(2017)13-3173-05；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.022

1 廣東番禺中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科 2 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗科

3 廣州醫(yī)科大學(xué)臨床技能中心