β-腎上腺素受體介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)老年大鼠心臟缺血預(yù)處理效應(yīng)的影響

吳 芹 宋祥和 郝 玲 王運(yùn)剛 丁鳳云

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

β-腎上腺素受體介導(dǎo)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)老年大鼠心臟缺血預(yù)處理效應(yīng)的影響

吳 芹 宋祥和 郝 玲 王運(yùn)剛 丁鳳云

(鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

目的 探討運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能否恢復(fù)老年大鼠心臟缺血預(yù)處理(IP)效應(yīng)及β-腎上腺素受體(β-AR)的可能作用機(jī)制。方法 健康雄性SD成年或老年大鼠，實(shí)驗(yàn)分組：成年對(duì)照組、老年對(duì)照組和老年運(yùn)動(dòng)組，每組20只。老年運(yùn)動(dòng)組大鼠每天負(fù)重5%游泳，5次/w，持續(xù)90 d。離體心臟灌流行IP和(或)缺血再灌注(I/R)，使用不同β-腎上腺素受體激動(dòng)劑或阻滯劑，分離單個(gè)心肌細(xì)胞，測(cè)心肌細(xì)胞收縮幅度、存活率等。結(jié)果 長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使老年鼠左心室重量增加顯著，左心室/體重比顯著增加(P<0.05)。IP顯著改善I/R損傷的成年大鼠和長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠的心功能，左心室收縮壓(LVSP)、±dp/dtmax升高，左心室舒張末壓(LVEDP)顯著降低；提高了成年鼠和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠的心肌細(xì)胞收縮幅度，但不能提高老年對(duì)照鼠心肌細(xì)胞收縮幅度；提高了成年鼠和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠的心肌細(xì)胞存活率，但不能提高老年對(duì)照鼠心肌細(xì)胞存活率。IP時(shí)阻斷β1-AR，IP不能恢復(fù)三組大鼠的心肌細(xì)胞收縮幅度；阻斷β2-AR，IP能夠恢復(fù)成年鼠，卻不是老年對(duì)照鼠和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠的心肌細(xì)胞收縮幅度。結(jié)論 IP可部分恢復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年大鼠的I/R損傷的心功能，其可能機(jī)制不僅涉及β1-AR的作用，β2-AR發(fā)揮著更為特別的作用。

運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練；缺血預(yù)處理；β-腎上腺素受體

心血管疾病是目前老年人死亡、喪失勞動(dòng)能力的主要因素。因此，尋求新的藥物或干預(yù)措施限制梗死心肌面積、阻止細(xì)胞凋亡顯得尤為重要。研究表明，老年心臟失去了缺血預(yù)處理(IP)的保護(hù)作用〔1〕。運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練被認(rèn)為是彌補(bǔ)老年心臟生理學(xué)和解剖學(xué)改變的有效措施。本研究觀察運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練能否恢復(fù)IP對(duì)老年心臟的保護(hù)作用及可能機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組 正常健康SD大鼠，成年鼠6月齡，老年鼠24月齡，雌雄不拘，清潔級(jí)，購(gòu)自徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)經(jīng)鹽城衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。老年大鼠分為老年對(duì)照組和老年運(yùn)動(dòng)組，老年運(yùn)動(dòng)組每天負(fù)重5%游泳，5次/w，持續(xù)90 d。各組常規(guī)飼養(yǎng)，90 d后實(shí)驗(yàn)。

1.2 離體心臟灌流和心肌細(xì)胞分離 每組隨機(jī)取10只大鼠稱重，腹腔注射5 000 IU/kg肝素，約10 min后，頸椎脫臼處死，迅速開胸取心，參照文獻(xiàn)〔2〕把主動(dòng)脈插入Langendorff灌注架上，用線結(jié)扎固定。經(jīng)房室瓣插入帶球囊的心導(dǎo)管抵左心室，通過MacLab生物信號(hào)采集軟件檢測(cè)左心室收縮壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室內(nèi)壓上升和下降的最大變化速率(±dp/dtmax)。穩(wěn)定20 min后，隨機(jī)分組：①對(duì)照組：穩(wěn)定后，持續(xù)灌注80 min，不作處理；②缺血再灌注(I/R)組：穩(wěn)定后，持續(xù)灌注20 min，不作處理；③IP組：穩(wěn)定后，停灌5 min，復(fù)灌5 min，循環(huán)4次；④異丙腎上腺素(ISO)處理組：穩(wěn)定后，含10 nmol/L ISO的K-H液灌 5 min，洗脫5 min；⑤IP+CGP20712A組(IP+CGP組)：心臟IP前5 min起，整個(gè)過程均使用300 nmol/L的CGP20712A；⑥IP+ICI118551組(IP+ICI組)：心臟IP前5 min起，整個(gè)過程均使用55 nmol/L的ICI118551。各組按上述方法處理后，均行關(guān)泵停灌30 min，再用100%O2飽和的K-H液復(fù)灌30 min。然后，酶法分離得單個(gè)心室肌細(xì)胞，按約2×104cells/well接種于無血清高糖DMEM(Hyclone公司)，置CO2培養(yǎng)箱(德國(guó)Heraeus公司)中孵育2 h測(cè)定心肌細(xì)胞收縮幅度。

1.3 心臟重量測(cè)定 另每組10只大鼠，頸椎脫臼處死后，立即取心臟置濾紙上，吸干血跡。稱取心臟重量(HW)，剪下左心室并稱重(LVW)。計(jì)算左室質(zhì)量指數(shù)=LVW/體重(BW)。

1.4 心肌細(xì)胞收縮幅度測(cè)定 收集心肌細(xì)胞置于收縮功能分析裝置的細(xì)胞浴槽內(nèi)，用蠕動(dòng)泵將含有2.0 mmol/L鈣和100 nmol/L濃度的ISO(Sigma公司) 的K-H液，循環(huán)至細(xì)胞槽內(nèi)，然后用刺激器對(duì)細(xì)胞進(jìn)行刺激(0.5 Hz，37℃)。用心肌細(xì)胞收縮軟件分析，得到心肌細(xì)胞收縮幅度的變化〔3〕。

1.5 心肌細(xì)胞存活率的測(cè)定 在鏡下計(jì)數(shù)一定數(shù)量的心肌細(xì)胞，其中長(zhǎng)桿狀細(xì)胞占總細(xì)胞的比率作為心肌細(xì)胞的存活率，用百分比(%)表示。每一組選5個(gè)視野，共計(jì)數(shù)200 個(gè)細(xì)胞。此步驟由一對(duì)實(shí)驗(yàn)不知情者進(jìn)行。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 使用GraphPad Prism4.0 分析軟件，兩組間比較用t檢驗(yàn)，方差不齊用校正t檢驗(yàn)；多組間的比較采用方差分析(ANOVA)。

2 結(jié) 果

2.1 年齡和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)大鼠BW和LVW的影響 老年大鼠BW顯著增加，與成年鼠相比，HW、LVW〔老年對(duì)照組(2.05±0.48)mg/g、成年對(duì)照組(1.94±0.97)mg/g、老年運(yùn)動(dòng)組(2.27±0.87)mg/g〕均顯著增加(P<0.05)。老年運(yùn)動(dòng)鼠與成年鼠相比，年齡對(duì)BW、HW、LVW影響仍存在(P<0.05)。長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練使老年鼠BW增加沒有對(duì)照老年鼠明顯(P>0.05)，但HW、LVW增加顯著(P<0.05)。見表1。

表1 各組BW與LVW的比較

與成年對(duì)照組比較：1)P<0.05；與老年對(duì)照組比較：2)P<0.05

2.2 不同灌注條件下各組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)的比較 正常灌注條件下，三組血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)無顯著差異(P>0.05)。I/R使各組大鼠心功能均受損，表現(xiàn)為L(zhǎng)VSP、±dp/dtmax降低，LVEDP升高(均P<0.05)。老年對(duì)照組損傷尤為嚴(yán)重，與正常灌注相比，I/R后LVSP、±dp/dtmax分別下降了53.49%、50.98%和58.44%，而LVEDP卻增加了4.54倍。長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練對(duì)保存老年鼠抗I/R損傷能力有一定作用，僅LVSP有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。IP顯著改善I/R損傷的成年大鼠和長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠的心功能，LVSP、±dp/dtmax升高，LVEDP顯著降低(P<0.05)。老年對(duì)照組雖然經(jīng)歷了IP，卻不能改善I/R損傷后的心功能。老年對(duì)照組經(jīng)歷IP后，LVSP、±dp/dtmax分別恢復(fù)了60.46%、64.28%和58.68%，LVEDP是正常灌注條件下的4.34倍。見表2。

表2 各組不同灌注條件下的血流動(dòng)力學(xué)參數(shù)變化±s)

與正常灌注比較：1)P<0.05；與I/R比較：2)P<0.05；與成年對(duì)照組比較：3)P<0.05；與老年對(duì)照組比較：4)P<0.05，下表同

2.3 不同灌注條件下各組大鼠單個(gè)心肌收縮幅度比較 I/R條件下，與成年鼠相比，老年鼠心肌細(xì)胞收縮幅度顯著降低(P<0.05)。但長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠心肌細(xì)胞收縮幅度與成年鼠相比沒有顯著差異(P>0.05)。IP顯著提高了成年鼠和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠的心肌細(xì)胞收縮幅度，但不能提高老年對(duì)照鼠心肌細(xì)胞收縮幅度。正常灌注條件下，三組大鼠心肌細(xì)胞收縮幅度無顯著差異(P>0.05)。見表3。

2.4 不同灌注條件下各組大鼠心肌細(xì)胞存活率的變化 與成年鼠相比，I/R條件下，老年鼠心肌細(xì)胞存活率顯著降低〔(41.78±9.64)% vs (52.47±10.52)%,P<0.05〕。但長(zhǎng)期運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠心肌細(xì)胞存活率與成年鼠相比沒有顯著差異〔(48.68±9.67)%，P>0.05〕。IP顯著提高了成年鼠和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠的心肌細(xì)胞存活率，但不能提高老年對(duì)照鼠心肌細(xì)胞存活率〔(77.02±13.05)%、(46.82±8.41)%、(70.76±8.36)%〕。

2.5 激活或阻斷β-腎上腺素受體(β-AR)后各組大鼠心肌細(xì)胞收縮幅度的變化 ISO模擬IP，激活β-AR后，無論是成年鼠、老年對(duì)照鼠還是運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠，心肌細(xì)胞收縮幅度均顯著高于I/R組(P<0.05)，與正常灌注相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。IP時(shí)阻斷了β1-AR，IP不僅不能恢復(fù)老年對(duì)照鼠的心肌細(xì)胞收縮幅度，也不能恢復(fù)成年鼠和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠的心肌細(xì)胞收縮幅度。IP時(shí)阻斷了β2-AR，IP恢復(fù)了成年鼠的心肌細(xì)胞收縮幅度，卻不能恢復(fù)老年對(duì)照鼠和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠的心肌細(xì)胞收縮幅度。見表3。

表3 激動(dòng)或阻斷β-AR后各組大鼠在不同灌注條件下心肌細(xì)胞收縮幅度比較±s，%)

3 討 論

IR是心臟最有力的抗I/R損傷的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，但隨著年齡的增加，這種作用逐漸失去。其中原因涉及多種介質(zhì)，如：腺苷受體、去甲腎上腺素、緩激肽等。Abete等〔3〕發(fā)現(xiàn)，IP降低了成年大鼠和訓(xùn)練老年大鼠心臟缺血后功能失調(diào)，與增加了去腎上腺素釋放有關(guān)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練可以通過增加去甲腎上腺素釋放恢復(fù)老年大鼠心臟預(yù)處理效應(yīng)。Corbi等〔4，5〕發(fā)現(xiàn)，β-腎上腺素刺激或運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練均能降低心率、心肌收縮力、心輸出量和射血分?jǐn)?shù)。在高強(qiáng)度運(yùn)動(dòng)情況下，年老導(dǎo)致心率下降與盡管循環(huán)水平兒茶酚胺水平升高，但β-腎上腺素反應(yīng)性降低有關(guān)。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)IP可部分恢復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年大鼠的I/R損傷的心功能，其可能機(jī)制不僅涉及β1-AR的作用，β2-AR發(fā)揮著更為特別的作用。

早在1993年，B?hm等〔6〕就研究發(fā)現(xiàn)，與成年大鼠相比，老年大鼠心肌膜上ISO激活的AC活性下降，伴隨著15%的百日咳毒素結(jié)合位點(diǎn)增加，72%的免疫測(cè)定的Giα蛋白增加。中等強(qiáng)度的跑步訓(xùn)練降低了成年和老年大鼠心肌膜上30%～35%的Giα蛋白，但是僅提高了老年大鼠心肌膜上的ISO刺激的AC活性，還提高成年大鼠基礎(chǔ)的、Gpp(NH)p(一種真核細(xì)胞有力的AC激活劑)及ISO刺激的AC活性。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)〔2〕，短暫使用非選擇性β-ARs激動(dòng)劑ISO可模擬IP，0.02 μmol/L ISO顯著降低再灌時(shí)冠脈流出液中肌酸激酶(CK)的釋放，保存了冠脈流量(MCF)和心率血壓乘積(RPP)。普萘洛爾(1 μmol/L)或阿替洛爾(10 μmol/L)，一種β1-AR阻斷劑，而不是高選擇性β2-AR阻斷劑ICI 118551(2 μmol/L)，完全抑制了ISO預(yù)處理的作用。這些結(jié)果表明，β-ARs介導(dǎo)大鼠心臟IP效應(yīng)，β1-AR起主要作用。本研究發(fā)現(xiàn)，IP時(shí)阻斷了β1-AR，IP不僅不能恢復(fù)老年對(duì)照鼠的心肌細(xì)胞收縮幅度，也不能恢復(fù)成年鼠和運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年鼠的心肌細(xì)胞收縮幅度，說明β1-AR在IP部分恢復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年大鼠的I/R損傷的心功能中發(fā)揮重要作用。Leosco等〔7〕發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練和β腎上腺素阻斷劑能夠改善老年心臟的β-AR信號(hào)，促進(jìn)β-AR反映和相應(yīng)的左心室正性肌力儲(chǔ)備。Tong 等〔8〕以小鼠為模型，發(fā)現(xiàn)ISO在小鼠心臟也能誘導(dǎo)心臟保護(hù)作用，且被PTX(Gi抑制劑)阻斷；但在β2-AR基因敲除小鼠卻沒有作用，認(rèn)為IP通過β2-AR-Gi激活介導(dǎo)的。本課題組先前研究發(fā)現(xiàn)，自主運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練依賴β2-AR改變保護(hù)心功能〔9〕。本研究發(fā)現(xiàn)，β2-AR在IP部分恢復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年大鼠的I/R損傷的心功能中發(fā)揮著更為特別的作用。

Ferrara等〔10〕綜述，分析相關(guān)機(jī)制發(fā)現(xiàn)，β2-AR激活時(shí)同時(shí)與Gs和Gi耦聯(lián)，Gi通路對(duì)Gs通路信號(hào)向細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)散起屏蔽作用，從而使β2-AR激活出現(xiàn)不同于β1-AR激活的功能特性。而且，B?hm等〔6〕還發(fā)現(xiàn)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練或年老對(duì)β-AR數(shù)量沒有作用，提高Giα表達(dá)可能是導(dǎo)致老年心肌cAMP 形成降低的一個(gè)機(jī)制。在沒有β-AR改變的前提下，Giα可能是生理病理狀態(tài)下心臟AC的調(diào)節(jié)器。當(dāng)然，在2011年，Calvert等〔11,12〕研究發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練保護(hù)I/R損傷的心肌是通過刺激β3-AR，提高NO代謝物的儲(chǔ)備實(shí)現(xiàn)的。綜上所述，IP恢復(fù)運(yùn)動(dòng)訓(xùn)練老年大鼠的I/R損傷的相關(guān)機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

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〔2015-12-15修回〕

(編輯 苑云杰/曹夢(mèng)園)

鹽城市醫(yī)學(xué)科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目(No.YK2011121)

丁鳳云(1963-)，女，教授，主要從事心血管功能調(diào)控研究。

吳 芹(1974-)，女，碩士，副教授，主要從事心血管功能調(diào)控研究。

R331

A

1005-9202(2017)13-3164-04；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.13.019