力竭運動對大鼠前額葉皮層小清蛋白陽性神經(jīng)元及NMDAR2B表達的影響

崔書強劉曉莉喬德才鄭健

1北京師范大學(xué)體育與運動學(xué)院（北京100875）2北京市體育科學(xué)研究所（北京100075）3廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州510006）

力竭運動對大鼠前額葉皮層小清蛋白陽性神經(jīng)元及NMDAR2B表達的影響

崔書強1，2劉曉莉1喬德才1鄭健3

1北京師范大學(xué)體育與運動學(xué)院（北京100875）2北京市體育科學(xué)研究所（北京100075）3廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州510006）

目的：通過觀察力竭運動后大鼠前額葉皮層小清蛋白（parvalbumin，PV）陽性神經(jīng)元的表達變化，探討運動疲勞對前額葉皮層神經(jīng)微環(huán)路可塑性的影響，同時觀察前額葉皮層N-甲基-D-天門冬氨酸受體NR2B亞型（N-methyl-D-aspartatereceptor NR2B subunit，NMDAR2B）表達的變化，進一步探討運動疲勞中樞調(diào)節(jié)的可能機制。方法：雄性Wistar大鼠36只隨機分為一次力竭運動組、重復(fù)力竭運動組和對照組。力竭運動方案采用本實驗室改進的Bedford漸增負荷動物運動方案：I級：8.2 m/min，15 min；II級：15 m/min，15 min；III級：20 m/min，至力竭，重復(fù)力竭運動組連續(xù)進行7天力竭性跑臺運動，在運動力竭后采用免疫熒光染色技術(shù)觀察大鼠前額葉皮層PV陽性神經(jīng)元的表達情況，并記錄陽性細胞個數(shù)。采用免疫熒光染色技術(shù)和免疫印跡法檢測前額葉皮層NMDAR2B的表達情況。結(jié)果：一次力竭運動組及重復(fù)力竭運動組大鼠前額葉皮層PV陽性神經(jīng)元個數(shù)較對照組顯著增加（P＜0.01）。免疫熒光染色結(jié)果顯示，前額葉皮層NMDAR2B陽性神經(jīng)元在對照組和重復(fù)力竭運動組未見明顯表達，一次力竭運動組可見陽性神經(jīng)元表達；Western blot結(jié)果顯示，與對照組相比，一次力竭運動組NMDAR2B表達相對較高，而重復(fù)力竭運動組表達相對較低，但均無顯著性差異（P＞0.05）；NMDAR2B表達與運動距離呈顯著負相關(guān)（P＜0.01，r=－0.936）。結(jié)論：力竭運動通過PV陽性神經(jīng)元的局部環(huán)路的調(diào)節(jié)影響大鼠前額葉皮層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的可塑性，其參與了運動疲勞的中樞調(diào)節(jié)，為運動疲勞中樞機制研究提供了形態(tài)學(xué)基礎(chǔ)。

運動疲勞；NMDAR2B；小清蛋白；前額葉皮層；中樞調(diào)節(jié)

運動疲勞可引起肌肉到中樞多個水平的改變，越來越多的研究認為，運動疲勞的產(chǎn)生是來自皮層高級中樞的控制[1]。最近有學(xué)者指出前額葉皮層對運動耐力以及運動的終止起很重要的作用[2]，人體研究也發(fā)現(xiàn)運動疲勞時前額葉皮層會受到明顯激活[3，4]。前額葉皮層是哺乳動物的最高級中樞，在腦內(nèi)以自上而下的方式控制行為的選擇與執(zhí)行[6]，對機體的決策、工作記憶以及運動行為的調(diào)控起重要作用[5，7]。在腦內(nèi)興奮與抑制共同調(diào)節(jié)機體的行為，越來越多的證據(jù)發(fā)現(xiàn)皮層γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）能中間神經(jīng)元可以抑制錐體神經(jīng)元并調(diào)節(jié)其興奮的輸出，在皮層的小清蛋白（parvalbumin，PV）陽性神經(jīng)元占GABA能中間神經(jīng)元的絕大多數(shù)，參與了皮層環(huán)路的反饋和前饋抑制，對于網(wǎng)絡(luò)振蕩的產(chǎn)生起到很重要的作用；而網(wǎng)絡(luò)振蕩對感覺感知、認知、行為有重要意義[8，9]。PV陽性神經(jīng)元的興奮性輸入受離子型谷氨酸能N-甲基-D-天門冬氨酸（N-methyl-D-aspartic acid，NMDA）受體的調(diào)節(jié)，研究已發(fā)現(xiàn)NMDAR2B型受體在GABA能中間神經(jīng)元上有表達，并可以影響GABA能中間神經(jīng)元的活動[10]。運動疲勞會引起皮層下基底神經(jīng)節(jié)多個核團的放電變化[11，12]，這必將受到上游皮層的影響，然而運動疲勞對前額葉皮層的影響研究相對較少。本研究采用PV陽性神經(jīng)元作為標記物，觀察力竭性運動對前額葉皮層神經(jīng)調(diào)控的影響并分析NMDAR2B可能參與的調(diào)節(jié)機制。

1 材料與方法

1.1 實驗對象與分組

健康雄性8周齡Wistar大鼠36只，體重250～280 g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供[許可證號：SCXK（京）2012-0001]，大鼠購進后分籠飼養(yǎng)，每籠4只，在北京師范大學(xué)運動生理學(xué)實驗室動物房飼養(yǎng)，溫度24±2℃，相對濕度50%±5%，自由飲食，自然光照。適應(yīng)性飼養(yǎng)3天后隨機分為一次力竭運動組、重復(fù)力竭運動組和對照組，每組12只，其中6只用來做前額葉皮層PV陽性神經(jīng)元及NMDAR2B的免疫熒光染色，另外6只用來做前額葉皮層NMDAR2B蛋白表達的免疫印跡檢測。所有操作程序經(jīng)北京師范大學(xué)動物倫理委員會批準。

1.2 運動方案

一次力竭運動組采用本實驗室改進的Bedford漸增負荷動物運動方案：動物跑臺采用杭州段氏（DSPT-202）大鼠跑臺，坡度為0，I級：8.2 m/min，15 min；II級：15 m/min，15 min；III級：20 m/min，至力竭[13]。重復(fù)力竭運動組采用同樣的運動方案，連續(xù)進行7天力竭性跑臺運動。記錄大鼠的運動持續(xù)時間、運動距離等指標。對照組不進行跑臺運動。

1.3 測試方法

1.3.1 免疫熒光染色

1.3.1.1 灌注取腦

對照組、一次力竭運動組和重復(fù)力竭運動組各6只大鼠用于前額葉皮層PV陽性神經(jīng)元及NMDAR2B的免疫熒光染色。對照組在安靜狀態(tài)下、一次力竭運動組在進行一次力竭運動后即刻、重復(fù)力竭運動組在進行7天力竭運動后即刻進行腹腔注射10%水合氯醛麻醉，經(jīng)心臟首先快速灌注冷的生理鹽水，然后先快后慢灌注4%多聚甲醛（PFA）。以大鼠四肢僵直為灌注成功，剝離全腦，入4%PFA的30%的蔗糖溶液固定，4℃保存。

1.3.1.2 冰凍切片與染色

待大鼠腦組織沉底后對其腦進行連續(xù)冠狀冰凍切片，選取前額葉皮層、紋狀體部位，切片厚度40微米，每6片選取一片進行組織免疫熒光染色。切片收集于0.1 M的PB中，置于4℃冰箱待用。免疫熒光染色：切片置于0.1 M的PB中洗一次，3%羊血清室溫封閉30 min；加一抗PV（來源小鼠的單克隆抗體，Abcam，貨號：ab64555）稀釋濃度為1︰1000，一抗NMDAR2B（來源于兔的多克隆抗體，Abcam，貨號：ab65783）稀釋濃度為1︰500，一抗4℃孵育24 h，0.1 M的PB洗3次，每次5 min；二抗采用Alexa Fluor?594標記的羊抗小鼠IgG（Invitrogen，貨號A-11005）和Alexa Fluor?488標記的羊抗兔IgG（Invitrogen貨號：A-11034），二抗稀釋濃度為1：500，室溫孵育2 h（避光），0.1 M的PB洗3次，將切片在0.02 M的PB中貼于載玻片上，用中性甘油封片，然后在熒光顯微鏡、激光共聚焦顯微鏡下觀察并拍片。

1.3.1.3 圖像分析與數(shù)據(jù)處理

使用Olympus熒光顯微鏡（型號：DP-73）及激光共聚集顯微鏡對大鼠前額葉皮層進行圖像的拍攝，每組大鼠的相同層面中選取6張腦片進行統(tǒng)計，記錄20倍鏡下每張片子的PV陽性細胞的個數(shù)。

1.3.2 免疫印跡（Western n B B l l o o t t）法檢測N N M M D D A A R R22B B蛋白表達

對照組、一次力竭運動組和重復(fù)力竭運動組各6只大鼠用于前額葉皮層NMDAR2B蛋白表達的檢測。對照組在安靜狀態(tài)下、一次力竭運動組在進行一次力竭運動后即刻、重復(fù)力竭運動組在進行7天力竭運動后即刻進行斷頭取腦，快速剝離腦組織后，在冰盤上分離前額葉皮層，驟冷后凍存。進一步測定前進行腦組織裂解，離心并取上清，凍存?zhèn)溆谩２捎枚量蓪幩岱ǎ˙icinchoninic Acid，BCA）法進行蛋白濃度檢測（試劑盒由碧云天生物公司提供），取50微升樣品與5倍的上樣緩沖液（包含4%SDS，10%2-巰基乙醇，20%甘油，0.004%溴酚藍和0.125 M Tris·HCl，pH 6.8）煮沸5 min，置于10%種聚丙烯酰胺凝膠上進行電泳，聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）轉(zhuǎn)膜（恒流300 mA，90 min），用5%脫脂奶粉封閉，室溫1 h，加一抗NMDAR2B（abcam，ab65783，1︰2000）孵育，4℃過夜，TBS-T洗3次，每次5 min；加辣根過氧化物酶（HRP）標記的山羊抗兔二抗（1︰10000）孵育1小時。使用ECL化學(xué)發(fā)光顯色液（pierce），將顯色后的底片掃描，并用IPP6軟件對圖像進行灰度分析。

1.4 統(tǒng)計方法

2 結(jié)果

2.1 P P V V陽性神經(jīng)元在前額葉皮層的表達

免疫熒光染色結(jié)果顯示，前額葉皮層PV陽性神經(jīng)元的陽性表達在對照組較弱，一次力竭運動組有較明顯的陽性神經(jīng)元表達，而重復(fù)力竭運動組陽性神經(jīng)元表達最強（圖1a）。

圖1b顯示，一次力竭運動組及重復(fù)力竭運動組大鼠前額葉皮層PV陽性神經(jīng)元個數(shù)較對照組顯著增加（P＜0.01）。

2.2 N N M M D D A A R R22B B陽性神經(jīng)元在前額葉皮層的表達

免疫熒光染色結(jié)果顯示，前額葉皮層NMDAR2B陽性神經(jīng)元在對照組和重復(fù)力竭運動組無明顯表達，一次力竭運動組可見陽性神經(jīng)元表達（如圖2b所示）。

圖2a顯示，與對照組相比，一次力竭運動組大鼠前額葉皮層NMDAR2B蛋白表達較高，而重復(fù)力竭運動組表達相對較低，但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 前額葉皮層PV陽性神經(jīng)元的表達

圖2 大鼠前額葉皮層NMDAR2B的表達

2.3 運動距離和運動時間

如圖3所示，一次力竭運動組大鼠平均運動距離較重復(fù)力竭運動組短，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；一次力竭運動組運動持續(xù)時間稍低于重復(fù)力竭運動組，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

圖3 大鼠運動距離和運動時間

2.4 N N M M D D A A R R22B B及P P V V陽性神經(jīng)元表達與運動距離的關(guān)系

如圖4所示，大鼠的運動距離與其前額葉皮層NMDAR2B的表達量呈顯著負相關(guān)（P＜0.01，r=?0.936），而與大鼠前額葉皮層PV陽性神經(jīng)元表達個數(shù)無顯著相關(guān)（P=0.609，r=0.312）。

圖4 NMDAR2B及PV陽性神經(jīng)元表達與運動距離相關(guān)性

3 討論

3.1 力竭性運動對大鼠前額葉皮層P P V V陽性神經(jīng)元的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，一次力竭運動及多次力竭運動后大鼠前額葉皮層PV陽性神經(jīng)元表達均顯著增多，這提示力竭運動使前額葉皮層神經(jīng)調(diào)節(jié)微環(huán)路產(chǎn)生了可塑性改變，PV陽性神經(jīng)元在前額葉皮層的分布具有活動依賴性，并且這種改變可能有利于在不同環(huán)境下的適應(yīng)[14]。結(jié)果還說明，來自皮層錐體神經(jīng)元對PV陽性神經(jīng)元的興奮性驅(qū)動增加，PV陽性神經(jīng)元通過抑制周圍的興奮性神經(jīng)元而控制興奮性神經(jīng)元的放電，進而通過反饋和前饋抑制等方式來調(diào)節(jié)機體的行為狀態(tài)[16]。力竭運動是一個典型的應(yīng)激，當(dāng)機體暴露于應(yīng)激狀態(tài)時，一般會引起前額葉皮層功能的紊亂，從而使認知能力降低，這可能與PV陽性神經(jīng)元的過度表達有關(guān)[15]。

運動疲勞是多系統(tǒng)共同作用的結(jié)果，最終引起運動不能持續(xù)，來自外周的感覺通過反饋傳遞到軀體感覺皮層，軀體感覺皮層將信息傳遞到前額葉皮層，前額葉皮層整合來自軀體感覺皮層、運動皮層的信息，通過與背內(nèi)側(cè)紋狀體形成皮層紋狀體環(huán)路，該環(huán)路主要參與了決策、行為靈活性轉(zhuǎn)變、工作記憶等活動。本研究發(fā)現(xiàn)力竭運動引起前額葉皮層PV陽性神經(jīng)元表達增多，提示力竭運動會影響機體在行為靈活性轉(zhuǎn)變、決策等方面的表現(xiàn)。運動行為改變的靈活性與前額葉皮層突觸和樹突棘的重組有關(guān)，皮層抑制性中間神經(jīng)元與皮層興奮性錐體神經(jīng)元通過NMDA受體產(chǎn)生廣泛聯(lián)系。采用在體雙光子成像技術(shù)發(fā)現(xiàn)，在運動性技能學(xué)習(xí)中，皮層表達PV的神經(jīng)元的樹突棘會隨著運動技能的獲得而增加[17]，表達PV的中間神經(jīng)元通過抑制胞體及胞體周圍興奮性神經(jīng)元，從而調(diào)節(jié)興奮性神經(jīng)元的放電，而力竭運動引起PV陽性神經(jīng)元的增加可能與運動技能學(xué)習(xí)引起PV陽性神經(jīng)元表達增加的調(diào)節(jié)機制不同。

3.2 力竭性運動對前額葉皮層N N M M D D A A R R22B B表達的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，在一次性力竭運動中，大鼠前額葉皮層出現(xiàn)了NMDAR2B的表達，并且免疫印跡檢測也證實了一次性力竭運動組NMDAR2B表達較高，這提示在一次性力竭運動中大鼠前額葉皮層選擇性學(xué)習(xí)及靈活性行為轉(zhuǎn)變加強。本研究對NMDAR2B的表達與大鼠的運動距離進行相關(guān)分析，結(jié)果進一步證實NM?DAR2B受體的高表達與行為選擇密切相關(guān)，這同時也提示NMDAR2B受體可能是運動疲勞中樞調(diào)節(jié)機制的一個重要靶點。前額葉皮層錐體神經(jīng)元之間的興奮性傳遞是通過谷氨酸能突觸，其中NMDA受體是非常重要的一種，它參與了經(jīng)典的突觸可塑性，NMDA受體對前額葉皮層的正常功能起非常重要的作用[18]。研究發(fā)現(xiàn)在前額葉皮層敲除NMDAR2B受體或使用NM?DAR2B受體的拮抗劑均可導(dǎo)致行為轉(zhuǎn)換受損[19]。前額葉皮層NMDAR2B的高表達是前額葉皮層選擇性學(xué)習(xí)和靈活性行為轉(zhuǎn)換功能所必需的，然而過高的NM?DAR2B對神經(jīng)元是有害的，這會增加谷氨酸毒性作用[20]。前額葉皮層NMDAR2B受體的高表達說明前額葉皮層來自其他皮層如軀體感覺皮層的興奮性傳入更加敏感，它可能通過激活與其相聯(lián)系的皮層抑制性中間神經(jīng)元通過局部微環(huán)路產(chǎn)生抑制。當(dāng)機體處于應(yīng)激狀態(tài)或給予糖皮質(zhì)激素時，腦內(nèi)胞外谷氨酸的釋放明顯增加，例如在強迫游泳訓(xùn)練中采用在體微透析的方法對前額葉皮層胞外谷氨酸含量進行檢測發(fā)現(xiàn)前額葉皮層谷氨酸的含量明顯升高。前額葉皮層谷氨酸釋放的增加依賴于糖皮質(zhì)激素受體的激活[21]。也有研究指出，長期應(yīng)激可引起NR2B亞型在前額葉皮層的降低，NR2B的拮抗劑Ro25-6981對強迫游泳以及學(xué)習(xí)無助感模型具有抗抑郁作用[22]。有證據(jù)顯示，應(yīng)激可以打破前額葉皮層突觸可塑性的過程，甚至可以損害前額葉皮層的認知控制過程[23]。Li等[24]研究大鼠在應(yīng)激刺激之后，表現(xiàn)出對糖水的偏好降低，而在給予ketamine之后這種行為可以得到較好的糾正。其進一步對應(yīng)激刺激的大鼠給予了NMDAR2B的拮抗劑Ro-25-6981干預(yù)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其對糖水偏好降低的這種行為得到了糾正。他們也指出Ro25-6981對行為和突觸的作用依賴于mTOR的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。

本研究發(fā)現(xiàn)一次力竭運動后前額葉皮層PV表達增強，PV陽性神經(jīng)元作為重要的輸出神經(jīng)元，對于前額葉皮層最終運動行為的決策起重要作用。然而重復(fù)力竭組大鼠前額葉皮層PV陽性神經(jīng)元出現(xiàn)了明顯表達，而NMDAR2B表達相對不高，這可能是前額葉皮層對跑臺運動適應(yīng)的一種表現(xiàn)。這也提示，在重復(fù)力竭后大鼠前額葉皮層可引起運動疲勞中樞調(diào)控環(huán)路的改變。在前額葉皮層與背內(nèi)側(cè)紋狀體之間形成聯(lián)絡(luò)環(huán)路，對于決策及運動學(xué)習(xí)的初級階段起重要調(diào)節(jié)作用，隨著運動學(xué)習(xí)及運動技能的形成，軀體運動皮層-背外側(cè)紋狀體形成的運動環(huán)路在運動的調(diào)控中起重要作用[8]。從本研究中可以看出，重復(fù)力竭運動組前額葉皮層NMDAR2B的表達沒有相對較低，由此推測重復(fù)力竭運動疲勞產(chǎn)生的中樞調(diào)控中軀體運動皮層-背外側(cè)紋狀體通路起重要作用。然而通過分析發(fā)現(xiàn)，NMDAR2B的表達量與運動距離呈非常顯著性負相關(guān)，這也進一步證實了大鼠在運動力竭過程中，NMDAR2B更多地參與了行為的決策和轉(zhuǎn)換。在前額葉皮層抑制NMDA受體可以單純降低GABA能中間神經(jīng)元的活動，增加主要錐體神經(jīng)元的放電頻率，因此NMDA受體優(yōu)先作用于皮層的抑制性中間神經(jīng)元，而NMDA受體的抑制通過對錐體神經(jīng)元的去抑制而引起皮層的興奮增強[25]。

4 小結(jié)

力竭運動通過對PV陽性神經(jīng)元局部環(huán)路的調(diào)節(jié)影響了大鼠前額葉皮層神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的可塑性，這種前額葉皮層的神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可塑性參與了運動疲勞的中樞調(diào)節(jié)，NMDAR2B受體參與了運動疲勞中樞調(diào)節(jié)機制。

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Effectsof Exhausted Treadm illRunning on the Expression of Parvalbum in Positive Neuronsand GluN2B-containing NMDA Receptors in the PrefrontalCortex of Rats

CuiShuqiang1，2，Liu Xiaoli1，Qiao Decai1，Zheng Jian3
1College ofPhysical Education，Beijing NormalUniversity，Beijing 100875，China 2Beijing Research Institute ofSportsScience，Beijing 100075，China 3Guangzhou University ofChineseMedicine，Guangzhou 510006，China Corresponding Author：Qiao Decai，Email：decaiq@bnu.edu.cn

ObjectiveTo explore the effects of excise-induced fatigue on the microloop plasticity of prefrontal cortex through observing the expression of parvalbumin positive neurons in prefrontal cortexes of rats induced by exhaustive exercise，so as to find out the possible mechanism of the central regula?tion of exercise-induced fatigue by measuring the expression of NMDAR2B receptors.Methods Thirtysix Wistar rats were randomly divided into an exhausted group（E），a repeated exhaustion group（RE）and a control group（CG），each of 12.For group E，the adjusted Bedford incremental load of treadmill exercise program was employed：the initial treadmill speed was 8.2 m/min，lasting for 15 minutes，thenincreased to 15 m/min for another 15 minutes，and finally increased to 20 m/min till exhaustion.For RE group，they were given continuous treadmill exercises to exhaustion for consecutive 7 days.The im?munofluorescence technique was used to observe the expression of PV+interneurons after exhausted treadmill running.The Western blotting technique was used to determine the expression of NMDAR2B in the tissue of the prefrontal cortex.ResultsAfter the exhausted treadmill running，the expression of PV+interneurons in the prefrontal cortexes of both E and RE groups increased significantly compared with the control group（P＜0.01）.The immunofluorescence results indicated that NMDAR2B positive neu?rons were seen in group E，but not obviously in group CG and RE.The Western blotting showed that compared with CG group the protein expression of NMDAR2B in prefrontal cortexes of group E was rel?atively high，and that of group RE was relatively low，but without significant difference（P＞0.05）.The running distance and prefrontal cortex NMDAR2B expression were found negatively correlated（P＜0.01）.Conclusions Exhaustive exercises have an impact on the plasticity in rats’prefrontal cortex neural network through regulating the local loop of PV positive neurons.This plasticity of the prefron?tal cortex is involved in the regulation of central fatigue.The present study might provide morphologi?cal basis for the research of central mechanism of the exercise-induced fatigue.

exercise-induced fatigue，NMDAR2B parvalbumin，prefrontal cortex，central regulation

2016.11.15

國家自然科學(xué)基金資助項目（31571221）；北京市自然科學(xué)基金資助項目（5142012）

喬德才，Email：decaiq@bnu.edu.cn