膝關(guān)節(jié)韌帶組織工程的研究進(jìn)展

李豫皖 金瑛 熊華章 劉毅

貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨一科（貴州省遵義市563000）

膝關(guān)節(jié)韌帶組織工程的研究進(jìn)展

李豫皖 金瑛 熊華章 劉毅

貴州省遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院骨一科（貴州省遵義市563000）

目的：對(duì)目前膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶在體內(nèi)外的研究進(jìn)展，應(yīng)用及價(jià)值進(jìn)行綜述。方法：查閱國內(nèi)外近年來關(guān)于組織工程韌帶構(gòu)建治療膝關(guān)節(jié)韌帶損傷的相關(guān)應(yīng)用文獻(xiàn)，對(duì)包括種子細(xì)胞、生長因子和支架材料三大要素對(duì)構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)。結(jié)果：種子細(xì)胞、支架材料的篩選和適當(dāng)?shù)纳L因子是構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶的核心和必要條件。種子細(xì)胞培養(yǎng)條件的優(yōu)化和生長因子的濃度選擇及配比是構(gòu)建良好組織工程韌帶的關(guān)鍵，而實(shí)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶在體內(nèi)存活和更好發(fā)揮生物學(xué)效用，仍需進(jìn)一步研究。隨著生物醫(yī)學(xué)及材料科學(xué)的發(fā)展，膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶的構(gòu)建方法及方式在不斷改進(jìn)。

膝關(guān)節(jié)；組織工程韌帶；種子細(xì)胞；生長因子；支架材料

人前交叉韌帶（anterior cruciate ligament，ACL）作為限制膝關(guān)節(jié)前傾，防止脛骨向前過度移位，維持膝關(guān)節(jié)正常活動(dòng)與穩(wěn)定的重要結(jié)構(gòu)，其組織學(xué)結(jié)構(gòu)為結(jié)締組織。在膝關(guān)節(jié)損傷中，前交叉韌帶較為常見，其多為撕裂或斷裂傷，且運(yùn)動(dòng)性損傷在年輕患者中的發(fā)病率更高，例如落地、變向、扭轉(zhuǎn)等動(dòng)作中[1]。由于支配ACL的血管較少，血供較差，因此ACL損傷后一般難以自行修復(fù)[2]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，美國每年有30萬名新增膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷患者，絕大部分患者需要手術(shù)重建治療[3]。目前膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷患者大量采用關(guān)節(jié)鏡下ACL重建術(shù)，移植物種類較多，包括自體腘繩肌腱、以LARS韌帶為代表的人工韌帶和同種異體移植韌帶等，但重建術(shù)后存在諸多并發(fā)癥，如關(guān)節(jié)僵硬、肌力下降、移植物免疫排斥反應(yīng)、重建后移植物斷裂，遠(yuǎn)期并發(fā)癥如膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生率比正常人群高[4]。除了膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷后韌帶重建手術(shù)方式方法的改進(jìn)、術(shù)后康復(fù)及膝關(guān)節(jié)生物力學(xué)機(jī)制的探討以外，對(duì)組織工程化膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶的研究也是目前研究熱點(diǎn)，因?yàn)檫@對(duì)于改善韌帶重建手術(shù)移植物的選擇具有重要意義。膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶以生物材料與再生醫(yī)學(xué)為基礎(chǔ)，目的在于通過種子細(xì)胞經(jīng)生長因子作用后與支架搭載，使得新生韌帶組織達(dá)到一定的機(jī)械強(qiáng)度并具有相應(yīng)的生物活性及組織相容性，促進(jìn)ACL的修復(fù)與再生，為膝關(guān)節(jié)前交叉韌帶損傷提供了新型的治療模式[5，6]。通過查閱近年來相關(guān)組織工程化韌帶修復(fù)和重建ACL的文獻(xiàn)，對(duì)種子細(xì)胞、生長因子和支架材料的研究進(jìn)展綜述如下。

1 種子細(xì)胞

由于韌帶組織特殊的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)及其復(fù)雜的生物學(xué)功能，因此對(duì)于構(gòu)建組織工程化韌帶，種子細(xì)胞的篩選至關(guān)重要[7]。ACL主要由致密的結(jié)締組織構(gòu)成，以Ⅰ、Ⅲ型膠原蛋白及纖維連接蛋白為主（約90%以上），其余為細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白構(gòu)成，細(xì)胞外基質(zhì)蛋白主要以彈性蛋白為主[8]。組織工程種子細(xì)胞的篩選是構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶非常重要的環(huán)節(jié)，組織工程化韌帶種子細(xì)胞主要是成體來源的成纖維細(xì)胞，包括韌帶細(xì)胞、肌腱細(xì)胞、肌細(xì)胞，其中韌帶細(xì)胞來源于ACL、髕韌帶、內(nèi)外側(cè)副韌帶等；肌腱細(xì)胞來源于跟腱、髕腱等；不同組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells，MSCs）也是構(gòu)建組織工程化韌帶的重要種子細(xì)胞來源[9，10]。

人前交叉韌帶成纖維細(xì)胞（human anterior cruci?ate ligament fibroblast cells，hACLFs）來源于人前交叉韌帶，與其他組織來源的成體細(xì)胞相比，hACLFs在膠原蛋白合成和免疫排斥方面具有明顯優(yōu)勢[11]，Brune等采用形態(tài)完整與斷裂的ACL組織中提取的韌帶成纖維細(xì)胞植入支架材料并進(jìn)行體外培養(yǎng)，研究發(fā)現(xiàn)兩組的韌帶成纖維細(xì)胞在形態(tài)學(xué)、肌動(dòng)蛋白及韌帶基本結(jié)構(gòu)方面無顯著性差異，這說明可以使用自身損傷或斷裂后的ACL作為種子細(xì)胞來源，經(jīng)體外分離培養(yǎng)后反過來治療ACL損傷[12]。Nguyen等[13]使用hACLFs來治療山羊橫斷性ACL和內(nèi)側(cè)副韌帶損傷，并發(fā)現(xiàn)hACLFs作用于韌帶斷面的膠原纖維的含量顯著性上升，組織學(xué)特征顯示韌帶的愈合具有相似的內(nèi)在愈合反應(yīng)，斷裂載荷顯著提高。但hACLFs由于其體外分離培養(yǎng)較困難，培養(yǎng)周期較長，增殖能力較其他細(xì)胞弱[14]，因此hACLFs并不能完全充當(dāng)組織工程韌帶最優(yōu)的種子細(xì)胞。

MSC作為近年來組織工程化韌帶新興的種子細(xì)胞，相比成體細(xì)胞具有諸多優(yōu)勢，MSC具有較強(qiáng)的增殖活性，具有免疫調(diào)節(jié)、定向歸巢功能，具有高豐度、高純度等特點(diǎn)[15]，并且MSCs具有向成骨、成軟骨、成脂及多向分化的潛能[16]，目前已廣泛用于骨損傷、骨髓損傷、肝臟、血管損傷等疾病的動(dòng)物模型體內(nèi)研究[17-19]。以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells，BMSCs）為代表的MSC已廣泛應(yīng)用于組織工程韌帶相關(guān)體內(nèi)外研究。劉毅等研究發(fā)現(xiàn)鼠BMSCs可在體外大量增殖，與韌帶細(xì)胞共培養(yǎng)，經(jīng)轉(zhuǎn)化生長因子與堿性成纖維細(xì)胞生長因子作用后，可向韌帶細(xì)胞誘導(dǎo)分化，且誘導(dǎo)后細(xì)胞增殖能力及活性增加，韌帶相關(guān)特異性基因表達(dá)上調(diào)[20]。也有研究證明，BMSCs可在膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)軟骨、半月板及韌帶損傷或退變處定向歸巢、增殖并向損傷細(xì)胞誘導(dǎo)分化，且促進(jìn)血管生成，降低韌帶損傷細(xì)胞的凋亡，對(duì)損傷組織進(jìn)行修復(fù)再生[21]。Fu等的研究發(fā)現(xiàn)，前交叉韌帶殘端組織中存在有MSCs，這些MSCs具有自我更新及多向分化潛能，在韌帶損傷后，這些保留在殘端的MSCs可被歸巢并遷徙至損傷處進(jìn)行自我修復(fù)及再生，其中一部分細(xì)胞還可以向韌帶細(xì)胞分化，這說明韌帶受損后并非不能自我修復(fù)及愈合，并且這種來源于前交叉韌帶殘端組織特異的MSC很有可能作為韌帶或肌腱再生過程中理想的種子細(xì)胞來源[22]。

由于上述hACLFs本質(zhì)為成纖維狀細(xì)胞，屬成熟的體細(xì)胞，基本無再分化能力，且hACLFs在體外擴(kuò)增速度較慢，需要在韌帶組織培養(yǎng)過程中敏感時(shí)期制備細(xì)胞，因此對(duì)韌帶損傷的修復(fù)能力有限[23]。然而，MSCs在體外擴(kuò)增及分化能力較強(qiáng)，隨傳代次數(shù)的增加，可短時(shí)間內(nèi)獲得大量細(xì)胞，因此使用生長因子及給予不同的體外培養(yǎng)條件，可以讓MSCs定向向韌帶細(xì)胞誘導(dǎo)分化，為韌帶的修復(fù)再生提供了新思路。

對(duì)種子細(xì)胞進(jìn)行不同培養(yǎng)條件及方式培養(yǎng)以滿足組織工程構(gòu)建的需求，是組織工程亟需解決的難題。研究顯示對(duì)MSC與目的細(xì)胞共培養(yǎng)，可以獲得活性更高、數(shù)量更多的種子細(xì)胞，使種子細(xì)胞在數(shù)量及功能上與目的細(xì)胞更相近。Wu等[24]研究通過大鼠BMSCs與肌腱細(xì)胞共培養(yǎng)，可顯著增加肌腱相關(guān)特異性基因的表達(dá)和膠原基質(zhì)的產(chǎn)生，尤其在共培養(yǎng)細(xì)胞比例為1︰1或5︰1時(shí)，其共培養(yǎng)的細(xì)胞形成的細(xì)胞膜片可促進(jìn)大鼠髕腱愈合。Canseco等[25]通過對(duì)豬ACLFs與MSC共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)共培養(yǎng)對(duì)豬ACL重建有更好的效果，當(dāng)細(xì)胞比例為1︰1時(shí)，其Ⅰ、Ⅲ型膠原，細(xì)胞連接素（Tenas?cin-C）表達(dá)有顯著性提高。此外，以1︰1比例共培養(yǎng)4周時(shí)，Ⅰ、Ⅲ型膠原比例與正常的韌帶組織最為相近，因此相對(duì)其他細(xì)胞培養(yǎng)模式，1︰1比例的共培養(yǎng)模式可促進(jìn)MSC向hACLFs細(xì)胞分化，甚至加快韌帶損傷的愈合。Yu等[26]研究顯示，通過使用缺氧誘導(dǎo)因子1-α（HIF-1α），采用人受損肌腱細(xì)胞與脂肪源性間充質(zhì)干細(xì)胞（ADMSCs）間接共培養(yǎng)，可以提高ADMSCs向肌腱細(xì)胞分化，另外在低氧環(huán)境下對(duì)兩種細(xì)胞共培養(yǎng)（O2＜2%）可增強(qiáng)分化效果，上調(diào)HIF-1α基因的表達(dá)，這提示缺氧培養(yǎng)條件下經(jīng)HIF-1α激活并表達(dá)對(duì)于ADMSCs向肌腱細(xì)胞分化具有重要作用，這為ADMSCs在肌腱再生的體內(nèi)應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。Veronesi等[27]通過構(gòu)建ADMSCs與大鼠肌腱細(xì)胞體外間接共培養(yǎng)模型，研究探討了衰老和雌激素缺乏對(duì)肌腱細(xì)胞的影響，研究發(fā)現(xiàn)老年人的雌激素缺乏可提高肌腱細(xì)胞的增殖和治愈率，但相比于正常組的ADMSCs與肌腱細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)效果，老年人雌激素缺乏的ADMSCs其增殖和肌腱相關(guān)基因包括COL-Ⅰ、Ⅲ，Scx和Decorin，Tenas?cin-C蛋白表達(dá)相對(duì)較低，作者發(fā)現(xiàn)，異體ADSCs在提高肌腱細(xì)胞增殖、膠原表達(dá)及愈合率方面要高于自體細(xì)胞。

利用膝關(guān)節(jié)韌帶細(xì)胞與MSCs通過共培養(yǎng)及其他培養(yǎng)條件，可使MSCs處于目的細(xì)胞的生長外環(huán)境下，并接受目的細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子及建立相關(guān)細(xì)胞連接，使MSCs更好地誘導(dǎo)生成韌帶細(xì)胞。此外，將制好的種子細(xì)胞搭載在支架上移入受體體內(nèi)，種子細(xì)胞在體內(nèi)可以釋放多種趨化及細(xì)胞因子，增強(qiáng)種子細(xì)胞在體內(nèi)的增殖，促進(jìn)支架與受體相容，促進(jìn)損傷愈合，并使體內(nèi)韌帶、滑膜細(xì)胞向損傷及支架處遷移、增殖，達(dá)到體內(nèi)韌帶再生的目的。Parolini等[28]發(fā)現(xiàn)MSCs在其分子表型鑒定中低表達(dá)組織相容性Ⅰ類抗原，包括HLA-A、HLA-B、HLA-C，同時(shí)也低表達(dá)共刺激分子CD14、CD80、CD83、CD86、CD40L等及組織相容性Ⅱ類抗原HLA-DR，這說明MSCs具有較低的免疫原性，不引起或較低度引起同種異體或異種的淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)，即不會(huì)或較低度引起免疫排斥及炎癥反應(yīng)，從而保護(hù)支架等移植物，強(qiáng)化韌帶的修復(fù)。

2 生長因子

生長因子在組織修復(fù)過程中，常?？梢酝ㄟ^調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增殖及細(xì)胞轉(zhuǎn)化來提高細(xì)胞活性及增強(qiáng)細(xì)胞效應(yīng)；并且生長因子在細(xì)胞連接信號(hào)的跨膜傳導(dǎo)，啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)基因的上調(diào)或下調(diào)以影響新蛋白的產(chǎn)生，調(diào)整細(xì)胞增殖、分化、趨化及胞外基質(zhì)和血管的生成過程方面起著舉足輕重的作用，如堿性成纖維生長因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）、轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor beta，TGF-β）、血小板源性生長因子（platelet-derived growth factor，PDGF）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）等[29-32]。

bFGF屬于與肝素有很強(qiáng)親和力的生長因子家族，分布于垂體、腦和神經(jīng)組織及視網(wǎng)膜、腎上腺等組織，其中垂體中含量最高，其生物學(xué)作用極其廣泛，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、向成纖維狀分化，促進(jìn)血管生成及肉芽組織再生作用，且在神經(jīng)組織生長發(fā)育過程中也十分重要，因此對(duì)于韌帶及肌腱損傷的修復(fù)可能具有至關(guān)重要的作用[33]。Leong等人[34]的研究評(píng)估了組織工程重建鼠前交叉韌帶中肝素介導(dǎo)的bFGF的釋放，結(jié)果顯示釋放bFGF的支架有更明顯的韌帶機(jī)械應(yīng)力提高和細(xì)胞增殖，相比于無bFGF釋放組有顯著性差異，這說明應(yīng)用組織工程的方法對(duì)前交叉韌帶斷裂具有治療潛力。Chenghao等[35]單獨(dú)和聯(lián)合使用bFGF和神經(jīng)酰胺激活的蛋白磷酸酶（CaPP）對(duì)纖維蛋白凝塊促進(jìn)腱骨愈合的影響進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，經(jīng)bFGF和CaPP處理后的纖維蛋白凝塊，植入到兔跟腱后，細(xì)胞增殖加快，腱骨連接更加成熟，相比于未用生長因子處理組，組織學(xué)評(píng)分更高，骨橋蛋白、堿性磷酸酶、RUNT及相關(guān)膠原的mRNA表達(dá)水平均有顯著提高，bFGF和CaPP加載于纖維蛋白凝塊可進(jìn)一步增強(qiáng)早期愈合。Tang等[36]研究顯示，腺病毒超量轉(zhuǎn)染bFGF和VEGF基因后，可有效糾正肌腱損傷后愈合不完全，相比于對(duì)照組，可顯著提高I型膠原的細(xì)胞外分子的生成，加速細(xì)胞增殖，提高拉伸力。這些結(jié)果表明，生長因子為解決肌腱和韌帶內(nèi)源性及外源性愈合能力不足提供了一種有效的治療可能。

TGF-β系調(diào)節(jié)細(xì)胞生長及分化的TGF-β超家族。這一家族除TGF-β外，還有活化素、抑制素和骨形成蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）。TGF-β這種細(xì)胞因子可以使正常的成纖維細(xì)胞的表型發(fā)生轉(zhuǎn)化[37]，TGF-β有三個(gè)亞型，包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β 3。相關(guān)研究提示，TGF-β可促進(jìn)成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞的增殖生長[38]；TGF-β1和TGF-β2可通過調(diào)節(jié)IL-6基因轉(zhuǎn)錄并促進(jìn)人成纖維細(xì)胞IL-6的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)免疫及炎癥反應(yīng)，抑制免疫活性細(xì)胞的增殖，抑制淋巴細(xì)胞的分化等[39]；TGF-β1還可促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的生成，如膠原蛋白、纖維連接蛋白的表達(dá)，抑制ECM降解[40]。金瑛等[41]通過對(duì)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞（hAMSCs）向膝關(guān)節(jié)韌帶細(xì)胞分化，使用TGFβ1和bFGF進(jìn)行細(xì)胞定向誘導(dǎo)，在經(jīng)過體外誘導(dǎo)后，Ⅰ、Ⅲ型膠原，纖維連接蛋白和細(xì)胞連接素等韌帶相關(guān)特異性基因表達(dá)上調(diào)，韌帶特異性蛋白合成增加。Xie等[42]使用等雙軸拉伸模仿機(jī)械損傷ACL和內(nèi)側(cè)副韌帶（MCL）成纖維細(xì)胞后，使用TGF-β1誘導(dǎo)ACL和MCL編碼賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX），結(jié)果顯示LOX可以促進(jìn)膠原生成及彈性蛋白交聯(lián)，增加ECM的生成，且MCL中的LOX表達(dá)比ACL更高。

BMP作為TGF-β家族的一大成員，其成骨效應(yīng)已被大量研究證實(shí)。Takigami等[43]采用BMP-2聯(lián)合自體半肌腱對(duì)兔ACL損傷行韌帶重建術(shù)，術(shù)后采用組織學(xué)和生物力學(xué)分析，結(jié)果顯示在實(shí)驗(yàn)組第8和12周時(shí)，隧道內(nèi)的新骨已取代移植的肌腱，并且出現(xiàn)了腱骨交接面處的典型組織學(xué)特征。生物力學(xué)測試顯示12周時(shí)，實(shí)驗(yàn)組拉伸強(qiáng)度較對(duì)照組更大，這說明BMP-2具有成骨效應(yīng)，可促進(jìn)腱骨愈合。Ruschke等[44]對(duì)不同年齡段的患者進(jìn)行分級(jí)，使用BMP-2在不同時(shí)間點(diǎn)刺激體外培養(yǎng)的存在骨關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）患者ACL和健康組ACL成纖維細(xì)胞，并對(duì)Smad和相關(guān)基因及關(guān)鍵信號(hào)磷酸化蛋白進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)BMP-2基因介導(dǎo)的Smad1/5/8的磷酸化水平在不同年齡段的患者中存在差異，BMP-2/Smad靶基因如ID1和Smad6與正常組相比要低，這說明BMP-2在延緩ACL退變過程中發(fā)揮重要效用。Cheng等[45]研究發(fā)現(xiàn)BMP-2與VEGF聯(lián)合使用可以促進(jìn)韌帶與纖維軟骨附著點(diǎn)處的腱骨愈合。Kuroda等[46]在大鼠骨缺損模型中使用BMP-12基因轉(zhuǎn)染重建肌腱及韌帶樣組織，結(jié)果顯示，通過2周的BMP-12轉(zhuǎn)基因誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)染后的組織纖維化明顯，骨形成于第8周，重建8、12周后腱骨愈合良好，說明BMP-12基因轉(zhuǎn)染對(duì)肌腱韌帶樣組織再生愈合有促進(jìn)作用。

此外，諸多生長因子如PDGF、VEGF、富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）[47]、表皮生長因子（epider?mal Growth Factor，EGF）[48]、生長分化因子（growth-dif?ferentiation factor，GDF）[49]、胰島素樣生長因子（insulinlike growth factors，IGF）[50]均可促進(jìn)膝關(guān)節(jié)韌帶組織的修復(fù)再生。Komzak研究[47]顯示PRP中含有大量的血漿內(nèi)血小板，其濃度達(dá)到106/μL以上，PRP中含有高于正常血漿中5倍左右的生長因子，具有促進(jìn)細(xì)胞及組織愈合的能力。但也有研究提示單獨(dú)使用PRP對(duì)韌帶組織的修復(fù)能力較弱，因此仍不能作為膝關(guān)節(jié)韌帶損傷最佳的治療方式，關(guān)于PRP最佳劑量、與其他生長因子聯(lián)合應(yīng)用的作用時(shí)間及使用方法等需要更進(jìn)一步探討。Woo等[48]研究發(fā)現(xiàn)光固定化EGF誘導(dǎo)人ACL細(xì)胞，可促進(jìn)其快速增殖。Tashiro T等[49]觀察使用GDF-5對(duì)大鼠MCL間隙損傷的修復(fù)作用，結(jié)果顯示，3周時(shí)，韌帶強(qiáng)度較對(duì)照組明顯提高，Ⅰ、Ⅲ型膠原mRNA表達(dá)上調(diào)，組織中的膠原纖維直徑增加，說明應(yīng)用GDF-5可促進(jìn)韌帶愈合。Herchenhan等[50]研究IGF-1對(duì)工程化人肌腱組織中的Ⅰ型膠原合成的影響，發(fā)現(xiàn)IGF可補(bǔ)充促進(jìn)膠原蛋白的形成，對(duì)早期肌腱拉傷的荷載具有正性調(diào)節(jié)作用。

目前用于構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶的生長因子種類較多，但作用效果并非一成不變，具有聯(lián)合性、時(shí)效性。通過完善生長因子的控制及釋放技術(shù)，可達(dá)到對(duì)韌帶損傷更優(yōu)更自然的修復(fù)再生。然而生長因子與種子細(xì)胞作用過程中產(chǎn)生的生物相容效應(yīng)，其內(nèi)部的分子信號(hào)機(jī)制很多尚未明了，仍需要進(jìn)一步研究和探討。目前在構(gòu)建韌帶組織工程研究中應(yīng)用較多的生長因子見表1。

表1 生長因子在構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶中的應(yīng)用研究

3 支架材料

構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶所選擇的支架材料應(yīng)擁有機(jī)械強(qiáng)度高，與種子細(xì)胞的搭載、黏附、增殖、發(fā)揮生物活性等功能，且要與移植物受體存在較好的組織相容性，并能夠在生物體內(nèi)降解以促進(jìn)韌帶細(xì)胞組織完全生長，更快地促進(jìn)膝關(guān)節(jié)韌帶組織再生和修復(fù)。用于構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶的支架材料包括生物材料型支架、可降解合成材料支架、天然材料支架。

3.1 生物材料型支架

生物材料型支架主要由ECM構(gòu)成，其主要骨架由蛋白質(zhì)構(gòu)成，主要來源于人、牛、馬等哺乳動(dòng)物而制成的脫細(xì)胞支架（decellularized matrix as scaffold）[51，52]，如肌腱片、心包或真皮組織、小腸粘膜等，這類支架經(jīng)過去除其他膠原成分，主要保留以Ⅰ型膠原為主（占90%以上）的膠原蛋白[53]。Cheng等[54]的體外實(shí)驗(yàn)顯示，早期脫細(xì)胞真皮支架能夠較好地搭載兔ACL細(xì)胞并可以保持較快的增殖速度和細(xì)胞活性，但隨著時(shí)間的延長，植入動(dòng)物體內(nèi)的支架其附著細(xì)胞逐漸減少，支架的機(jī)械拉伸能力降低，這說明脫細(xì)胞支架其功能并不能完全滿足構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶的需要，甚至出現(xiàn)免疫排斥的風(fēng)險(xiǎn)[55]。此后，Grier等[56]研發(fā)出一種膠原-粘多糖復(fù)合支架（GAG），并探討了馬肌腱細(xì)胞特異性基因的表達(dá)和生物活性與改變支架孔徑和交聯(lián)密度的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)支架具有較高的交聯(lián)密度和較小的孔徑能夠更好地促進(jìn)細(xì)胞代謝活性，保持并增加肌腱及韌帶相關(guān)基因的表達(dá)。這些結(jié)果表明，通過改變支架材料的交聯(lián)密度和孔隙大小可提高人工肌腱的結(jié)構(gòu)功能和機(jī)械拉力。為了提高上述支架的機(jī)械性能和生物相容性，研究人員采用特殊的處理方式，如潘娟等[57]制備犬來源的脫細(xì)胞肌腱片，用于促進(jìn)兔肩袖損傷的腱骨愈合，研究發(fā)現(xiàn)12周時(shí)，損傷的腱骨界面肉芽組織消失，成纖維細(xì)胞，Sharpey纖維、新生軟骨和軟骨細(xì)胞數(shù)量增多，腱骨界面成熟，說明經(jīng)反復(fù)凍融結(jié)合核酸酶處理后制備的犬脫細(xì)胞肌腱片可促進(jìn)兔肩袖損傷腱骨愈合。

天然蠶絲支架作為一種傳統(tǒng)的生物材料，其生物相容性良好，在拉伸強(qiáng)度方面與人ACL組織相似，其生物降解速度較慢，可以在生物體內(nèi)保持基本的拉伸強(qiáng)度不變的條件下達(dá)數(shù)十月[58]，說明蠶絲支架可較長時(shí)間保護(hù)膝關(guān)節(jié)內(nèi)部韌帶的穩(wěn)定性，為新生韌帶細(xì)胞和組織提供足夠的修復(fù)再生時(shí)間，讓膠原蛋白、纖維連接及血管的生成與自體原有韌帶相似。Teuschl等[59]使用蠶絲纖維支架對(duì)羊ACL重建的組織學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，新型蠶絲纖維支架能刺激體內(nèi)條件下ACL再生，重建后細(xì)胞增殖提高再生組織的活性，蠶絲纖維含量在6個(gè)月時(shí)開始明顯下降，12個(gè)月后基本消失，提示使用蠶絲纖維支架重建ACL可以為膝關(guān)節(jié)損傷提供新治療選擇。Chen等[60]研究通過Scleraxis基因在人胚胎干細(xì)胞來源（hESCs）的MSCs中過度表達(dá)與針織蠶絲膠原支架聯(lián)合構(gòu)建組織工程化肌腱，發(fā)現(xiàn)Scleraxis基因和機(jī)械應(yīng)力的刺激可提高M(jìn)SCs中肌腱相關(guān)特異性基因表達(dá)，并且在動(dòng)物體內(nèi)肌腱修復(fù)模型中機(jī)械刺激可促進(jìn)細(xì)胞的重新排列，MSCs在針織蠶絲支架上大量增殖并分化，膠原纖維直徑增大，組織學(xué)評(píng)分和拉伸能力更高。此外，也有文獻(xiàn)報(bào)道殼聚糖[61]、巖藻酸[62]和透明質(zhì)酸（HA）[63]等生物材料型支架用于構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶。

3.2 可降解合成材料支架

人工合成的可降解材料支架在延展拉伸性能、降解速度、搭載細(xì)胞及與支架受體生物相容性方面均有很大的提高。膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶研究和應(yīng)用較多的可降解合成材料為聚乳酸（PLA）[64]及其共聚物（PLGA）[65]、聚羥基乙酸（polyglycolic acid，PGA）[66]、左旋聚乳酸（poly l-lactic acid，PLLA）[67]等。Toosi等[68]使用膠原-PGA海綿支架搭載BMSCs，結(jié)果顯示BMSCs在膠原-PGA海綿支架的細(xì)胞活力、增殖和分化均有顯著提高。掃描電鏡顯示PGA支架具有連通孔隙，大小為190μm，膠原-PGA海綿支架在BMSCs的細(xì)胞黏附、增殖率和成骨分化方面要優(yōu)于單一的膠原支架，說明PGA支架是在不損害生物相容性的情況下可有效加強(qiáng)膠原海綿支架的效用。Deepthi等[69]使用分層殼聚糖膠原水凝膠與PLLA支架構(gòu)建納米纖維屈肌腱組織再生，發(fā)現(xiàn)膠原水凝膠經(jīng)電紡后分層與海藻酸巖凝膠外涂可以防止肌腱的粘連，PLLA支架聯(lián)合分層殼聚糖膠原水凝膠具有良好的細(xì)胞增殖特性，可促進(jìn)屈肌腱再生，肌腱細(xì)胞在支架中附著良好。Pinese等[70]使用PLA-聚環(huán)氧乙烯針織支架加強(qiáng)ACL愈合，結(jié)果顯示ACL在PLA-聚環(huán)氧乙烯針織支架中增殖效果良好，具有良好的細(xì)胞相容性，通過線形、扭曲、繩狀、編織狀這4種空間排布，三維編織的針織PLA-聚環(huán)氧乙烯支架符合韌帶組織的力學(xué)性能，可作為韌帶重建的支架材料。Khan等[71]采用PLGA-己內(nèi)酯/L-丙交酯（PLCL）聯(lián)合支架，通過靜態(tài)和循環(huán)模式體外培養(yǎng)，觀察其對(duì)韌帶組織工程韌帶拉伸、扭轉(zhuǎn)相關(guān)力學(xué)性能的改變，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，PLGA-PLCL在靜態(tài)條件下定植具有良好的細(xì)胞相容性。生物力學(xué)測試顯示兩種支架的降解程度存在競爭關(guān)系且降解過程中與水解酶和PLGA的水解作用相關(guān)，研究說明PLGA支架的結(jié)構(gòu)與培養(yǎng)環(huán)境有很大關(guān)系，包括生物相容性和細(xì)胞來源等，但PLGA在組織工程韌帶中的良好應(yīng)用必須通過延緩其降解及改進(jìn)結(jié)構(gòu)來完成。此外還有研究報(bào)道多種支架聯(lián)合[72]，生長因子[73]、生物活性因子[74]與支架聯(lián)合使用等加強(qiáng)膝關(guān)節(jié)韌帶組織的修復(fù)與再生?？傊?，PLA強(qiáng)度較高，PGA降解速度較快，PLGA的降解性和拉伸性能與培養(yǎng)條件有很大關(guān)系、調(diào)節(jié)范圍更大。就理想的支架選擇而言，控制其降解速率，增強(qiáng)其機(jī)械性能，細(xì)胞相容性良好，對(duì)于構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶均有重要意義。

目前支架材料均處于基礎(chǔ)研究階段，其臨床適用性還有待進(jìn)一步評(píng)估[75]。見表2。

表2 構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶的常見支架材料

4 培養(yǎng)體系與反應(yīng)條件

構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程化韌帶需要的反應(yīng)條件，包括對(duì)種子細(xì)胞和目的細(xì)胞的培養(yǎng)方法，如單層共培養(yǎng)、Transwell共培養(yǎng)、三維培養(yǎng)等[76]，使目的細(xì)胞所分泌的細(xì)胞因子影響并促進(jìn)種子細(xì)胞向目標(biāo)細(xì)胞分化；對(duì)支架提供一定的力學(xué)刺激，如壓縮力、剪切力、流體壓力[77]，創(chuàng)造出與機(jī)體相似的內(nèi)環(huán)境，促進(jìn)營養(yǎng)物質(zhì)與種子細(xì)胞充分均勻接觸，增進(jìn)細(xì)胞的增殖分化和ECM相關(guān)蛋白的合成，在液體流動(dòng)培養(yǎng)基的影響下讓種子細(xì)胞與支架材料分布更加勻稱。另一方面，相關(guān)力學(xué)刺激可影響正常體內(nèi)的韌帶生長，體外移植韌帶也等同于自然韌帶，需要機(jī)械信號(hào)的一系列刺激。近年研究[78，79]提示通過機(jī)械力刺激韌帶細(xì)胞可改變細(xì)胞的黏附活性和細(xì)胞骨架的重塑，并且可促進(jìn)韌帶細(xì)胞生成更多的Ⅰ、Ⅲ膠原，然而要尋找到膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶最適的機(jī)械力學(xué)刺激，還需對(duì)膝關(guān)節(jié)韌帶形成中的力學(xué)傳導(dǎo)通路機(jī)制進(jìn)行研究。

5 展望

構(gòu)建膝關(guān)節(jié)組織工程韌帶，需要對(duì)種子細(xì)胞的篩選、支架材料的分類、生長因子的合理搭配及培養(yǎng)體系與反應(yīng)條件等多個(gè)環(huán)節(jié)的搭配與重塑。隨著生物醫(yī)學(xué)的發(fā)展，我們可以選擇與機(jī)體具有更好生物相容性、機(jī)械拉伸性能更佳的組織工程人工韌帶，在此過程中需要更深入研究膝關(guān)節(jié)韌帶損傷后的修復(fù)與再生機(jī)制。而要獲得組織工程化韌帶與人膝關(guān)節(jié)韌帶功能上的完全一致，尚需生命科學(xué)、工程力學(xué)、材料科學(xué)等多專業(yè)學(xué)科在不同領(lǐng)域的不斷發(fā)展和合作。

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2016.10.17

貴州省科技廳社會(huì)發(fā)展科技攻關(guān)項(xiàng)目（黔社科合SY字[2010]3091）；貴州省科學(xué)技術(shù)基金資助項(xiàng)目（黔科合LH字[2016] 7477號(hào)）

劉毅，Email：13308529536@163.com