QuEChERS-UPLC-HR-MS法測(cè)定蔬菜大棚土壤中農(nóng)藥殘留

宮小明王洪濤華萌萌王 玲

（1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東濰坊 261041；2.濰坊醫(yī)學(xué)院）

QuEChERS-UPLC-HR-MS法測(cè)定蔬菜大棚土壤中農(nóng)藥殘留

宮小明1，2王洪濤1華萌萌1王 玲2

（1.濰坊出入境檢驗(yàn)檢疫局 山東濰坊 261041；2.濰坊醫(yī)學(xué)院）

采用QuEChERS法結(jié)合超高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法建立了蔬菜大棚土壤中百余種常見(jiàn)農(nóng)藥殘留的同時(shí)分析方法。樣品采用乙腈（含體積分?jǐn)?shù)為2%的甲酸）提取，ODS粉凈化，經(jīng)Agilent ZORBAX SB-C18柱（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）色譜柱分離，高分辨質(zhì)譜進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：在0.01-1.0mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，農(nóng)藥儀器響應(yīng)值與其質(zhì)量濃度呈良好線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)均大于0.99；添加水平在0.01mg/kg時(shí)，平均回收率為68.7%-101.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為6.2%-14.1%，定量限均小于0.005mg/kg。該方法具有靈敏度高、簡(jiǎn)便、快速等優(yōu)點(diǎn)，能充分滿足蔬菜大棚土壤中農(nóng)藥殘留的高通量檢測(cè)要求。

土壤；農(nóng)藥殘留；液相色譜-高分辨質(zhì)譜；QuEChERS

1 前言

現(xiàn)代農(nóng)業(yè)的發(fā)展對(duì)于農(nóng)藥的依賴程度越來(lái)越高[1]，然而農(nóng)藥作為人類合成的高危險(xiǎn)化學(xué)品，過(guò)度使用和濫用對(duì)環(huán)境和人類健康都會(huì)造成極大危害，其殘留物會(huì)進(jìn)入土壤、空氣、地表水和地下水，甚至進(jìn)入食物鏈從而對(duì)整個(gè)生態(tài)系統(tǒng)造成破壞[2]，因此農(nóng)藥殘留問(wèn)題已經(jīng)成為影響地球環(huán)境、人類社會(huì)發(fā)展亟待解決的難題。解決這一難題的重點(diǎn)在于從技術(shù)上了解，并制定相關(guān)的法律、法規(guī)及政策，而農(nóng)藥殘留的檢測(cè)在技術(shù)層面顯得尤為重要，并為此花費(fèi)了大量精力和財(cái)力。

對(duì)樣品進(jìn)行分析時(shí)，由于分析物的化學(xué)性質(zhì)不同、基質(zhì)復(fù)雜、分析濃度較低，必須對(duì)樣品進(jìn)行前處理，而土壤成分復(fù)雜，用藥史不確定性高，所以確定土壤前處理的方法更加重要[3]。QuEChERS技術(shù)是2003年由美國(guó)化學(xué)家Steven J.Lehotay和德國(guó)的Michelangelo Anastassiadas提出的一種分散固相萃取樣品處理方法，該技術(shù)的特點(diǎn)是快速、簡(jiǎn)單、低成本、高通量，非常適合多殘留檢測(cè)[4-7]。

液相色譜串聯(lián)四級(jí)桿質(zhì)譜是痕量有機(jī)物檢測(cè)中的常用方法[8-12]，但此方法必須依賴目標(biāo)化合物的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)對(duì)儀器方法進(jìn)行優(yōu)化，在多殘留檢測(cè)和未知化合物分析中的應(yīng)用受到限制。軌道阱高分辨質(zhì)譜儀具有較高的分辨率、掃描速度和靈敏度，可以實(shí)現(xiàn)高通量的目標(biāo)物或非目標(biāo)物篩選和高可靠性的確證定量分析[13-15]。本研究利用Exactive液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)，借助QuEChERS技術(shù)對(duì)樣品進(jìn)行前處理，建立了土壤中百余種常見(jiàn)農(nóng)藥殘留的同時(shí)分析方法。

2 材料與方法

2.1 材料

2.1.1 儀器

靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀：Exactive，Thermofisher；液相色譜儀：U-3000，Thermo；萬(wàn)分之一天平：AE163，Mettler；均質(zhì)器：T25，IKA；振蕩器：MS1，IKA；離心機(jī)：5810R，Eppendorf；氮吹儀：N-EVAP-111，Organomation。

2.1.2 試劑

乙睛、甲醇、甲酸：均為色譜純，購(gòu)于美國(guó)Fisher公司；水：Milli-Q超純水，使用前過(guò)0.45 μm濾膜；氯化鈉、二甲基十八碳硅烷粉（ODS）：均為分析純，購(gòu)于Agela Technologies公司；239種農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（表1）：購(gòu)于德國(guó) Dr．Ehrenstorfer公司、美國(guó) Chemservice公司、德國(guó)Fluka公司等。

2.1.3 試驗(yàn)樣品

土壤樣品采用隨機(jī)多點(diǎn)取樣法在每一基地分別選取5-10個(gè)取樣點(diǎn)，采集耕層土壤（0-20 cm），混勻，放置于樣品袋中。土壤在室溫下風(fēng)干，除去植物殘根，過(guò)60目篩，于室溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 方法

2.2.1 農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液：按照農(nóng)藥性質(zhì)，將其分為有機(jī)磷類、有機(jī)氯類、有機(jī)氮類、氨基甲酸酯類、除草劑類5種，分別量取100mg/L的農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液各3mL，依次添加、蒸干后用甲醇定容為30mL，得到10mg/L的混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，于-18℃避光密封儲(chǔ)存（有效期3個(gè)月）。

基質(zhì)混合農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)液：用土壤空白提取液配制系列濃度基質(zhì)混合標(biāo)準(zhǔn)液，用于基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測(cè)定。

2.2.2 樣品前處理

稱取10.0g（精確至0.01g）土壤樣品，放入50mL離心管中，加入20mL乙腈均質(zhì)提取1min，10 000 rpm離心10min；取2.5mL上清液至10mL離心管中，加入200mg ODS粉，渦混1min；沉淀后取2mL上清液40℃氮?dú)獯蹈?，加?mL甲醇0.1%甲酸水（3+7）溶液溶解準(zhǔn)備上機(jī)檢測(cè)。

2.2.3 液相色譜質(zhì)譜條件

2.2.3.1 液相色譜條件

色譜柱：ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0×100 mm，1.8 μm）；柱溫：40℃；流速：0.3mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：A-0.1%甲酸水，B-甲醇；梯度洗脫程序：5%B 保持 1.0min，1.0→8.0min由 5%B→98%B，8.0→12.0min 98%B，12.0→12.5min 5%B， 平衡2min。

2.2.3.2 質(zhì)譜條件

全掃描正離子模式（質(zhì)量范圍100到1 500）；分辨率：50 000；掃描速度：4 Hz；自動(dòng)增益控制（AGC）目標(biāo)值：10e6；噴霧電壓：2 200 V；離子傳輸管溫度：280°C；鞘氣氣壓：32 au；輔助氣壓：10 au；離子源溫度：200°C。

3 結(jié)果與討論

3.1 MS條件優(yōu)化

高分辨質(zhì)譜儀不需要對(duì)質(zhì)譜條件進(jìn)行特殊優(yōu)化，可以采用通用質(zhì)譜條件，只需調(diào)整掃描質(zhì)量范圍即可。化合物篩選離子提取誤差范圍為5 ppm。需要考慮的是部分農(nóng)藥屬于小分子物質(zhì)，受熱易分解，因此離子傳輸管溫度和氣化室溫度在滿足傳輸效率和霧化效果的前提下適當(dāng)降低，避免化合物受熱分解導(dǎo)致響應(yīng)值較低。

3.2 UPLC條件優(yōu)化

3.2.1 液相色譜柱的選擇

在色譜柱分離速度和靈敏度方面，選用粒徑1.8 μm填料的色譜柱。使用標(biāo)準(zhǔn)工作液對(duì)色譜柱進(jìn)樣分離得到色譜圖，分離效果和靈敏度較好。這是由于柱填料粒徑由5 μm縮小到1.8 μm，單位體積內(nèi)的表面積大大增加，使柱效顯著提高。超高效液相色譜柱具有極高的柱效和分離速度，使用0.3-0.4mL/min的柱流速與電噴霧離子化方式所要求的流速具有良好的匹配。

液相色譜串聯(lián)高分辨質(zhì)譜檢測(cè)，保留時(shí)間是定性很重要的一個(gè)因素。由于是多殘留分析，故采用100 mm的長(zhǎng)柱，達(dá)到將所有化合物進(jìn)行有效分離，降低基質(zhì)效應(yīng)影響的目的。

3.2.2 流動(dòng)相的選擇

液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)應(yīng)用中，流動(dòng)相的選擇除考慮色譜系統(tǒng)分離效果外，還必須關(guān)注分離各組分進(jìn)質(zhì)譜前的離子化效率，以獲得最佳的分辨率和靈敏度。在對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行質(zhì)譜全掃描中發(fā)現(xiàn)：分別選用甲醇/水、乙腈/水、甲醇/0.1%甲酸水溶液、乙腈/0.1%甲酸水溶液作為流動(dòng)相，在電噴霧源ESI+方式下，在乙腈/0.1%甲酸水和甲醇/0.1%甲酸水溶液溶液組成的流動(dòng)相中，離子化效率優(yōu)于其他試劑。在比較乙腈/0.1%甲酸水和甲醇/0.1%甲酸水兩種溶液時(shí)發(fā)現(xiàn)，由于乙腈極性較高，在離子源部分和水溶液霧化后形成包裹層，導(dǎo)致電離效果差，部分目標(biāo)物響應(yīng)值低；甲醇極性較低，不容易形成包裹層，目標(biāo)物響應(yīng)值得到提高。因此選擇甲醇/0.1%甲酸水作為流動(dòng)相。

本研究涉及的是百余種農(nóng)藥的篩查與定量，故采用較長(zhǎng)的洗脫時(shí)間和較為溫和的梯度洗脫條件，以期盡量將所有化合物進(jìn)行有效分離。

3.3 線性范圍、定量限、回收率和精密度

用基質(zhì)提取液配制一系列不同濃度的農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次進(jìn)樣，以峰面積為縱軸，濃度為橫軸制作校準(zhǔn)曲線，由工作站可直接計(jì)算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，分析物在2.0-100 μg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均小于0.99。

用加標(biāo)方法進(jìn)行回收率和精密度實(shí)驗(yàn)（加標(biāo)濃度分別為 5、10、20 μg/kg），平行測(cè)定 6 次，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，結(jié)果見(jiàn)表1。從表1可以看出，平均回收率均為68.7%-101.8%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均小于11.6%。

表1 農(nóng)藥的分子式、檢測(cè)離子、平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差及保留時(shí)間

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

（續(xù)表1）

3.4 Orbitrap快速篩查技術(shù)流程

數(shù)據(jù)處理在ExactFinder軟件上按照定性和定量工作流程進(jìn)行，樣品都進(jìn)行目標(biāo)物和非目標(biāo)物篩選，以準(zhǔn)確的質(zhì)量數(shù)和保留時(shí)間做為目標(biāo)篩選的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，鑒定出的分析物通過(guò)將給出的元素組成與測(cè)定信號(hào)的同位素模式進(jìn)行自動(dòng)匹配實(shí)現(xiàn)驗(yàn)證，所有的信號(hào)和元素組成按照預(yù)定義的元素列表上的同位素分布計(jì)算。最后，在分辨率達(dá)到50 000的情況下獲得的數(shù)據(jù)降低了同質(zhì)量數(shù)干擾物共洗脫的可能性，從而減少了假陽(yáng)性的可能性。

3.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

隨機(jī)對(duì)某地大棚的7份土壤樣品進(jìn)行檢測(cè)，7份樣品中全部檢出啶蟲(chóng)咪、噻嗪酮、精甲霜靈等3種農(nóng)藥，3種農(nóng)藥的高分辨質(zhì)譜總離子及提取離子流譜見(jiàn)圖1，含量見(jiàn)表2。結(jié)果顯示，上述3種農(nóng)藥的應(yīng)用比較普遍，并且經(jīng)過(guò)近幾年的過(guò)度種植，土壤農(nóng)藥殘留的問(wèn)題比較嚴(yán)重。

圖1 檢出樣品的高分辨質(zhì)譜總離子及提取離子流譜圖

表2 7份土壤樣品中3種檢出農(nóng)藥的含量

4 結(jié)論

本研究運(yùn)用QuEChERS技術(shù)進(jìn)行提取和凈化，借助靜電場(chǎng)軌道阱高分辨質(zhì)譜儀分辨率、出色的質(zhì)量精度、高靈敏度和寬動(dòng)態(tài)范圍等特點(diǎn)對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，建立土壤中上百種農(nóng)藥殘留同時(shí)檢測(cè)的方法。該方法簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確、靈敏度高，適合于蔬菜大棚土壤中農(nóng)藥殘留的高通量檢測(cè)。

[1]Lesueur C，Gartner M，Mentler A，et al.Comparison of four extraction methods for the analysis of 24 pesticides in soil samples with gas chromatographymass spectrometry and liquid chromatography-ion trapmass spectrometry[J].Talanta，2008，75（1）：284-293.

[2]Abhilash P C，Singh N.Pesticide use and application：an Indian scenario[J].J Hazard Mater，2009，165：1-12.

[3]Yolanda P，Monica F，Ruiz M J，et al.Current trends in solidphase-based extraction techniques for the determination of pesticides in food and environment[J].J Biochem Biophys Methods，2007，70：117-131.

[4]董靜，潘玉香，朱莉萍，等.果蔬中54種農(nóng)藥殘留的QuEchERS/GC-MS 快速分析[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2008，27（1）：66-69.

[5]Michelangelo Anastassiades，Steven J Lehotay，Darinka Stajnbaher，et al.Fast and Easy Multiresidue Method Employing AcetonitrileExtraction/Partitioningand ‘Dispersive Solid-Phase Extraction’for the Determination of Pesticide Residues in Produce[J].Journal of AOAC INTERNATIONAL，2003，86：412.

[6]Steven J Lehotay.Quick，Easy，Cheap，Effective，Rugged and Safe（QuEchERS）Approach for Determining Pesticide Residues[J].Methods in Biotechnology，2004，11：6-23.

[7]宮小明，董靜，孫軍，等.分析測(cè)試學(xué)報(bào) [J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2010，29（9）：933-937.

[8]Fux E，Mcmillan D，Bire R，et al.Development of an ultra-performance liquid chromatography-mass spectrometry method for the detection of lipophilic marine toxins[J].J Chromatogr A，2007，1157（1-2）：273-280.

[9]Gerssen A，Mulder P P J，McElhinney M A，et al.Liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for the detection of marine lipophilic toxins under alkaline conditions[J].J Chromatogr A，2009，1216（9）：1421-1430.

[10]Krock B，Tillmann U，John U.LC-MS-MS aboard ship：tandem mass spectrometry in the search for phycotoxins and novel toxigenic plankton from the North Sea[J].Anal Bioanal Chem，2008，392（5）：797-803.

[11]Gerssen A，Van Olst E H W，Mulder P P J，et al.In-house validation of a liquid chromatography tandem mass spectrometry method for the analysis of lipophilic marine toxins in shellfish using matrix-matched calibration [J].AnalBioanalChem，2010，397（7）：3079-3088.

[12]羅輝泰，黃曉蘭，吳惠勤，等.QuEChERS/液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時(shí)測(cè)定魚(yú)肉中30種激素類及氯霉素類藥物殘留 [J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2011，30（12）：1329-1337.

[13]Krauss M，Singer H，Hollender J.LC-high resolution MS in environmental analysis：from target screening to the identification of unknowns[J].Anal Bioanal Chem，2010，397（3）：943-951.

[14]Kellmann M，Muenster H，Zomer P，et al.Full scan MS in comprehensive qualitative and quantitative residue analysis in food and feed matrices：How much resolving power is required[J].J Am Soc Mass Spectrom，2009，20（8）：1464-1476.

[15]宮小明，萬(wàn)進(jìn)，馬榮檜，等.液相色譜-高分辨質(zhì)譜測(cè)定貝類中的4種貝毒素及16種獸藥殘留 [J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2014，33（8）：881-886.

Determination of Pesticide Residues in Vegetable Greenhouse Soil by UPLC-HR-MS and QuEChERS

GONG Xiaoming1，2，WANG Hongtao1， HUA Mengmeng1，WANG Ling2
（1.Weifang Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Weifang， Shandong， 261041；2.Weifang Medical University）

A rapid analytical method for simultaneous determination of hundreds of pesticide residues in soil was established based on QuEChERS with ultraperformance liquid chromatography-high-resolution mass spectrometry（UPLC-HR-MS）.The sample was extracted with acetonitrile（containing 2%formic acid）and purified by votexing with ODS.The extractions were separated by a Agilent ZORBAX SB-C18 column（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）before submitting for detection by high-resolution mass spectrometry.The results showed that a good linearity ranged from 0.01-1.0mg/L was obtained and correlation coefficient was higher than 0.99.The average recoveries ranged from 68.7%-101.8%and the relative standard deviations and from 6.2%-14.1%at the concentrations of 0.01mg/kg respectively，the limits of quantification（LOQ）were all below to 0.005mg/kg.The proposed method was accurate，rapid and reliable，which can be successfully applied to the high-throughputanalysisofpesticide residuesin vegetable greenhouse soil.

Soil；Pesticide Residues；Liquid Chromatography High Resolution Mass Spectrometry；QuEChERS

O657.63；S481.8

E-mail：9647125@qq.com

國(guó)家質(zhì)檢總局科技計(jì)劃項(xiàng)目（2013IK177）

2016-12-19