高劑量pSin慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞影響的研究

黃乙涓黃強(qiáng)呂歐

高劑量pSin慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞影響的研究

黃乙涓1黃強(qiáng)2呂歐3

目的研究慢病毒載體pSin介導(dǎo)的基因修飾后的誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（iPS），細(xì)胞形態(tài)和傳代的影響。方法通過(guò)包裝慢病毒pSin-GFP感染iPS，分為實(shí)驗(yàn)組（細(xì)胞與病毒滴度比例1 ： 200）和對(duì)照組（細(xì)胞與病毒滴度比例1 ： 1）感染人iPS，經(jīng)過(guò)嘌呤霉素藥物篩選獲得單克隆，重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化記錄細(xì)胞每代克隆數(shù)，采用方差分析及t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)結(jié)果，用免疫熒光和werstern檢測(cè)iPS標(biāo)志蛋白表達(dá)。結(jié)果pSin-GFP病毒感染iPS后挑取24個(gè)單克隆細(xì)胞株，傳十代后實(shí)驗(yàn)組（4.67±0.33）明顯少于對(duì)照組（16.00±0.58）的細(xì)胞克隆數(shù)（t =17.00，P ＜ 0.01），實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞狀態(tài)穩(wěn)定并正常表達(dá) Oct-4、Sox2、SSEA-1、Nanog和Tra-1-60。結(jié)論使用1 ： 200的高比例慢病毒載體pSin介導(dǎo)的基因修飾后的iPS可傳代次數(shù)減少，形態(tài)學(xué)并未發(fā)生變化，其正常表達(dá)的干細(xì)胞標(biāo)志性蛋白。

多能干細(xì)胞； 慢病毒屬； 基因修飾

日本學(xué)者2006年發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)導(dǎo)入外源性的幾個(gè)因子將已分化的體細(xì)胞重編程使其回到原始狀態(tài)表現(xiàn)出胚胎干細(xì)胞的特性[1]，而這幾個(gè)因子分別是Oct4、Sox2、c-Myc和Klf4這種通過(guò)使用慢病毒介導(dǎo)的重編程作用使得體細(xì)胞表現(xiàn)出胚胎細(xì)胞特性，并被賦予一個(gè)新的名字—誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞（induced pluripotent stem cells，iPS）。至從該研究發(fā)表在《細(xì)胞》雜志上后，許多科學(xué)家投入研究該細(xì)胞。

在后面的研究中，我國(guó)科學(xué)家成功將來(lái)源人體細(xì)胞的iPS細(xì)胞分化成為胰島細(xì)胞[2-3]，并且該細(xì)胞經(jīng)過(guò)驗(yàn)證可以成功分泌胰島素[4]，在接下來(lái)的研究中該小組又將人iPS細(xì)胞成功分化為肝細(xì)胞[5]為了今后干細(xì)胞用于治療提供了實(shí)踐依據(jù)。Wernig等[6]利用帕金森病的動(dòng)物疾病模型表明，從小鼠的誘導(dǎo)多能性細(xì)胞分化成的多巴胺能神經(jīng)元可以整合到宿主大腦并改善與帕金森病的癥狀相似的小鼠。同時(shí)，通過(guò)基因修飾后的iPS細(xì)胞也同樣用于后續(xù)的研究和治療中。

常用的基因修飾方法是病毒轉(zhuǎn)染，許多病毒可以高效的將自身基因整合到宿主基因中，并且有效的將宿主細(xì)胞變成復(fù)制病毒的工廠。慢病毒可以感染分裂期的細(xì)胞或者靜止期的細(xì)胞，并且其感染干細(xì)胞的效率也高于常用的逆轉(zhuǎn)錄病毒，其成為構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的主要轉(zhuǎn)染工具，其已經(jīng)安全的使用于哺乳動(dòng)物的基因調(diào)控研究，目前常用構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的病毒為慢病毒。因此有許多實(shí)驗(yàn)中使用慢病毒與iPS細(xì)胞結(jié)合，使其過(guò)表達(dá)某一特定基因，用于治療神經(jīng)系統(tǒng)或者消化系統(tǒng)疾病等，常用的慢病毒載體攜帶自身結(jié)構(gòu)基因，但慢病毒自身結(jié)構(gòu)基因插入iPS細(xì)胞后對(duì)該細(xì)胞的生長(zhǎng)影響卻鮮有報(bào)道，并且使用過(guò)量的慢病毒感染干細(xì)胞是否對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)狀態(tài)或者代數(shù)有影響也未見(jiàn)報(bào)道。本文就此問(wèn)題進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)研究。

材料與方法

一、材料

1.主要設(shè)備：超速離心機(jī)（美國(guó)Beckman公司），化學(xué)發(fā)光成像儀（美國(guó)Beckman公司），熒光倒置顯微鏡（美國(guó)蔡式公司），離心機(jī)（美國(guó)Eppendorf公司），流式細(xì)胞儀C6（美國(guó)BD公司）。

2.主要的試劑和材料：iPS（賽業(yè)公司），293T細(xì)胞（美國(guó) ATCC 公司），Jurkat細(xì)胞（美國(guó) ATCC公 司），lipofectamine 3000（美 國(guó) Invitrogen 公司），DMEM Basic培養(yǎng)基（美國(guó) Invitrogen公司），mTeSR1干細(xì)胞培養(yǎng)基（加拿大干細(xì)胞公司），胎牛血清（FBS）（美國(guó)Invitrogen公司），胰蛋白酶（美國(guó)Invitrogen公司），二甲基亞砜（美國(guó)Invitrogen公司），Matrigel（美國(guó) BD 公司），Oct-4A（C30A3）Rabbit mAb（美 國(guó) CST 公 司）、Sox2（D6D9）XP Rabbit mAb（美國(guó) CST公司）、anti-GAPDH（美國(guó) CST公司）。本實(shí)驗(yàn)所用一抗均購(gòu)于美國(guó)CST公司，熒光標(biāo)記二抗購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。

二、方法

1. iPS的培養(yǎng)：本實(shí)驗(yàn)使用的iPS來(lái)源于人皮膚的成纖維上皮細(xì)胞，已傳14代。使用mTeSR1人胚胎干細(xì)胞完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，復(fù)蘇后隔天換液培養(yǎng)3 ～ 4 d，待細(xì)胞克隆后成為肉眼可見(jiàn)的克隆后，使用1 ml槍頭輕輕劃田字把較大的細(xì)胞克隆分散成小克隆后吸取到鋪有30%的Matrigel的細(xì)胞皿中，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每天換液。

2.慢病毒包裝：復(fù)蘇293T細(xì)胞，并傳代培養(yǎng)2 ～ 4代后用于病毒包裝。293T細(xì)胞傳代之前，先明膠包被數(shù)個(gè)10 cm的大培養(yǎng)皿。包裝病毒的前1天，傳代293T細(xì)胞。5×106個(gè)細(xì)胞接種到10 cm的大培養(yǎng)皿中。按照這樣的起始接種密度，在包裝病毒當(dāng)天，細(xì)胞可以達(dá)到90%～ 95%融合。每個(gè)皿使用 10 μg 的 pSin-EF2-GFP-puro 質(zhì)粒 15 μg psPAX2質(zhì)粒、10 μg pMD2.G 質(zhì)粒，與 P3000，顛倒混勻，RT溫浴5min將溫浴好的lipofectamine 3 000、DNA的混合液體，逐滴加入10 cm的培養(yǎng)皿。12 ～ 20 h后換液，從換液后開(kāi)始計(jì)時(shí)，在36 h和48 h兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)，收集病毒上清液高速離心后用100 μl PBS重懸病毒顆粒，存于-80℃。

3.慢病毒滴度計(jì)算：將生長(zhǎng)狀態(tài)良好的Jurkat細(xì)胞接種于6孔板，每孔細(xì)胞為5×104個(gè)。將濃縮病毒液稀釋200倍，在3個(gè)培養(yǎng)孔中分別加入0.5，5，50 μl的稀釋病毒，感染48 h后用流式計(jì)數(shù)每孔細(xì)胞熒光數(shù)計(jì)算病毒滴度。滴度（integration units per ml，IU ml-1）的計(jì)算公式如下 ：IU ml-1=（C × D×1 000）/V；其中：C=平均每孔熒光細(xì)胞占總細(xì)胞數(shù)比例；N=感染時(shí)細(xì)胞的數(shù)目（為1×105）D =病毒載體的稀釋倍數(shù)；V =加入的稀釋病毒的體積數(shù)。

4.慢病毒感染和單克隆細(xì)胞株培養(yǎng)：六孔培養(yǎng)板，每孔1×104個(gè)iPSCs接種過(guò)夜，分為3個(gè)組。實(shí)驗(yàn)組以細(xì)胞與病毒滴度比例1 ： 200的高劑量加入1×106病毒液，對(duì)照組按照1 ： 1的比例將正常量的細(xì)胞與病毒滴度加入1×104病毒液感染iPSCs，同時(shí)設(shè)置陰性對(duì)照組在細(xì)胞中加入等量PBS。感染細(xì)胞24 h后換液，48 h后加入puromysin篩選，48 h后停止藥篩。傳一代后精確計(jì)算細(xì)胞數(shù)量，用培養(yǎng)基稀釋配制成0.005 ～ 0.02個(gè)/μl的細(xì)胞懸液，每孔取100 μl均勻分配至96孔板中，待細(xì)胞生長(zhǎng)為單克隆后繼續(xù)傳代。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，記錄每代細(xì)胞的克隆數(shù)量。

5.流式細(xì)胞儀檢測(cè)iPS細(xì)胞熒光表達(dá)情況：用膠原酶Ⅳ消化細(xì)胞，離心后用PBS潤(rùn)洗2次，最后重懸于PBS中。取空白組作為對(duì)照，實(shí)驗(yàn)組上機(jī)檢測(cè)GFP表達(dá)量。

6. werstern檢測(cè)蛋白表達(dá)情況：收集對(duì)數(shù)期的細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)節(jié)至200 000個(gè)/ml，將細(xì)胞稀釋液接種到 12孔板中，每孔 1 ml，37 ℃、5%CO2條件下培養(yǎng)過(guò)夜；用PBS潤(rùn)洗2次后每孔加入 200 μl預(yù)先配制好的含SDS上樣緩沖液和含苯甲基磺酰氟（Phenylmethanesulfonyl fl uoride，PMSF）的 RIPA 裂解液（RIPA lysis buffer）；在細(xì)胞充分裂解后，98 ℃水浴10 min；用煮過(guò)的蛋白樣品跑蛋白電泳（8%蛋白膠濃度）；電泳后將含目標(biāo)蛋白的膠切下，進(jìn)行轉(zhuǎn)膜（90 V，90 min）；轉(zhuǎn)完膜后，將膜用5%脫脂牛奶（溶于TBST）于室溫下封閉1 h；將封閉完的膜用一抗于室溫孵育1 h[Oct-4A（C30A3）Rabbit mAb、Sox2（D6D9）XP Rabbit mAb、anti-β-Tubulin]；用 TBST 將膜在室溫下潤(rùn)洗3次，每次5 min；將膜用二抗于室溫下孵育1 h（anti-rabbit IgG，HRP-linked antibody），用 TBST 將膜在室溫下潤(rùn)洗3次，每次5 min，然后在化學(xué)發(fā)光液的作用下用化學(xué)發(fā)光成像儀進(jìn)行顯色。

7.免疫熒光染色鑒定iPS細(xì)胞系的多能性：將iPSCs正常傳代后，用4%甲醛固定30 min，PBS清洗3次后，用0.2% Triton X-100透化5 min。使用一抗（用1%BSA稀釋?zhuān)┓忾]，于4 ℃過(guò)夜；PBS洗3 遍后，用熒光二抗（1：500 稀釋?zhuān)?7 ℃避光放置 1 h，再PBS洗3遍，每遍5 min。最后用熒光倒置顯微鏡進(jìn)行熒光照相。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件，SUVmax數(shù)據(jù)以±s表示。細(xì)胞每代克隆數(shù)實(shí)驗(yàn)組、對(duì)照組與空白組間用ANOVA檢驗(yàn)，細(xì)胞每代克隆數(shù)SUVmax實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組之間比較采用兩樣本t檢驗(yàn)，以P ＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

表1 慢病毒pSin-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞代數(shù)的影響（個(gè)，±s）

表1 慢病毒pSin-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞代數(shù)的影響（個(gè)，±s）

注：F細(xì)胞代數(shù)=1496.0，F(xiàn) = 121.1，F(xiàn)組間交互= 20.65；P均＜ 0.05

細(xì)胞代數(shù)分組10實(shí)驗(yàn)組 24.00±0.00 12.67±0.33 11.00±0.58 9.00±0.58 6.33±0.88 5.33±0.33 4.67±0.33 4.67±0.33 4.67±0.33 4.67±0.33對(duì)照組 24.00±0.00 20.67±0.67 20.67±0.67 19.67±0.33 18.00±1.16 16.67±0.67 16.67±0.67 16.00±0.58 16.00±0.58 16.00±0.58空白組 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 24.00 F值 -- 192.00 64.70 256.00 33.10 1156.00 432.00 289.00 289.00 289.00 P值 -- 0.01 0.02 0.00 0.03 0.00 0.00 0.00 0.00 0.00 1 2 3 4 5 6 7 8 9

結(jié) 果

一、pSin-GFP病毒感染iPS細(xì)胞

用包裝衣殼蛋白的質(zhì)粒pMD2.G和psPAX2連同pSin-GFP都用于病毒包裝，Lipofectamine 3 000、DNA的混合液體加入293T中，實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組病毒感染細(xì)胞后24 h觀察綠色熒光（圖1）。

二、高劑量慢病毒pSin-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞影響

在病毒感染細(xì)胞后挑選得到的單克隆細(xì)胞繼續(xù)傳代，從圖2a可以看到細(xì)胞克隆中高亮的細(xì)胞為凋亡的細(xì)胞，部分克隆凋亡細(xì)胞增多，傳至6 ～ 8代時(shí)多數(shù)克隆全部凋亡，少部分克隆未有完全凋亡可穩(wěn)定傳代，圖2b可見(jiàn)細(xì)胞克隆中高亮細(xì)胞明顯減少，凋亡較少。

三、高劑量慢病毒pSin-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)細(xì)胞代數(shù)的影響

高劑量慢病毒的表達(dá)引起單克隆細(xì)胞株在傳代后凋亡，使用高劑量的慢病毒感染干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組比較高劑量慢病毒對(duì)干細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和傳代次數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P ＜ 0.01）。如表1，從單克隆細(xì)胞株可傳代代數(shù)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在感染病毒的前幾代中細(xì)胞狀態(tài)較好，但是在第3代后慢病毒對(duì)細(xì)胞的影響漸漸表現(xiàn)出來(lái)，引起大部分克隆的凋亡。

四、藥篩過(guò)后iPS細(xì)胞表達(dá)綠色熒光鑒定

藥篩后未感染病毒的iPS細(xì)胞凋亡，為了驗(yàn)證傳代后細(xì)胞仍舊穩(wěn)定表達(dá)綠色熒光，通過(guò)流式檢測(cè)出藥篩后實(shí)驗(yàn)組中有94%的iPS細(xì)胞穩(wěn)定高表達(dá)綠色熒光，空白組iPS細(xì)胞幾乎沒(méi)有綠色熒光的表達(dá)如圖3。

圖1 熒光顯微鏡下觀察兩組pSin-GFP病毒感染24h后iPS細(xì)胞形態(tài)（×100）

圖2倒置顯微鏡下觀察兩組病毒感染24 h后iPS細(xì)胞形態(tài)（×100）

圖3 流式檢測(cè)藥篩后實(shí)驗(yàn)組iPS細(xì)胞綠色熒光表達(dá)量

五、高劑量慢病毒pSin-GFP轉(zhuǎn)染對(duì)iPS細(xì)胞影響werstern和免疫熒光檢測(cè)蛋白表達(dá)情況

為了鑒定高劑量pSin病毒對(duì)細(xì)胞多能性的影響，將使用高劑量病毒轉(zhuǎn)染iPS細(xì)胞組與未使用高劑量病毒轉(zhuǎn)染iPS細(xì)胞組中通過(guò)werstern檢測(cè)Oct-4蛋白和Sox2蛋白表達(dá)情況如圖4所示。通過(guò)免疫熒光檢測(cè)多能性基因SSEA-1和Nanog和Tra-1-60細(xì)胞的表達(dá)情況結(jié)果如圖5所示；實(shí)驗(yàn)組中Oct-4蛋白與空白組中基本一致，Sox2蛋白表達(dá)情況也基本一致，說(shuō)明在傳代穩(wěn)定后細(xì)胞的多能性并未受到影響，并且細(xì)胞形態(tài)與消化傳代時(shí)間也基本一致。

圖4 werstern檢測(cè)Oct-4蛋白和Sox2蛋白表達(dá)情況

圖5 免疫熒光檢測(cè)多能性基因SSEA-1和Nanog和Tra-1-60細(xì)胞的表達(dá)情況

討 論

iPS是通過(guò)體細(xì)胞重編程、去分化在體外誘導(dǎo)得到的，盡管該細(xì)胞目前尚存許多機(jī)制未明，但其優(yōu)勢(shì)和潛能在臨床應(yīng)用前景廣泛。因此許多研究者在將該細(xì)胞的研究關(guān)注其的臨床應(yīng)用。近年來(lái)研究者發(fā)現(xiàn)可用于誘導(dǎo)分化成為iPS細(xì)胞的體細(xì)胞并不局限于某幾種細(xì)胞類(lèi)或者不同階段，例如：肝細(xì)胞[7-8]、胃（腸）上皮細(xì)胞[7-8]、成熟B淋巴細(xì)胞[9]等。三個(gè)胚層來(lái)源的細(xì)胞或者處于不同階段的細(xì)胞都可以通過(guò)添加特定的因子重編程為iPS細(xì)胞[10]。目前研究者用血細(xì)胞（T細(xì)胞和B細(xì)胞等）、脂肪細(xì)胞和皮膚成纖維細(xì)胞重編程為iPS細(xì)胞[10]。

與胚胎干細(xì)胞（embryonic stem cells，ES）相似的iPS細(xì)胞可參與形成機(jī)體所有組織和器官。在過(guò)去幾年的研究中iPS細(xì)胞研究取得了巨大進(jìn)步，同時(shí)iPS細(xì)胞的重編程方法也在不斷改進(jìn)中[11]，其使用于臨床的安全性也在不斷加強(qiáng)[12]；從小分子化合物、miRNA、缺氧條件等的應(yīng)用。iPS細(xì)胞研究不僅具有重要理論意義,而且在對(duì)于基因修飾后的iPS細(xì)胞可以直接應(yīng)用在再生醫(yī)學(xué)、組織工程和藥物發(fā)現(xiàn)與評(píng)價(jià)等方面，但是就目前研究的關(guān)于慢病毒對(duì)于iPS細(xì)胞影響的文獻(xiàn)較少。

首次成功的臨床應(yīng)用是用病毒治療兒童的嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷疾病-X1[13]。在后來(lái)幾例治療中都因?yàn)椴《镜亩拘宰饔枚够颊呋忌习籽?。?duì)于逆轉(zhuǎn)錄病毒上調(diào)的誘變引起的惡性腫瘤已經(jīng)被證實(shí)并且成為了使用病毒的重要關(guān)注點(diǎn)[14-17]。在2007年有科學(xué)家證實(shí)慢病毒在介導(dǎo)基因插入靶細(xì)胞是引發(fā)大約病毒的插入誘變的主要原因，并且這些誘變的位點(diǎn)都集中在原癌基因和生長(zhǎng)控制的基因上[18]。該團(tuán)隊(duì)證實(shí)慢病毒的介導(dǎo)基因插入靶細(xì)胞的插入誘變?yōu)?%，而且插入位點(diǎn)的熱點(diǎn)并不全都是集中在影響原癌基因和生長(zhǎng)控制的基因位點(diǎn)上的。在動(dòng)物骨髓細(xì)胞[19]和肝細(xì)胞[20]的研究中，慢病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)導(dǎo)位點(diǎn)也并非都集中在與生長(zhǎng)相關(guān)的基因座中。并且在慢病毒的感染過(guò)程中并沒(méi)有看到細(xì)胞有呈單克隆的擴(kuò)增狀態(tài)[19-20]。因此慢病毒成為基因修飾常用的工具和手段，但是其安全性少有研究。

本文針對(duì)這個(gè)問(wèn)題利用高劑量慢病毒感染iPS細(xì)胞，并且發(fā)現(xiàn)慢病毒載體對(duì)細(xì)胞有一定的毒性。以1：1的正常劑量感染iPS細(xì)胞未引起細(xì)胞大量凋亡，如果以高劑量1：200的量感染細(xì)胞慢病毒對(duì)iPS細(xì)胞的影響十分明顯，因此考慮到Psin載體在介導(dǎo)目的基因整合到iPS細(xì)胞中同時(shí)病毒自身的片段也會(huì)整合到細(xì)胞當(dāng)中，而這部分基因?qū)PS細(xì)胞生長(zhǎng)的影響和傳代穩(wěn)定性一直未有報(bào)道。本文就此進(jìn)行了初步的研究，在傳代十代時(shí)細(xì)胞性質(zhì)趨于穩(wěn)定，并且通過(guò)werstern和免疫熒光的檢測(cè)，穩(wěn)定傳代后的細(xì)胞特性未有變化并且其攜帶的目的基因也可以正常穩(wěn)定的表達(dá)。因此對(duì)于基因修飾后的iPS細(xì)胞生物學(xué)性質(zhì)的研究應(yīng)該在十代之后，待細(xì)胞穩(wěn)定傳代后進(jìn)行。iPS細(xì)胞成為現(xiàn)在的研究熱點(diǎn)，雖然目前仍有許多問(wèn)題需要去解決，但是在未來(lái)其必可為人類(lèi)疾病治療翻開(kāi)新的篇章。

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Effect of high dose pSin lentiviral vector-mediated transfection on pluripotent stem cells

Huang Yijuan1, Huang Qiang2, Lyu Qu3.
1Department of immunology,Sun Yat-sen University Zhongshan School of Medicine, Guangzhou 51000 China;2State Intellectual Property Office Patent Office Patent Examination Cooperation Guangdong Center, Guangzhou 51000, China;3Guangzhou Runcheng Chemical Materials Limited Company,Guangzhou 51000,China

Lyu Ou, Email: 441823577@qq.com

ObjectiveTo study the effect of lentiviral vector pSin-mediated gene modification on pluripotent stem cell lines.MethodsThe lentivirus pSin-GFP was packaged, iPS cells were divided into experimental group（cell and virus titer ratio 1 ： 200）and control group（cell and virus titer ratio 1 ： 1）and infected with virus. Stem cells were harvested and the single cell clones were obtained by limit dilution method. The cell clones after infection was calculated by subculture and pluripotent stem cell markers were detected by Western blot and immunofluorescence staining.The results were analyzed by variance analysis and t test.ResultsTwenty-four monoclonal cell lines were selected after 10 generations. Cell cloning number of the experimental group（4.67±0.33）was significantly fewer than that of the control group（16.00±0.58）（t =17.00，P ＜ 0.01）. Stable passaged cells expressed Oct-4, Sox2, Nanog, SSEA-1 and Tra-1-60.ConclusionAfter genetic modification, the proliferation potential of iPS decreases, but their morphology is not changed and they express common stem cell markers.

Pluripotent stem cells; Lentivirus； Genetically modified

2016-12-30）

（本文編輯：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2017.03.001

510080 廣州，中山大學(xué)中山醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)系1；510630 廣州，中山大學(xué)附屬第三醫(yī)院肝臟外科暨肝移植中心 中山大學(xué)器官移植研究所 廣東省器官移植研究中心2；510535 廣州，國(guó)家知識(shí)產(chǎn)權(quán)局專(zhuān)利局專(zhuān)利審查協(xié)作廣東中心3

張英才，Email：76207884@qq.com

黃乙涓，葉林森，唐暉，等.高劑量pSin慢病毒載體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染對(duì)誘導(dǎo)性多能干細(xì)胞影響的研究[J/CD].中華細(xì)胞與干細(xì)胞雜志（電子版），2017，7（3）：125-130.