離子色譜法測定水產(chǎn)加工制品中多聚磷酸鹽含量

常家琪，梅光明，張小軍，韓程程，高學(xué)慧,3

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；3.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022）

離子色譜法測定水產(chǎn)加工制品中多聚磷酸鹽含量

常家琪1,2，梅光明2，張小軍2，韓程程1,2，高學(xué)慧2,3

（1.浙江海洋大學(xué)食品與醫(yī)藥學(xué)院，浙江舟山 316022；2.浙江省海洋水產(chǎn)研究所，浙江舟山 316021；3.浙江海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，浙江舟山 316022）

建立了水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的離子色譜測定方法。對萃取溫度、提取液pH值以及色譜條件進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，5 種多聚磷酸鹽（磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽、三偏磷酸鹽及六偏磷酸鹽）分別在 0.1～100、0.2～50、0.1～60、0.3～40、0.5～100 mg/L質(zhì)量濃度范圍內(nèi)組分含量與峰面積呈線性相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為0.999 2～0.999 8，檢出限為0.5～3.0 mg/kg；定量限為2.0～5.0 mg/kg。水產(chǎn)加工制品中5種多聚磷酸鹽不同濃度加標(biāo)水平（50、100、200 μg/kg）時，回收率為80.2～100.3%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSDs）小于9%。該方法簡便、快速、選擇性好、準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好，可作為測定水產(chǎn)加工制品中多聚磷酸鹽含量的一種理想方法。

離子色譜法；多聚磷酸鹽；水產(chǎn)品；測定方法

多聚磷酸鹽是世界各國應(yīng)用最多的食品添加劑之一，作為重要的食品配料和功能添加劑廣泛應(yīng)用于水果、蔬菜、調(diào)味料、水產(chǎn)品等各類食品的加工過程中，對食品品質(zhì)的改良起著重要作用[1]。多聚磷酸鹽類主要以正磷酸鹽、焦磷酸鹽、三聚磷酸鹽、三偏磷酸鹽以及六偏磷酸鹽等多種形式存在。在水產(chǎn)品加工過程中，它能夠提高水產(chǎn)品的保水性，增強其水分的穩(wěn)定性，減少營養(yǎng)成分的損失，在不影響水產(chǎn)品品質(zhì)的前提下降低成本，是一種高效水產(chǎn)品添加劑[2-4]。但磷酸鹽攝入量過多時會引發(fā)人體內(nèi)鈣、磷比例失調(diào)，導(dǎo)致發(fā)育遲緩、骨質(zhì)疏松、肝臟功能受損[5-6]，其降解產(chǎn)物增大心血管疾病的患病率[7]等。因此許多國家對水品中多聚磷酸鹽的使用也是有著明確的規(guī)定[8]。其中我國國家標(biāo)準(zhǔn)GB2760-2014規(guī)定冷凍水產(chǎn)品和冷凍魚糜制品中以磷酸根計量，磷酸鹽含量不得超過5.0 g/kg[9]，歐盟要求水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽的含量不得超過0.5 g/kg[22]，美國規(guī)定最終產(chǎn)品中磷酸鹽的殘留量不得超過0.5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）。目前水產(chǎn)品中多聚磷酸鹽含量測定的方法主要有分光光度法[10-12]、薄層層析色譜法[13]、核磁共振法[14]、離子色譜法[15-21]等。其中分光光度法不能確定多聚磷酸鹽的種類；薄層層析色譜法靈敏度低且不能準(zhǔn)確定量，不能滿足檢測需求；核磁共振法均因操作過程繁瑣、對檢測人員要求較高等原因，不能廣泛地應(yīng)用到食品分析中[22]。我國現(xiàn)行國家標(biāo)準(zhǔn)GB5009.256-2016規(guī)定食品中多聚磷酸鹽的測定采用離子色譜法[23]。本實驗采用離子色譜法對不同形態(tài)的多聚磷酸鹽同時進(jìn)行進(jìn)行測定，優(yōu)化了樣品前處理條件和色譜條件，取得了滿意的效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 試驗材料

試驗使用的實際測定樣品（墨魚丸、蝦丸、日本黃姑魚丸）均購于浙江舟山水產(chǎn)品零售市場，經(jīng)高速組織搗碎機均勻搗碎后作為待檢樣品。

1.1.2 試劑

氫氧化鈉、氫氧化鉀均分析純，甲醇為色譜純，實驗用水為GB/T 6682-2008規(guī)定的一級水。

磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L），焦磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液（1 000 mg/L），六偏磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液，美國sigmaaldrich公司；三偏磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，濟南光輝化工有限公司；三聚磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品，純度≥98%，吳江市今朝化工科技有限公司。

10 mmol/L NaoH溶液：準(zhǔn)確稱取0.4 g氫氧化鈉，溶于水并稀釋定容至1 000 mL。50 mmol/L NaoH溶液：準(zhǔn)確稱取2.0 g氫氧化鈉，溶于水并稀釋定容至1 000 mL。

磷酸根、焦磷酸根和六偏磷酸根標(biāo)準(zhǔn)中間液（100 mg/L）：分別準(zhǔn)確吸取磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液17.3 mL、焦磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液15.3 mL和六偏磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液12.9 mL于100 mL的容量瓶中，用10 mmol/L氫氧化鈉溶液定容至刻度線，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

三偏磷酸根和三聚磷酸根標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1 000 mg/L）：分別準(zhǔn)確稱取干燥4 h（80℃）后的三偏磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品0.132 g，三聚磷酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品0.148 g，用10 mmol/L氫氧化鈉溶液稀釋至100 mL，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 儀器和設(shè)備

ICS-3000離子色譜儀（配電導(dǎo)檢測器），美國Dionex公司；IKA T18基本型組織搗碎機，德國IKA公司；AL204型電子天平，瑞士梅特勒-托利多儀器有限公司；SL-502N型臺式天平，上海華巖設(shè)備儀器有限公司；Centrifuge 5810臺式高速離心機，德國Eppendorf公司；超聲波清洗機，杭州法蘭特超聲波科技有限公司；漩渦振蕩器，德國IKA公司；OnGuardⅡRP小柱（1.0 mL），美國Dionex公司，使用前依次用10 mL甲醇、15 mL水通過，靜置活化30 min。

1.3試驗方法

1.3.1 樣品提取

稱取2.500 g（精確至0.001 g）待測水產(chǎn)制品樣品置于100 mL離心管中，加50 mmol/L氫氧化鈉溶液混勻，繼續(xù)加該溶液至100 mL刻度線處，置于渦旋振蕩器混合均勻后，于80℃超聲提取30 min，間隔5 min振蕩一次直至完全分散開來，冷卻至室溫，溶液經(jīng)濾紙過濾，取部分溶液于4℃下8 000 r/min離心10 min，取上清液備用。取上清液約15 mL，依次通過0.45 μm水相濾膜、OnGuardⅡRP小柱后，棄去前面3 mL，收集后面洗脫液上離子色譜儀測定。

空白試驗除不加待測樣品外，采用完全相同的分析步驟、試劑和用量，進(jìn)行平行操作的試驗。

1.3.2 色譜條件

色譜柱：分離柱為Dionex Ionpac AS11-HC（4 mm×250 mm），保護柱為Ionpac AG11-HC型（4 mm×50 mm）；淋洗液：氫氧化鉀溶液，梯度洗脫時間及濃度見表1，流速：1.0 mL/min；檢測器：電導(dǎo)檢測器；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：100 μL；運行時間：30 min。

表1 流動相梯度洗脫程序Tab.1 Gradient elution programme of mobile phase

1.3.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線

分別吸取磷酸根標(biāo)準(zhǔn)中間液、焦磷酸根標(biāo)準(zhǔn)中間液、三偏磷酸根標(biāo)準(zhǔn)貯備液、三聚磷酸根、六偏磷酸根標(biāo)準(zhǔn)貯備液適量，配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行上機分析，以不同的磷酸根離子質(zhì)量濃度（mg/L）為橫坐標(biāo)，以峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并計算線性回歸方程。

1.3.4 回收率和精密度

稱取2.500 g待測樣品，分別向其中加入一定量的不同濃度梯度（高、中、低）的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，渦旋混勻放置30 min，按上述方法進(jìn)行前處理和上機分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理條件的優(yōu)化

2.1.1 萃取溫度

本實驗考察了前處理過程中超聲波萃取溫度的影響。將待測樣品分別置于40℃、80℃和100℃不同溫度條件下進(jìn)行實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，80℃時，相同加標(biāo)濃度下的5種多聚磷酸根的測定峰面積值比較穩(wěn)定，離子之間轉(zhuǎn)化幅度不大，且80℃提取30 min測定值和新配置的標(biāo)準(zhǔn)品測定值相差較小，因此本試驗選擇80℃提取30 min作為前處理條件。

2.1.2 提取液pH值影響

多聚磷酸根在水溶液中不穩(wěn)定，溶液溫度升高或酸性增強會加速其水解，生成磷酸根或更短鏈的聚磷酸根；若溶液中有酵素、絡(luò)合陽離子等存在時會大大加快水解速度。但是改變?nèi)芤旱膒H值會使五種多聚磷酸根發(fā)生化學(xué)變化，影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。由于多聚磷酸根離子長時間在水溶液中（尤其是酸性溶液中）會發(fā)生自身酸水解現(xiàn)象，為保證方法的穩(wěn)定性，實驗中所用標(biāo)準(zhǔn)溶液的pH值均保持在堿性范圍內(nèi)。因此我們選擇50 mmol/L氫氧化鈉溶液作為提取液進(jìn)行樣品提取，使樣品溶液pH（8～10）呈現(xiàn)堿性。

2.2色譜條件的優(yōu)化

2.2.1 色譜柱的選擇

本實驗通過比較AS19、AS11-HC等分析柱發(fā)現(xiàn)，不同型號的分析柱均能分離多聚磷酸鹽，但是實驗結(jié)果顯示AS11-HC分析柱對三聚磷酸鹽與三偏磷酸鹽的分離效果最好，更加適合分析測定高濃度多聚磷酸鹽，因此本實驗最終選用Dionex Ionpac AS11-HC色譜柱進(jìn)行多聚磷酸根的分離。

2.2.2 柱溫的選擇

本試驗考察了5種多聚磷酸根在不同柱溫情況下（25℃、30℃、50℃）的分離情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)柱溫對磷酸根、焦磷酸根及六偏磷酸根的峰面積和峰高影響不大，但對三偏磷酸根和三聚磷酸根的峰面積和峰高以及分離度均有影響。所以對柱溫選擇時主要考慮三偏磷酸根和三聚磷酸根分離度以及出峰情況，分別選擇濃度為2.5 μg/mL的三偏磷酸根和三聚磷酸根進(jìn)行實驗，實驗結(jié)果表明當(dāng)柱溫為30℃時，三偏磷酸根和三聚磷酸根兩種磷酸根相對應(yīng)的信號最強且能夠完全分離開來，因此柱溫選擇30℃。

2.2.3 進(jìn)樣體積的選擇

液相色譜的測定多選擇25 μL或50 μL作為進(jìn)樣體積，但在測定實際樣品過程中發(fā)現(xiàn)，25 μL或50 μL樣品上機響應(yīng)值不高，因此增大進(jìn)樣體積，選擇 100 μL進(jìn)樣量來以提高方法靈敏度。圖1是5種多聚磷酸根混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（10.0 mg/L）離子色譜圖。其中峰1為正磷酸根（PO43-），出峰時間5.582 min；峰 2為焦磷酸根（P2O74-），出峰時間為12.487 min；峰 3為三聚磷酸根（P3O105-），出峰時間為14.153 min；峰4為三偏磷酸根（P3O93-)，出峰時間15.064 min；峰5為六偏磷酸根（P6O18）6-，出峰時間為 17.589 min。

2.2.4 線性范圍、定量限及檢出限

圖1 10.0 mg/L時五種多聚磷酸根標(biāo)準(zhǔn)溶液的離子色譜圖Fig.1 Ionchromatogram of standard solution of five polyphosphates

配制5種多聚磷酸根混合標(biāo)準(zhǔn)溶液系列，在最佳實驗條件下，以峰面積為縱坐標(biāo)（Y軸），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X軸），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。五種多聚磷酸根的質(zhì)量濃度以P5O2計，用濃度稀釋法在10倍信噪比時（RSN）測得定量限，（PO4）3-、（P2O7）4-、（P3O9）3-、（P3O10）5-、（P6O18）6-的檢出限為 0.5～3.0 mg/kg，定量限為 2.0～5.0 mg/kg。線性相關(guān)系數(shù)、線性方程及線形范圍如表2所示。由表可知，目標(biāo)化合物質(zhì)量濃度與峰面積線性關(guān)系良好，線性范圍、檢出限均令人滿意。

表2 5種多聚磷酸根的標(biāo)準(zhǔn)曲線線性方程和相關(guān)系數(shù)、線性范圍及定量限Tab.2 The linearly relevant coefficient and equation,linear range,detection limit of five polyphosphates

2.2.5 方法的回收率和精密度試驗

在確定了檢測方法后，選取墨魚丸、蝦丸、日本黃姑魚丸水產(chǎn)制品為研究對象，通過由低到高（50 μg/kg、100 μg/kg、200 μg/kg）的3個不同濃度梯度進(jìn)行加標(biāo)回收率和精密度實驗，以考察方法的準(zhǔn)確度和精密度。測定結(jié)果見下表3。由試驗結(jié)果可知，低中高三個不同加標(biāo)濃度梯度下，樣品回收率在80%～100%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%，該結(jié)果表明此方法完全能夠滿足水產(chǎn)加工制品中多聚磷酸鹽的含量測定。

表3 不同加標(biāo)濃度下的回收率和精密度實驗（n=6）Tab.3 Results of recovery and precision of samples(n=6)

2.3實際樣品測定

最佳實驗條件下，對3種不同種類的實際水產(chǎn)加工品進(jìn)行多聚磷酸鹽的6次平行測定，墨魚丸中（PO4）3-含量為 6.28 mg/kg（n=6），（P3O9）3-為 4.96 mg/kg（n=6），其他三種磷酸鹽未檢出；蝦丸中（PO4）3-含量為 5.84 mg/kg（n=6），其他四種磷酸鹽未檢出；日本黃姑魚丸中（PO4）3-含量為 5.61 mg/kg（n=6），（P3O9）3-為3.76 mg/kg（n=6），其他均未檢出。結(jié)果表明試驗中3種不同水產(chǎn)加工制品中多聚磷酸鹽的含量均低于國家限量標(biāo)準(zhǔn)。

3 結(jié)論

本文采用離子色譜法測定水產(chǎn)加工制品中多聚磷酸鹽的含量，通過對前處理和色譜條件的優(yōu)化，確定了最佳實驗條件，并成功應(yīng)用于墨魚丸、蝦丸、日本黃姑魚丸中5種多聚磷酸鹽的檢測。該方法具有快速、靈敏、適用范圍廣、準(zhǔn)確度精密度高等優(yōu)點，適用于水產(chǎn)加工制品中多級磷酸鹽的檢測。

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Determination of Polyphosphates in Aquatic Products by Ion Chromatography

CHANG Jia-qi1,2,MEI Guang-ming2,ZHANG Xiao-jun2,et al
(1.School of Food and Medical of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022;2.Marine Fishery Research Institute of Zhejiang Province,Zhoushan 316021,China）

A method for determination of polyphosphates in aquatic products was developed by ion chromatography.The condition of chromatography and pretreatment temperature and solutions,pH were optimized.The results showed that a good linear relationship can be found between the responsed value and the mass concentration while five polyphosphates(phosphate,pyrophosphate,tripolyphosphate,trimetaphosphate and hexametaphosphate)were in the range of 0.1-100,0.2-50,0.1-60,0.3-40,0.5-100 mg/L in the standard solution range,and the correlation coefficient was from 0.999 2 to 0.999 8.The detect limits of the five polyphosphates(phosphate,pyrophosphate,tripolyphosphate,trimetaphosphate and hexametaphosphate)in aquatic products in the range of 0.5-3.0 mg/kg while the quantitative limits from2.0 to 5.0 mg/kg,and the average recoveries of polyphosphates in seafood spiked at the levels of 50,100,200 μg/kg from 80.2 to 100.3,while relativestandard deviations all less than 9%.With the advantages of simple operation,fast detection speed,good selectivity,good accuary and high precision,the method could be used as an ideal method for determination of polyphosphates in aquatic products.

ion chromatography;polyphosphates;aquatic products;determination method

TS254.7

：A

2016-12-15

常家琪（1993-），女，河南漯河人，研究方向：食品加工與安全.E-mail:m15257074549@163.com

梅光明，高級工程師，研究方向：水產(chǎn)品質(zhì)量安全.E-mail:meigm123@163.com

1008－830X(2017)01－0057－06