舟山海域梭子蟹科重要種類DNA條形碼建立及其系統(tǒng)發(fā)育研究

王秀亮，沈 璐，韓志強

（浙江海洋大學水產(chǎn)學院，浙江舟山 316022）

舟山海域梭子蟹科重要種類DNA條形碼建立及其系統(tǒng)發(fā)育研究

王秀亮，沈 璐，韓志強

（浙江海洋大學水產(chǎn)學院，浙江舟山 316022）

舟山海域梭子蟹科蟹類資源豐富，種類較多，具有及高的經(jīng)濟價值。然而，傳統(tǒng)分類學中對其分類主要采用形態(tài)觀察和行為學的技術手段，表型變異受環(huán)境因子影響顯著，導致表型性狀的不確定性。本研究采用蟹類DNA條形碼通用的引物來擴增舟山海域梭子蟹科6種常見蟹類的COI基因序列并構建系統(tǒng)發(fā)育樹，結果顯示，所有分析蟹類COI基因長度為658 bp。種內(nèi)變異較小，遺傳距離范圍0.000 0～0.008 2，平均0.002 9；種間變異較大，遺傳距離介于0.140 0～0.241 7，平均0.195 1。NJ系統(tǒng)發(fā)育樹支持蟳屬、梭子蟹屬和圓趾蟹屬具為三個獨立的系群，而與圓趾蟹屬的親緣關系較為疏遠，這為梭子蟹科的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育重建研究等方面提供重要參考。

DNA條形碼；梭子蟹科；系統(tǒng)發(fā)育；COI基因

Key words:DNA barcode;Portunidae;molecular phylogeny;COI gene

梭子蟹科Portunidae隸屬節(jié)肢動物門Arthropoda、甲殼綱Crustacea、十足目Decapoda，又名蝤蛑科，是短尾次目Brachyura梭子蟹總科Portunoidea的其中一科[1]。梭子蟹科的蟹類均生活于海洋中，主要棲息于熱帶、亞熱帶潮間帶及大陸架淺海區(qū)（極少數(shù)棲息于深海），少數(shù)種類也出現(xiàn)在河口半咸水域。梭子蟹類骨骼輕、眼大足細，螯足細長且相當強壯，末對步足呈漿狀，完全適合游泳運動。它們依靠迅速游泳的能力，可以捕獲運動迅速的獵物，也可依此避開較大的獵食者。絕大部分的梭子種類為雜食性，只有一部分蟹類特化為肉食性，少部分的蟹是植食性或腐食性的。

梭子蟹科約35個屬共計300余種，我國大約有60種。其中，三疣梭子蟹Portunus trituberculatus、日本蟳Charybdisjaponica、雙斑蟳Charybdis bimaculata、細點圓趾蟹Ovalipes punctatus、銹斑蟳Charybdis feriatus、紅星梭子蟹Portunus sanguinolentus，肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)豐富具有較高的經(jīng)濟價值，是我國重要的海洋捕撈蟹，在海洋漁業(yè)中占有重要的經(jīng)濟地位[2]。雖然梭子蟹科的經(jīng)濟意義重大，但是其系統(tǒng)發(fā)育及進化起源研究仍然沒有太大發(fā)展，并且很多種類至今沒有分清[3]。準確的物種鑒定和了解其系統(tǒng)發(fā)育關系對蟹類資源的可持續(xù)利用至關重要[4]。

近年來，分子標記手段為蟹類系統(tǒng)發(fā)育提供了一個新的方法[5]。目前用于蟹類系統(tǒng)發(fā)育研究的分子標記方法有同工酶（allozyme）、隨機擴增多態(tài)性DNA（RAPD）、限制性內(nèi)切酶片段長度多態(tài)性（RFLP）和DNA序列分析等[6]。DNA序列分析是目前使用得越來越多的一類分子標記，它的準確性受到眾多科研工作者的青睞，在甲殼動物的物種鑒定及遺傳結構的研究中，這一標記已被廣泛采用。

蟹類的分子分類研究運用的線粒體序列主要為12S rRNA，16S rRNA，COI等基因片段。COI基因較12S rRNA，16S rRNA等基因變異高，突變率約為1.4%/Ma[7]，更適于對親緣關系較近的物種的研究和群體間的遺傳變異研究。線粒體COI基因目前一般作為DAN條形碼（DNA Barcode）用于區(qū)分種間差異，進行物種鑒定[8]，也常聯(lián)合其他線粒體基因共同分析[9-12]，并且在蟹類的科屬分類階元下進行系統(tǒng)發(fā)育分析具有較好的潛力。本研究通過對梭子蟹科舟山海域常見的6種經(jīng)濟蟹類的COI基因片段序列進行擴增，并構建系統(tǒng)發(fā)育樹來分析梭子蟹科蟹類種內(nèi)種間的變異程度和親緣關系，為梭子蟹科的物種鑒定和系統(tǒng)發(fā)育提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗采樣

于2011年9月至2016年3月，在舟山近海海域采集梭子蟹科中蟳屬、梭子蟹屬和圓趾蟹屬共6個種的33個樣本。采樣種類經(jīng)形態(tài)鑒定分別為蟳屬：日本蟳、雙斑蟳、銹斑蟳；梭子蟹屬：紅星梭子蟹、三疣梭子蟹；圓趾蟹屬：細點圓趾蟹。將新鮮樣品帶回實驗室，取肌肉保存于無水酒精中。每種采樣信息和分析樣品數(shù)見表1。

表1 梭子蟹科采樣信息，包括樣本量、采樣地點、采樣時間Tab.1 The sampling information for Portunidae species(sample size,sample location and collection time)

1.2基因組DNA提取與PCR擴增

按照酚-氯仿方法用蛋白酶K消化肌肉從中提取DNA基因組。

COI基因用無脊椎動物通用引物L1490和H2198進行擴增。引物序列如下：

L1490：(5'-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3')（正向）；

H2198：(5'-TAAACTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3')（反向）

PCR 反應體積為 25 μL （50 mmol/L KCl，10 mmol/L Tris·HCl，pH 為 8.3，MgCl21.5mmol/L，各種dNTP200 μmol/L，Ex Taq 酶 1.25 units，每個引物各 0.2 mmol/L，模板 DNA1 μL，加滅菌蒸餾水至 25 μL。PCR反應用擴增儀（Eppendorf Mastercycler 5333）進行。反應的條件是：94℃預變性3 min，接著進行40個循環(huán)，每循環(huán)包括94℃ 45 s，50℃ 45 s，72℃1 min，最后在72℃下延伸10 min。以上反應都使用陰性對照檢查有否DNA污染。取1.5 μL擴增產(chǎn)物通過1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。產(chǎn)物送上海桑尼公司進行雙向測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所得序列經(jīng)SeqMan軟件（DNAstar軟件包）處理，去除引物并結合人工校對，確定每一序列位點準確無誤。使用MEGA6.0軟件對6種蟹類的COI基因片段堿基組成進行分析。遺傳距離的計算和NJ系統(tǒng)發(fā)育樹的構建也采用MEGA軟件。利用Kimura兩參數(shù)模型（Kimura-2-parameter,K2P）[13]計算樣品間兩兩遺傳距離（pairwise distances），并且計算出堿基差異數(shù)。采用鄰接距離法（Neighbor-Joining）構建系統(tǒng)發(fā)育樹，進行1 000次自檢，計算各分支的支持率。

2 結果

2.1 COI基因堿基組成

對采自浙江舟山海域的梭子蟹科的6種重要種類的線粒體COI基因片段進行PCR擴增和序列測定。對其比對后，得到658 bp的同源序列，其堿基組成（表2）。A、T、G、C的平均含量分別為36.8%、20.0%、25.7%和17.5%，A+T的平均含量為62.6%。同時由表可知，雖然6種蟹類的A、T、G、C組成上存在差異，但A+T的含量均明顯高于G+C，具有AT偏向性。

表2 梭子蟹科的6種重要種類的COI基因片段堿基組成Tab.2 The base composition for COI gene in six Portunidae species

2.2 種內(nèi)的COI基因變異

6種蟹類種內(nèi)COI基因變異度（表3），有表可知，6種蟹類種內(nèi)變異較小，種內(nèi)遺傳距離范圍0.000 0～0.008 2，平均值為0.002 9；種內(nèi)個體間堿基平均差異數(shù)范圍0.000 0～5.333 3，平均值為1.866 7。日本蟳種內(nèi)6個個體遺傳距離最小為0.000 0，6個個體共享一個單倍型；細點圓趾蟹種內(nèi)遺傳距離最大為0.002 9，在細點圓趾蟹中檢測到3個單倍型，個體間平均堿基差異數(shù)為1.866 7。

表3 梭子蟹科的6種重要種類的種內(nèi)COI基因變異Tab.3 The intraspecific COI gene variations in six Portunidae species

2.3 種間的遺傳差異及系統(tǒng)發(fā)育

2.3.1 遺傳差異

6種蟹類COI的遺傳距離（表4），由表4可知，6種蟹類的種間遺傳距離為0.140 0～0.241 7，其中，紅星梭子蟹和細點圓趾蟹的遺傳距離最大，為0.241 7，雙斑蟳與日本蟳的遺傳距離最小，為0.140 0。6種蟹類的種間平均堿基差異數(shù)為83.00～133.70，其中，紅星梭子蟹和細點圓趾蟹的堿基差異最大，為133.70，雙斑蟳與日本蟳的堿基差異最小，為83.00。這表明遺傳距離和堿基差異數(shù)顯示出來的遺傳差異具有一致性。

表4 梭子蟹科的6種重要種類的遺傳距離（下對角線）和堿基差異數(shù)（上對角線）Tab.4 The genetic distance(below the diagonal)and base number of differences(above the diagonal)between species in Portunidae

2.3.2 系統(tǒng)發(fā)育

6梭子蟹科種類的分子系統(tǒng)發(fā)育樹如圖1，線長表示的是分歧度，線上的數(shù)值表示的經(jīng)過1 000次重復抽樣所獲得的支持率。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示這6種蟹類分為三支，日本蟳、銹斑蟳和雙斑蟳首先聚為一支為蟳屬，紅星梭子蟹和三疣梭子蟹聚為一支，是梭子蟹屬，細點圓趾蟹單獨聚為一支，是圓趾蟹屬。根據(jù)系統(tǒng)樹表明蟳屬、梭子蟹屬和圓趾蟹屬3屬間具有較相近的親緣關系。

3 討論

圖1 梭子蟹科的6種重要種類的NJ系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.1 The neighbor-joining tree for Portunidae species

本實驗結果顯示，所有分析蟹類COI基因長度為658 bp，無插入缺失。HEBERT等[14]推薦的生物條形碼種間遺傳距離閾值為0.02，多數(shù)物種間的遺傳距離遠大于該值。在本研究中6種蟹類種內(nèi)平均遺傳距離0.002 9；種間平均遺傳距離0.195 1。種間和種內(nèi)的遺傳距離相差約65倍，說明COI基因用于物種間鑒定時，具有很好的種間間斷性，符合HEBER有關的種間閾值范圍，但細點圓趾蟹種內(nèi)遺傳距離較大，種內(nèi)個體間平均遺傳距離為0.008 2，說明在該種內(nèi)COI基因進化較快。此外，COI基因在5種蟹類種內(nèi)多樣性較低，6個日本蟳個體共享一個單倍型，雙斑蟳5個個體中只檢測到2個單倍型，表明COI基因在群體水平上遺傳變異較小，種內(nèi)較穩(wěn)定。

DNA條形碼的應用以標準基因的確立為基礎，自HERBERT[14]提出以COI基因作為物種的條形碼，越來越多的研究對該基因在不同生物類群中應用的有效性進行了驗證，證明COI基因在動物條形碼應用中的優(yōu)勢。而COI基因的這種優(yōu)勢之一就在于COI通用引物的廣泛適用性。本研究采用無脊椎動物的通用引物對舟山海域的6種梭子蟹科的重要種類進行擴增，均順利獲得相應序列，表明該通用引物在蟹類物種中具有較普遍的適用性。采用COI基因?qū)?種蟹類系統(tǒng)發(fā)育研究表明，6種蟹類按照屬分別進行聚類，支持形態(tài)學的分類結果，蟳屬、梭子蟹屬和圓趾蟹屬互為單系群。本研究結果同金珊等[15]基于RAPD標記構建的6種梭子蟹科種類系統(tǒng)發(fā)育樹基本一致。

通過基于線粒體COI基因的DNA條形碼技術在蟹類物種的鑒定識別中區(qū)分度高。目前多數(shù)學者認為,基于COI基因的生物條形碼可以較好實現(xiàn)物種鑒定工作，可望成為物種鑒定的重要工具[16]。但DNA條形碼存在一定的“錯誤標簽”,對于雜交種類和存在種間漸滲的種類，難以完全取代形態(tài)學分類方法在分類學上的地位。所以應用DNA條形碼鑒定物種仍需結合形態(tài)學或輔以其他基因進行驗證。

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DNA Barcode and Molecular Phylogeny of the Important Species in Family Portunidae

WANG Xiu-liang,SHEN Lu,HAN Zhi-qiang
(Fishery School of Zhejiang Ocean University,Zhoushan 316022,China)

The family Portunidae contains many economic crab species in Zhoushan sea area.However,the traditional taxonomy methods mainly used the morphology and behavioral characters.The phenotypic variation was significantly affected by environmental factors,resulting in some uncertainty.In this study,the mtDNA cytochrome oxidase subunit I(COI)gene was amplified from six economic crab species to construct the phylogenetic tree for family Portunidae.The results showed that the fragment of COI gene amplified in this study was 658 bp.The intraspecific genetic distances within species were small,ranging from 0.000 0 to 0.008 2 with an average of 0.002 9;the interspecific genetic distances between species were large,ranging from 0.140 0 to 0.247 0 with an average of 0.195 1.Based on the NJ tree,the separation of three genus Portunus,Charybdis and Ovalipes have been supported.The present study provided an important reference for the reconstruction of the system and the crab species identification.

Q959.223+.63

：A

2016-12-02

國家自然科學基金（32170527）

王秀亮（1990-），男，山東臨沂人，碩士研究生，研究方向：種群遺傳學.

韓志強，教授.E-mail:d6339124@163.com

1008－830X(2017)01－0014－05