基于三維打印和組織工程技術(shù)構(gòu)建人陰莖形態(tài)軟骨支撐體

袁兆遠(yuǎn) 寧進(jìn) 陳潔 夏會堂 陶然 周廣東 肖開顏 曹誼林

·論著·

基于三維打印和組織工程技術(shù)構(gòu)建人陰莖形態(tài)軟骨支撐體

袁兆遠(yuǎn) 寧進(jìn) 陳潔 夏會堂 陶然 周廣東 肖開顏 曹誼林

目的探討基于三維打印和組織工程技術(shù)構(gòu)建人陰莖形態(tài)軟骨支撐體的可行性。方法應(yīng)用三維打印技術(shù)制備人陰莖形態(tài)聚己內(nèi)酯/羥基磷灰石（PCL/HA）內(nèi)核，并在外層包被聚羥基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA）細(xì)胞支架，組裝成人陰莖形態(tài)三維復(fù)合支架。獲取乳豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，培養(yǎng)、擴(kuò)增至第1代，收取細(xì)胞，接種至復(fù)合支架，體外培養(yǎng)4周后植入裸鼠皮下，體內(nèi)8周后取材，進(jìn)行大體及組織學(xué)觀察。結(jié)果人陰莖形態(tài)復(fù)合支架形態(tài)逼真，植入裸鼠體內(nèi)8周后，再生出人陰莖形態(tài)的軟骨支撐體，支撐體表面形成均質(zhì)、成熟的軟骨層，軟骨層與內(nèi)核支架融合良好。結(jié)論基于三維打印和組織工程技術(shù)，可形成內(nèi)核為PCL/HA支架，外層包被成熟軟骨的人陰莖形態(tài)軟骨支撐體。

組織工程三維打印復(fù)合支架陰莖軟骨

陰莖是男性重要的泌尿、生殖器官，具有排尿、排精和性交功能。因先天性畸形或創(chuàng)傷、腫瘤等導(dǎo)致的部分或完全缺損，使患者喪失排尿、性交能力的同時，給患者帶來沉重的心理傷害[1]。陰莖缺損的治療主要是陰莖再造術(shù)，皮瓣包裹軟骨支撐體是基本的方法，合適的陰莖支撐體是決定手術(shù)成敗的關(guān)鍵因素之一。陰莖支撐體主要有兩大類：自體軟骨或骨，以及人工陰莖假體[2-4]。自體軟骨或骨移植，破壞供區(qū)解剖結(jié)構(gòu)，甚至可引起供區(qū)功能障礙；而由惰性材料制成的人工假體，則存在免疫排斥、生物相容性差等問題。組織工程的快速發(fā)展為臨床陰莖再造提供了新的思路[5]。

各類軟骨缺損（如關(guān)節(jié)、氣管等）的組織工程修復(fù)技術(shù)均已在動物體內(nèi)獲得了初步成功[6-7]，其中關(guān)節(jié)軟骨缺損修復(fù)已實現(xiàn)了初步的臨床轉(zhuǎn)化[8]。因此，本研究嘗試以組織工程技術(shù)，并輔以三維打印技術(shù)，構(gòu)建陰莖形態(tài)軟骨支撐體，為臨床陰莖再造提供更為合適的軟骨支持體。

聚羥基乙酸/聚乳酸（PGA/PLA）是軟骨構(gòu)建常用的細(xì)胞支架材料[9-11]，但是其力學(xué)強(qiáng)度不足，難以滿足陰莖軟骨支撐體對強(qiáng)度的需求；構(gòu)建大體積的軟骨還會出現(xiàn)中心部分營養(yǎng)不足，難以形成成熟軟骨。聚己內(nèi)酯（PCL）具有良好的組織相容性，力學(xué)強(qiáng)度高，并可調(diào)整，易塑形，可進(jìn)行三維打印。但是，PCL缺乏細(xì)胞親和位點，限制了其作為細(xì)胞支架的應(yīng)用[12-15]。我們利用PGA/PLA的成軟骨優(yōu)勢和PCL高強(qiáng)度、易塑形的特點，制作組裝成內(nèi)部為三維打印的陰莖形態(tài)PCL/HA內(nèi)核（混入HA用以調(diào)整、維持材料強(qiáng)度），外部包被預(yù)先塑形的薄層多孔PGA/ PLA細(xì)胞支架，并嘗試以此構(gòu)建人陰莖軟骨支撐體。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

5只雌性裸鼠（上海甲干生物科技有限公司）。實驗過程中均依照實驗動物保護(hù)指南的要求進(jìn)行。

1.2 實驗材料及設(shè)備

高糖DMEM培養(yǎng)基（Gibco公司，美國）；胎牛血清，磷酸鹽緩沖液，胰蛋白酶（Hyclone公司，美國）；Ⅱ型膠原酶（Worthington公司，美國）；無紡PGA纖維（組織工程國家工程研究中心）；聚乳酸（PLA，濟(jì)南岱罡生物工程有限公司）；聚己內(nèi)酯（PCL）/羥基磷灰石（HA）復(fù)合材料（上海交通大學(xué)材料學(xué)院）；硅橡膠（3M公司，美國）。

三維打印熔融噴絲雙噴頭成型機(jī)（上海富奇凡機(jī)電科技有限公司）；混料機(jī)（Plastograph EC，Brabender公司，德國）。

1.3 原代細(xì)胞的獲取及擴(kuò)增

軟骨取自新生乳豬髖、膝關(guān)節(jié)，將軟骨塊剪碎，加入0.25%Ⅱ型膠原酶，37℃震蕩消化7～8 h，用100 μm細(xì)胞濾網(wǎng)過濾，離心，去上清液。沉淀的細(xì)胞用高糖DMEM培養(yǎng)基重懸，以1×104cells/cm2的濃度接種于100 mm培養(yǎng)皿上。在37℃、5%CO2及飽和濕度下，用含10%胎牛血清、2 ng/mL bFGF、1%青霉素及鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基進(jìn)行軟骨細(xì)胞培養(yǎng)、擴(kuò)增，待細(xì)胞生長至70%～80%融合時進(jìn)行傳代。

1.4 陰莖內(nèi)核支架的打印

首先，CT掃描得到成年男性陰莖勃起狀態(tài)下的三維數(shù)據(jù)，應(yīng)用三維打印技術(shù)，將PCL/HA（7∶3）打印成多孔道的人陰莖形態(tài)內(nèi)核支架。

1.5 模具制備、表層細(xì)胞支架的塑形和復(fù)合支架組裝

以錫箔紙覆蓋打印完成的陰莖形態(tài)內(nèi)核支架，用硅膠對內(nèi)核支架的左右兩側(cè)分別印模（以正中矢狀面為界），得到的硅橡膠陰模灌鑄石膏陽模。參考文獻(xiàn)[16]的方法，將已塑形的左右兩部分PGA/PLA細(xì)胞支架嵌套在三維打印的陰莖內(nèi)核支架左右兩側(cè)，在兩側(cè)細(xì)胞支架對合的縫隙處，滴加PLA溶液并施以適當(dāng)壓力，擬合縫隙。

1.6 軟骨復(fù)合物的體外構(gòu)建

取第1代乳豬關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞，以1×108cells/mL的濃度，接種于PGA/PLA-PLA/HA復(fù)合支架，5 h后，細(xì)胞與材料充分黏附，加入培養(yǎng)液體外培養(yǎng)，每2天換一次液。4周后，將構(gòu)建物植入裸鼠背部皮下，在裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)8周。

1.7 大體及組織學(xué)觀察

8周后取材，觀察構(gòu)建物顏色、質(zhì)地，大體判斷是否為成熟軟骨，表層軟骨是否連續(xù)，形狀維持情況；將構(gòu)建物沿正中矢狀面剖開，觀察軟骨厚度、是否均一，外部軟骨和內(nèi)部多孔PLC/HA的界面整合情況。以4%多聚甲醛固定標(biāo)本，30%蔗糖脫水，OCT包埋，冰凍切片（10 μm厚），HE染色，觀察組織結(jié)構(gòu)及細(xì)胞外基質(zhì)分泌情況。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察及PGA/PLA生物相容性評估

光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，軟骨細(xì)胞形態(tài)呈長梭形、多角形，增殖快。圓柱形細(xì)胞支架直徑9 mm，厚1.5 mm。電鏡顯示，支架呈多孔結(jié)構(gòu)，PLA增強(qiáng)了PGA之間的交聯(lián)，PGA/PLA顯示出很好的生物相容性，細(xì)胞黏附在PGA上，并且分泌基質(zhì)覆蓋纖維（圖1）。

圖1 細(xì)胞形態(tài)觀察及材料生物相容性評估Fig.1Morphological observation of chondrocytes and evaluation of biocompatibility of PGA/PLA scaffold

2.2 莖模型的打印

PCL/HA混料均勻，三維打印的陰莖模型長3 cm，形態(tài)逼真，冠狀溝明顯，符合正常比例結(jié)構(gòu)，材料內(nèi)部為規(guī)則交叉的微小通道結(jié)構(gòu)（圖2）。

圖2 計算機(jī)輔助設(shè)計及3D打印制作陰莖內(nèi)核支架Fig.2Preparation of PCL/HA scaffold by CAD/CAM technique

2.3 PGA/PLA支架的制備及復(fù)合支架的組裝

陰模與陽模對合緊密，陽模石膏質(zhì)地堅硬而陰模樹脂彈性好，兩者組合，利于對PGA材料加壓塑形。塑形完成的PGA細(xì)胞支架形態(tài)逼真，冠狀溝處尤其突出，質(zhì)地如蛋殼，厚度1.5 mm。復(fù)合支架由外部的PGA/PLA細(xì)胞支架和內(nèi)部的PCL/HA核構(gòu)成。內(nèi)、外兩部分匹配度高，嵌合緊密。完成的復(fù)合支架形態(tài)逼真。經(jīng)過擬合，左右兩部分細(xì)胞支架結(jié)合為一體，僅留下一條淺淡的痕跡（圖3）。

圖3 復(fù)合支架的制備過程Fig.3Preparation of PCL/HA-PGA/PLA composite scaffold

2.4 組織工程構(gòu)建軟骨的大體及組織學(xué)觀察

復(fù)合物在構(gòu)建過程中，形態(tài)維持良好，體外培養(yǎng)4周后，表面形成一層不成熟的軟骨樣組織。植入裸鼠皮下后，無感染等發(fā)生，切口愈合好，皮膚無破損（圖4）。

圖4 軟骨體內(nèi)構(gòu)建Fig.4Reconstruction of cartilage in vivo

裸鼠體內(nèi)培養(yǎng)8周后取材，大體為質(zhì)硬、瓷白色軟骨樣組織，構(gòu)建物表面光滑、連續(xù)，未見血管化。構(gòu)建物的形狀和大小維持良好?？v切面觀察，發(fā)現(xiàn)PCL/HA核完全被軟骨包裹，相互交錯，緊密結(jié)合。HE染色顯示，陰莖假體外圍軟骨層與內(nèi)核支架融合，有部分軟骨細(xì)胞及纖維結(jié)締組織長入支架內(nèi)部，外圍軟骨細(xì)胞結(jié)構(gòu)成熟并有軟骨陷窩形成，提示構(gòu)建的陰莖軟骨復(fù)合體所形成的周圍軟骨組織完整，隨著時間的延長，可與內(nèi)部支架緊密結(jié)合成為整體（圖5）。

圖5 體內(nèi)8周組織大體觀及組織學(xué)情況Fig.5Gross view and histological observation of tissue harvested after implantation for 8 weeks

3 討論

組織工程軟骨是目前陰莖支撐體的主要研究方向，針對“中空”現(xiàn)象、力學(xué)強(qiáng)度不足、精確形態(tài)控制這三個再生陰莖軟骨支撐體的主要難題，本研究試圖通過三維打印和數(shù)字翻模技術(shù)制備復(fù)合支架，并應(yīng)用組織工程技術(shù)再生軟骨，構(gòu)建陰莖支撐體。

目前用于軟骨構(gòu)建的主要材料有PGA、膠原、凝膠支架和Pluronics等。其中，凝膠支架、Pluronics、膠原的力學(xué)強(qiáng)度低，難以維持特定形態(tài)[17]；PGA組織相容性好、降解速率適中、細(xì)胞黏附性好、易塑形，在特殊形態(tài)軟骨構(gòu)建中具有明顯優(yōu)勢，PLA包埋PGA作為細(xì)胞支架現(xiàn)已應(yīng)用于各種形態(tài)組織工程軟骨的構(gòu)建[9-11]。但是，大體積軟骨的構(gòu)建始終面臨著“中空”的問題[18]，這是由于構(gòu)建物中心遠(yuǎn)離表面，營養(yǎng)難以滲入，內(nèi)部的酸性代謝產(chǎn)物也難以排出而蓄積，導(dǎo)致中心部分細(xì)胞活性變差乃至死亡，最終形成空洞，致使軟骨構(gòu)建失敗。由于軟骨構(gòu)建存在的厚度限制，單純以PGA/PLA為材料難以構(gòu)建大體積軟骨。本研究在PCL/HA內(nèi)核外層僅包被厚度為1.5 mm的PGA/PLA細(xì)胞支架，再生約1.5 mm厚度的軟骨，避免超過再生軟骨的厚度限制，從而避免了“中空”的問題。體內(nèi)8周組織學(xué)結(jié)果顯示，PCL/HA內(nèi)核外層再生出連續(xù)、均質(zhì)、成熟的軟骨組織。

再造陰莖是否有足夠的強(qiáng)度以滿足性生活的需要，是衡量再造陰莖的一個重要指標(biāo)，單純以PGA/ PLA為細(xì)胞支架構(gòu)建的軟骨力學(xué)強(qiáng)度不足，難以滿足陰莖軟骨支撐體對強(qiáng)度的需求。本研究利用PCL良好的可塑性和較強(qiáng)的力學(xué)性能，通過三維打印技術(shù)，制備出具備精確人陰莖形態(tài)的PCL/HA內(nèi)核，作為組織工程軟骨的內(nèi)部支撐，其力學(xué)強(qiáng)度足以滿足陰莖支撐體的需求。陰莖支撐體的表層軟骨將PCL/ HA內(nèi)核完全包裹，內(nèi)核支架與機(jī)體之間形成有效隔離，避免了PCL/HA內(nèi)核引起的免疫反應(yīng)，同時有效減緩了PCL的降解速率，PCL/HA的長期留存可以保證陰莖支撐體強(qiáng)度的長期維持。

本研究通過對正常人陰莖進(jìn)行激光輪廓掃描/磁共振斷層掃描，結(jié)合圖像三維重建技術(shù)，建立精確的人陰莖形態(tài)數(shù)字模型，并基于三維打印技術(shù)，制備出具有精確的人陰莖形態(tài)PCL/HA內(nèi)核。應(yīng)用數(shù)字翻模技術(shù)，在PCL/HA內(nèi)核外層包被PGA/PLA細(xì)胞支架，組裝完成的復(fù)合支架仍可保持精確的人陰莖形態(tài)，解決了應(yīng)用組織工程技術(shù)構(gòu)建陰莖軟骨支撐體的形態(tài)控制問題。本研究結(jié)果顯示，三維復(fù)合支架、體外構(gòu)建4周及裸鼠體內(nèi)8周的軟骨支撐體，均具有陰莖頭、冠狀溝、陰莖體等陰莖正常解剖結(jié)構(gòu)，實現(xiàn)了陰莖軟骨支撐體的形態(tài)控制。三維打印的內(nèi)核表面具有規(guī)則的孔道結(jié)構(gòu)，有利于外層軟骨組織與內(nèi)核支架形成良好的嵌合，從而使陰莖支撐體成為完整的整體。本研究結(jié)果顯示，薄層的組織工程軟骨與內(nèi)核嵌合緊密，融合成統(tǒng)一的整體，降低了外層軟骨組織與內(nèi)核之間發(fā)生移位的可能性。

綜上所述，基于3D打印和數(shù)字翻模技術(shù)可成功制備出具備精確人陰莖形態(tài)的三維復(fù)合支架，結(jié)合組織工程技術(shù)可構(gòu)建出內(nèi)核為PCL/HA支架、外層包被成熟軟骨的人陰莖形態(tài)軟骨支撐體。

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Construction of Penis-Shaped Cartilage Using Tissue Engineering and 3D Printing Technologies

YUAN Zhaoyuan1, NING Jin1,CHEN Jie2,XIA Huitang2,TAO Ran2,ZHOU Guangdong1,2,3,XIAO Kaiyan2,CAO Yilin2,3．
1 Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College,Weifang 261042,China;2 Department of Plastic and Reconstructive Surgery; Shanghai Key Laboratory of Tissue Engineering,Shanghai Ninth People's Hospital,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;3 National Tissue Engineering Center of China,Shanghai 200241,China．Corresponding author:CAO Yilin(E-mail:yinlincao@yanhoo.com);XIAO Kaiyan(E-mail:xky7026@163.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of constructing a penis-shaped cartilage using tissue engineering and 3D printing technologies.MethodsA composite scaffold composed of PCL/HA and PGA/PLA were prepared for the reconstruction of penis-shaped cartilage by 3D printing.The penis-shaped PCL/HA scaffold prepared by 3D printing was beset between two separate PGA/PLA scaffolds that have a penis-shaped appearance.Articular chondrocytes were obtained from one-day-old roasters and then proliferated in order to meet the need of seeding sufficient cell into grafts.Cell-seeded constructs were cultivated in cartilage-inducing media for 4 weeks and then implanted under the dorsum skin of athymic nude mice.After 8 weeks'cultivation in vivo,constructs were harvested and grossly observed.Then the specimens were sagittally dissected to observe the interface between the regenerated cartilage and the porous PCL/HA scaffold and histology of engineered cartilage was examined in vivo.ResultsPenis-shaped models made of PCL/HA were printed into an exact penis shape and then composite scaffolds were assembled into a verisimilar penis.In the process of reconstruction,the initial shape of cell-seeded constructs were generally maintained.The surface of the specimens was smooth and continuous and no vascularization was observed.In cross section,the PCL/HA core were completely surrounded by the homogeneous neocartilage and the two phase interlocked well with each other.ConclusionIt is feasible to construct a penis-shaped cartilage with the PCL/HA core surrounded by the homogeneous neocartilage by using tissue engineering and 3D printing technologies.

Tissue engineering;3D-printing;Composite scaffold;Penis cartilage

Q813.1+3

A

1673－0364（2017）03－0123－05

2017年3月19日；

2017年4月29日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.03.002

上海市衛(wèi)生局項目（課題編號：20134323）。

261042山東省濰坊市濰坊醫(yī)學(xué)院整形外科研究所（袁兆遠(yuǎn)，寧進(jìn)，周廣東）；200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科，上海市組織工程研究重點實驗室（陳潔，夏會堂，陶然，周廣東，肖開顏，曹誼林）；200241上海市組織工程國家工程研究中心（周廣東，曹誼林）。

曹誼林（E-mail：yinlincao@yanhoo.com）；肖開顏（E-mail：xky7026@163.com）。