細(xì)胞－凝膠復(fù)合物促進(jìn)聚己內(nèi)酯內(nèi)核與細(xì)胞膜片組織整合的可行性研究

徐亞文 何愛娟 劉豫周 廣東 曹誼林

細(xì)胞－凝膠復(fù)合物促進(jìn)聚己內(nèi)酯內(nèi)核與細(xì)胞膜片組織整合的可行性研究

徐亞文 何愛娟 劉豫周 廣東 曹誼林

目的探討運(yùn)用軟骨膜片包裹聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）內(nèi)核，在裸鼠體內(nèi)構(gòu)建組織工程軟骨的可行性；探討Pluronic F-127凝膠和軟骨細(xì)胞混合物促進(jìn)PCL內(nèi)核與軟骨膜片組織整合的可行性。方法常規(guī)分離培養(yǎng)乳豬耳軟骨細(xì)胞，取第1代軟骨細(xì)胞高密度接種，體外培養(yǎng)4周后形成軟骨膜片。軟骨膜片包裹PCL內(nèi)核形成“三明治”模型作為未處理對(duì)照組（NC組）；模型內(nèi)注射Pluronic F-127凝膠作為對(duì)照組（PC組）；模型內(nèi)注射Pluronic F-127凝膠和軟骨細(xì)胞混合物作為實(shí)驗(yàn)組（Exp組）。3組植入同一裸鼠皮下（n=8），12周后取材比較各組軟骨再生情況。結(jié)果軟骨細(xì)胞高密度培養(yǎng)可形成軟骨樣組織，組織學(xué)證實(shí)有典型軟骨陷窩結(jié)構(gòu)，且高表達(dá)蛋白聚糖和Ⅱ型膠原?！叭髦巍蹦Ｐ椭踩塍w內(nèi)后，可見軟骨膜片形成了更為成熟的軟骨樣組織，表面光滑，質(zhì)地柔韌。各組濕重、體積及厚度測(cè)量結(jié)果均有顯著性差異，但各組力學(xué)檢測(cè)結(jié)果無顯著性差異。組織學(xué)證實(shí)，NC組和PC組僅外周軟骨膜片形成了成熟的軟骨樣組織，PCL內(nèi)核與膜片間未見軟骨形成；Exp組PCL內(nèi)核與軟骨膜片間可見大量軟骨再生，新生軟骨與外周軟骨膜片再生軟骨實(shí)現(xiàn)了良好整合。結(jié)論軟骨膜片包裹PCL內(nèi)核可構(gòu)建具有一定力學(xué)強(qiáng)度的組織工程軟骨，注射Pluronic F-127凝膠和軟骨細(xì)胞混合物后可有效促進(jìn)PCL內(nèi)核與軟骨膜片的組織整合。

組織工程聚己內(nèi)酯內(nèi)核軟骨膜片溫敏凝膠

軟骨為無血管組織，自我修復(fù)能力差，軟骨缺損一直是外科治療的難題。傳統(tǒng)治療方式,如自體軟骨移植、人工假體等，存在供區(qū)損傷、假體外露等諸多缺陷。組織工程技術(shù)可利用少量自體細(xì)胞構(gòu)建軟骨組織，為軟骨缺損修復(fù)提供了新的思路。

傳統(tǒng)組織工程方法常采用細(xì)胞復(fù)合支架材料的體內(nèi)軟骨構(gòu)建策略，支架材料及其降解產(chǎn)物在大動(dòng)物及人體內(nèi)可引起嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，干擾軟骨再生，進(jìn)而影響軟骨缺損治療的效果[1-4]。

軟骨膜片技術(shù)，無需人工合成或天然生物可降解材料作為支架，避免了上述材料本身及降解產(chǎn)物引起的不良炎癥反應(yīng)[5-7]，并能夠最大程度模擬體內(nèi)細(xì)胞微環(huán)境，保存細(xì)胞間以及細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的天然生物信號(hào)，更有利于構(gòu)建成熟的組織工程軟骨[8]。然而，最初形成的組織工程軟骨膜片作為一種低成熟度軟骨，基質(zhì)分泌不夠旺盛，力學(xué)強(qiáng)度相對(duì)差，植入體內(nèi)后無法抵抗皮膚張力、承受重力，無法維持形狀穩(wěn)定。因此，形狀控制和力學(xué)強(qiáng)度成為阻礙軟骨膜片技術(shù)進(jìn)一步發(fā)展應(yīng)用的關(guān)鍵因素。

聚己內(nèi)酯（Polycaprolactone，PCL）生物相容性好，且具有充足的力學(xué)強(qiáng)度，已被廣泛應(yīng)用于組織工程軟骨的構(gòu)建[9-11]。本研究使用3D打印PCL作為內(nèi)核，外包軟骨細(xì)胞膜片構(gòu)建成熟的組織工程軟骨，在軟骨形成初期，PCL作為內(nèi)核支架可幫助抵抗皮膚張力并承受重力，最大程度避免組織工程軟骨破裂變形，促進(jìn)組織工程軟骨體內(nèi)的形態(tài)維持；在組織工程軟骨形成后期，隨著PCL逐步降解吸收[12-13]，軟骨細(xì)胞分泌基質(zhì)，PCL內(nèi)核支架被成熟組織工程軟骨替代，從而解決軟骨細(xì)胞膜片形狀控制和力學(xué)強(qiáng)度維持難題。

本研究探討利用PCL內(nèi)核復(fù)合軟骨膜片技術(shù)，構(gòu)建具有一定力學(xué)強(qiáng)度的組織工程軟骨的可行性，以避免可降解材料殘留引起體內(nèi)炎癥反應(yīng)，解決軟骨膜片力學(xué)強(qiáng)度難題，推動(dòng)組織工程軟骨臨床轉(zhuǎn)化進(jìn)程。為驗(yàn)證PCL內(nèi)核復(fù)合軟骨膜片技術(shù)構(gòu)建組織工程軟骨的可行性，本研究將體外培養(yǎng)4周的軟骨膜片包繞3D打印PCL內(nèi)核并縫合作為NC組；內(nèi)填充Pluronic F-127水凝膠（4℃時(shí)自由流動(dòng)，37℃時(shí)凝膠化為穩(wěn)定形狀[14-16]）作為PC組；內(nèi)填充Pluronic F-127凝膠混軟骨細(xì)胞作為Exp組。將3組復(fù)合物植入裸鼠體內(nèi)，12周后評(píng)估再生組織的形成質(zhì)量、力學(xué)性能等，以明確PCL內(nèi)核復(fù)合軟骨膜片技術(shù)構(gòu)建具備一定力學(xué)強(qiáng)度的組織工程軟骨的可行性。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

原代耳軟骨細(xì)胞取自出生1～3 d乳豬（上海甲干生物科技有限公司提供）。樣本植入6～8周雄性BALB/ C裸鼠皮下（上海甲干生物科技有限公司提供）。

1.2 實(shí)驗(yàn)器材與試劑

H-DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清、青霉素-鏈霉素-兩性霉素B（Hyclone公司，美國(guó)），膠原酶、Pluronic F-127粉劑（Sigma公司，美國(guó)），0.25%胰蛋白酶（Gibco公司，美國(guó)），bFGF（R&D公司，美國(guó)），恒溫磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）。

1.3 軟骨細(xì)胞的獲取和培養(yǎng)

無菌獲取乳豬外耳，去除皮膚和軟骨膜，將耳廓軟骨剪成1 mm×1 mm的小塊，加入1.5 mg/mLⅡ型膠原酶，37℃恒溫?fù)u床消化6～8 h，100 μm濾網(wǎng)過濾，收集濾液離心，棄上清，以含10%胎牛血清、1%三抗（青霉素-鏈霉素-兩性霉素B）的高糖培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，以2.5×104cells/cm2的密度接種于培養(yǎng)皿，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中，每?jī)商鞊Q液一次，至80%融合時(shí)傳代。

1.4 軟骨膜片體外構(gòu)建

收集第一代軟骨細(xì)胞，以3×106 cells/cm2接種于六孔板。常規(guī)高糖培養(yǎng)基每天換液。1周后改用無血清軟骨重分化培養(yǎng)液（高糖培養(yǎng)基，內(nèi)含1%三抗、TGF-β1等），每日換液。體外培養(yǎng)4周后，用鑷子將軟骨膜片從六孔板上揭下。

1.5 PCL內(nèi)核的制備

采用熱熔融沉積快速成型技術(shù)，在105℃左右將PCL顆粒制成網(wǎng)格狀多孔材料，網(wǎng)格厚度約為0.9 mm。將網(wǎng)格剪成7 mm×7 mm大小，75%乙醇浸泡，紫外照射過夜。PBS沖洗3遍，常規(guī)高糖培養(yǎng)基預(yù)培養(yǎng)3 d。

1.630 %Pluronic F-127水凝膠的制備

取30 g Pluronic F-127粉劑加入100 mL HDMEM培養(yǎng)基，置于4℃冰箱，加入磁力攪拌轉(zhuǎn)子，借助磁場(chǎng)底座緩慢溶解粉劑，直至粉末完全消失，高溫高壓滅菌備用。

1.7 “三明治”模型制備及裸鼠體內(nèi)植入

修剪軟骨膜片為9 mm×18 mm長(zhǎng)方形，沿長(zhǎng)軸對(duì)折包裹PCL內(nèi)核，5-0不可吸收縫線縫合PCL內(nèi)核與軟骨膜片，制成膜片-內(nèi)核-膜片的“三明治”模型，將其植入裸鼠背部皮下，作為NC組。無細(xì)胞30%Pluronic F-127凝膠注射入“三明治”模型，直至PCL內(nèi)核與軟骨膜片之間無空隙，植入裸鼠背部皮下，作為PC組。4℃下，用30%Pluronic F-127重懸軟骨細(xì)胞，細(xì)胞終濃度調(diào)至75×106cells/mL，凝膠-細(xì)胞復(fù)合物注射入“三明治”模型，直至PCL內(nèi)核與軟骨膜片之間無空隙，植入裸鼠背部皮下作為Exp組。各組在體內(nèi)培養(yǎng)12周，平行樣品數(shù)為8個(gè)。

1.8 體內(nèi)軟骨再生情況

體內(nèi)培養(yǎng)12周后取出組織塊，剝?nèi)ケ砻娼Y(jié)締組織，觀察大體形態(tài)、質(zhì)地，測(cè)量濕重、厚度和體積等。

1.9 生物力學(xué)檢測(cè)

將體內(nèi)構(gòu)建的軟骨修剪為7 mm高，位移速度為2 mm/min，500 N最大負(fù)荷加壓，當(dāng)樣本發(fā)生嚴(yán)重變形時(shí)停止加壓。記錄最大抗壓強(qiáng)度，計(jì)算彈性模量。

1.10 組織學(xué)檢測(cè)

將體外培養(yǎng)4周的軟骨膜片，以4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片（厚度為5 μm），常規(guī)HE染色、番紅-O染色和Ⅱ型膠原染色。體內(nèi)培養(yǎng)12周后取材，組織塊以4%多聚甲醛固定、脫水、透明以及石蠟包埋，常規(guī)HE染色和番紅-O染色。觀察體內(nèi)外構(gòu)建軟骨的基本結(jié)構(gòu)和細(xì)胞外基質(zhì)的分泌情況。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

體內(nèi)構(gòu)建軟骨的厚度、濕重、體積和力學(xué)強(qiáng)度等定量指標(biāo)以（x±s）表示，SPSS 11.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體外構(gòu)建軟骨膜片形成質(zhì)量

光鏡下可見原代乳豬耳軟骨細(xì)胞呈多角形或梭形，折光性強(qiáng)，活力較強(qiáng)。接種于培養(yǎng)皿后約12 h貼壁，4～5 d達(dá)80%～90%融合（圖1A）。傳代擴(kuò)增到第一代時(shí)，細(xì)胞形態(tài)及增殖活性均無明顯變化，2～3 d達(dá)80%～90%融合（圖1B）。軟骨細(xì)胞高密度接種且經(jīng)體外培養(yǎng)4周后，形成了質(zhì)地光滑、具有一定厚度及力學(xué)強(qiáng)度的軟骨膜片（較為柔韌、手術(shù)器械操作過程中無組織斷裂、破碎等現(xiàn)象）（圖1C）；HE染色可見軟骨膜片具有大量、典型的軟骨陷窩結(jié)構(gòu)（圖1D）；番紅-O染色和Ⅱ型膠原免疫組化提示，軟骨膜片能強(qiáng)表達(dá)黏多糖和Ⅱ型膠原（圖1E-F）。說明體外培養(yǎng)的軟骨膜片能形成成熟且具有功能的軟骨樣組織。

圖1 體外構(gòu)建軟骨膜片形成情況Fig.1Examination of engineered cartilage sheet in vitro

2.2 Pluronic F-127和軟骨細(xì)胞復(fù)合物制備

混合軟骨細(xì)胞的Pluronic F-127泛黃色，光鏡下可見軟骨細(xì)胞均勻分散于Pluronic F-127中（圖2）。

圖2 Pluronic F-127和軟骨細(xì)胞復(fù)合物的制備Fig.2The preparation of the mixture of Pluronic F-127 thermo-sensitive hydrogel and chondrocytes

2.3 “三明治”模型制備與裸鼠體內(nèi)植入

應(yīng)用3D打印技術(shù)可制備具有一定力學(xué)強(qiáng)度的多孔PCL支架（圖3A）。軟骨膜片質(zhì)地柔韌，易剪裁為特定形狀并包裹PCL內(nèi)核，形成具有充足力學(xué)強(qiáng)度的PCL-軟骨膜片復(fù)合物（圖3B-D）。于PCL-軟骨膜片復(fù)合物內(nèi)注射凝膠軟骨細(xì)胞混合物，20℃下，水凝膠固化穩(wěn)定軟骨細(xì)胞，復(fù)合物略泛黃（圖3E-F）。單純水凝膠注射PCL-軟骨膜片復(fù)合物，室溫下水凝膠固化，形態(tài)穩(wěn)定，復(fù)合物略泛紅（圖3GH）。植入裸鼠皮下后，復(fù)合物形態(tài)維持穩(wěn)定（圖3I）。

圖3 “三明治”模型的制備與裸鼠皮下植入Fig.3 The preparation of sandwich model and implantation into rude rice

2.4 體內(nèi)再生軟骨組織檢測(cè)

2.4.1 大體觀察

圖4 體內(nèi)再生軟骨大體觀Fig.4Gross view of in vivo engineered cartilage

體內(nèi)培養(yǎng)12周后，“三明治”模型復(fù)合物中軟骨膜片均形成了質(zhì)地緊實(shí)、表面光滑的成熟軟骨組織。三組復(fù)合物大體觀差異明顯。NC組和PC組，PCL內(nèi)核與軟骨膜片之間界限清楚，內(nèi)無白色軟骨樣組織，多為無組織間隙或是纖維結(jié)締組織（圖4A、B、D、E）；Exp組，PCL內(nèi)核與軟骨膜片之間有較多條帶狀白色軟骨樣組織，界限不清晰，偶見島狀紅色樣組織（圖4C，F(xiàn)）。

2.4.2 組織厚度、濕重、體積及生物力學(xué)檢測(cè)

NC組、PC組和Exp組厚度分別為（2.36±0.16）mm、（3.34±0.18）mm和（3.05±0.12）mm；濕重分別為（557.0±71.9）mg、（608.6±22.5）mg和（815.5±37.4）mg；體積分別為（0.66±0.09）mL、（0.76±0.05）mL和（0.98±0.04）mL。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，3組的厚度、濕重和體積均有顯著差異（P<0.05）。Exp組厚度明顯小于其他兩組，但濕重與體積均大于NC組和PC組，表明內(nèi)填充Pluronic F-127凝膠和軟骨細(xì)胞混合物有利于促進(jìn)PCL內(nèi)核與軟骨膜片組織整合。各組的彈性模量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05），我們認(rèn)為這主要是由于Exp組外包軟骨膜片內(nèi)尚未形成足夠均質(zhì)且成熟的軟骨樣組織，導(dǎo)致其力學(xué)強(qiáng)度與NC組、PC組之間差異不明顯（圖5）。

圖5 植入裸鼠皮下12周后各組厚度、濕重、體積以及彈性模量評(píng)估Fig.5Evaluation of thickness,wet weight,volume and Young's modulus after 12 weeks implantation to rude rice

2.4.3 組織學(xué)檢測(cè)

體內(nèi)培養(yǎng)12周后，復(fù)合物中軟骨膜片進(jìn)一步成熟，番紅-O染色顯著加強(qiáng)。3組復(fù)合物組織學(xué)結(jié)果差異明顯。NC組和PC組，PCL內(nèi)核與軟骨膜片之間未找到軟骨樣組織，多為纖維結(jié)締組織（圖6A、B、D、E）；Exp組，PCL內(nèi)核與軟骨膜片之間多為具有典型軟骨陷窩結(jié)構(gòu)的軟骨樣組織，連續(xù)分布，番紅-O染色呈強(qiáng)陽性，表明Pluronic F-127內(nèi)均勻分布的軟骨細(xì)胞具有活力，強(qiáng)表達(dá)黏多糖（圖6C、F）。這些結(jié)果證明，細(xì)胞凝膠復(fù)合物有助于促進(jìn)PCL內(nèi)核與軟骨膜片的組織整合。

圖6 體內(nèi)再生軟骨組織學(xué)觀察（40×）Fig.6Histological observation of in vivo engineered cartilage(40×)

3 討論

軟骨膜片，由自體軟骨細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞外基質(zhì)構(gòu)成，在形態(tài)學(xué)、組織學(xué)等方面接近天然軟骨組織，已在軟骨再生領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[17-18]。然而，軟骨膜片力學(xué)強(qiáng)度較差，無法實(shí)現(xiàn)特定形態(tài)的軟骨再生[19]。我們?cè)谇捌谘芯恐?，?chuàng)建了PCL內(nèi)核外層包被PGA纖維支架的“三明治”模型，并成功地在體外構(gòu)建精確耳郭形態(tài)軟骨。PCL內(nèi)核充足的力學(xué)強(qiáng)度有效對(duì)抗了組織構(gòu)建過程中的外力，使再生軟骨形態(tài)維持不變。但是，PGA支架材料在體外培養(yǎng)12周后仍有較多殘留，植入大動(dòng)物皮下后殘留的PGA纖維及其降解產(chǎn)物引起明顯炎癥反應(yīng)，體內(nèi)再生軟骨效果較差[20-21]。本研究中，我們采用軟骨膜片包裹3D打印PCL內(nèi)核的“三明治”模型構(gòu)建組織工程軟骨。該模型中，無支架軟骨膜片可避免PGA纖維及降解產(chǎn)物引起的免疫炎癥反應(yīng)，PCL內(nèi)核又可解決軟骨膜片的形態(tài)維持難題。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，軟骨膜片體外培養(yǎng)4周已形成具有典型軟骨陷窩結(jié)構(gòu)的軟骨樣組織，并表達(dá)硫酸黏多糖等大量軟骨特異性細(xì)胞外基質(zhì)；將體外構(gòu)建PCL內(nèi)核-軟骨膜片復(fù)合物植入裸鼠皮下12周，體內(nèi)再生出成熟軟骨組織，其三維形態(tài)基本維持不變。上述結(jié)果證實(shí)了軟骨膜片-PCL內(nèi)核-軟骨膜片的“三明治”模型可構(gòu)建成熟軟骨組織，且其力學(xué)強(qiáng)度足以使再生軟骨在體外、裸鼠體內(nèi)保持形態(tài)基本不變。

盡管如此，由于“三明治”模型多孔的PCL內(nèi)核腔隙間無種子細(xì)胞，體內(nèi)12周后軟骨膜片內(nèi)部見大量間隙與纖維結(jié)締組織，未形成連續(xù)的軟骨樣組織，PCL內(nèi)核與軟骨膜片之間整合不足。我們?cè)赑CL內(nèi)核與軟骨膜片間注射Pluronic F-127凝膠和軟骨細(xì)胞混合物，試圖解決這一問題。Pluronic F-127水凝膠在4℃時(shí)呈液態(tài)，37℃時(shí)固化為凝膠狀態(tài)，這保證了Pluronic F-127可在液體狀態(tài)下與軟骨種子細(xì)胞均勻混合，并在體內(nèi)環(huán)境中固化為凝膠狀態(tài)，避免了復(fù)合物因流動(dòng)而導(dǎo)致種子細(xì)胞流失[22-23]。其次，高含水量的凝膠為軟骨細(xì)胞提供了類似于天然軟骨組織的微環(huán)境，有效促進(jìn)體內(nèi)外軟骨再生。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，體內(nèi)培養(yǎng)12周時(shí)，NC組和PC組中，內(nèi)核孔隙內(nèi)均未見到軟骨樣組織，內(nèi)核與軟骨膜片間為明顯間隙與結(jié)締組織；Exp組中，內(nèi)核孔隙內(nèi)形成較均質(zhì)軟骨組織，孔隙區(qū)域再生軟骨與兩側(cè)軟骨膜片相互連續(xù)，形成整合良好的軟骨組織。該結(jié)果證實(shí)了PCL多孔內(nèi)核中填充Pluronic F-127凝膠和軟骨細(xì)胞的復(fù)合物，內(nèi)核孔隙內(nèi)可再生出良好的軟骨樣組織，并與兩側(cè)軟骨膜片再生軟骨相互連續(xù)，促進(jìn)了內(nèi)核與膜片之間有效整合，再生出一定厚度的軟骨組織。

4 結(jié)論

軟骨膜片包裹PCL內(nèi)核可在體內(nèi)構(gòu)建特定形態(tài)的組織工程軟骨，同時(shí)在內(nèi)核孔隙內(nèi)注射Pluronic F-127凝膠和軟骨細(xì)胞的混合物，有效促進(jìn)了內(nèi)核與兩側(cè)軟骨膜片之間的組織整合，再生出一定厚度、整合良好的軟骨組織?；谲浌悄て摹叭髦巍蹦Ｐ陀型鉀Q大片軟骨再生中存在的“中空”問題，和大動(dòng)物體內(nèi)支架材料及其降解產(chǎn)物易引起炎癥反應(yīng)的問題，具有良好的應(yīng)用前景。

[1]Liu Y,Zhang L,Zhou G,et al.In vitro engineering of human ear-shaped cartilage assisted with CAD/CAM technology[J]. Biomaterials,2010,31(8):2176-2183.

[2]陶然,劉浥,殷宗琦,等.利用軟骨細(xì)胞膜片技術(shù)在山羊皮下構(gòu)建軟骨樣組織的研究[J].組織工程與重建外科,2013,9(2):61-65.

[3]Haisch A.Ear reconstruction through tissue engineering[J].Adv Otorhinolaryngol,2010,68:108-119.

[4]Sittinger M,Hutmacher DW,Risbud MV.Current strategies for cell delivery in cartilage and bone regeneration[J].Curr Opin Biotechnol,2004,15(5):411-418.

[5]Caron MM,Emans PJ,Coolsen MM,et al.Redifferentiation of dedifferentiated human articular chondrocytes:comparison of 2D and 3D cultures[J].Osteoarthritis Cartilage,2012,20(10):1170-1178.

[6]Ge Y,Gong YY,Xu Z,et al.The Application of sheet technology in cartilage tissue engineering[J].Tissue Eng Part B Rev,2016, 22(2):114-124.

[7]Liu Y,Li D,Yin Z,et al.Prolonged in vitro precultivation alleviates post-implantation inflammation and promotes stable subcutaneous cartilage formation in a goat model[J].Biomed Mater,2016,12(1):015006.

[8]王健,劉霞,肖苒,等.應(yīng)用細(xì)胞膜片復(fù)合硅膠管內(nèi)支撐構(gòu)建組織工程管狀軟骨[J].組織工程與重建外科,2011,7(5):241-243.

[9]Kang HW,Lee SJ,Ko IK,et al.A 3D bioprinting system to produce human-scale tissue constructs with structural integrity [J].Nat Biotechnol,2016,34(3):312-319.

[10]Lee CH,Cook JL,Mendelson A,et al.Regeneration of the articular surface of the rabbit synovial joint by cell homing:a proof of concept study[J].Lancet,2010,376(9739):440-448.

[11]Serrano MC,Pagani R,Vallet-Regí M,et al.In vitro biocompatibility assessment of poly(epsilon-caprolactone)films using L929 mouse fibroblasts[J].Biomaterials,2004,25(25):5603-5611.

[12]Sun H,Mei L,Song C,et al.The in vivo degradation,absorption and excretion of PCL-based implant[J].Biomaterials,2006,27(9): 1735-1740.

[13]Chang KY,Hung LH,Chu IM,et al.The application of type II collagen and chondroitin sulfate grafted PCL porous scaffold in cartilage tissue engineering[J].J Biomed Mater Res Part A,2010, 92(2):712-723.

[14]Saim AB,Cao Y,Weng Y,et al.Engineering autogenous cartilage in the shape of a helix using an injectable hydrogel scaffold[J]. Laryngoscope,2000,110(10 Pt 1):1694-1697.

[15]Oh KS,Song JY,Yoon SJ,et al.Temperature-induced gel formation of core/shell nanoparticles for the regeneration of ischemic heart [J].J Control Release,2010,146(2):207-211.

[16]Liu S,Li L.Multiple phase transition and scaling law for poly (ethylene oxide)-poly(propylene oxide)-poly(ethylene oxide) triblock copolymer in aqueous solution[J].ACS Appl Mater Interfaces,2015,7(4):2688-2697.

[17]Neo PY,Teh TK,Tay AS,et al.Stem cell-derived cell-sheets for connective tissue engineering[J].Connect Tissue Res,2016,57(6): 428-442.

[18]Kikuchi T,Shimizu T,Wada M,et al.Automatic fabrication of 3-dimensional tissues using cell sheet manipulator technique[J]. Biomaterials,2014,35(8):2428-2435.

[19]Yan D,Zhou G,Zhou X,et al.The impact of low levels of collagen IX and pyridinoline on the mechanical properties of in vitro engineered cartilage[J].Biomaterials,2009,30(5):814-821.

[20]Ceonzo K,Gaynor A,Shaffer L,et al.Polyglycolic acid induced inflammation:Roleofhydrolysisandresultingcomplement activationl[J].Tissue Eng,2006,12(2):301-308.

[21]Asawa Y,Sakamoto T,Komura M,et al.Early stage foreign body reaction against biodegradable polymer scaffolds affects tissue regeneration during the autologous transplantation of tissueengineered cartilage in the canine model[J].Cell Transplant, 2012,21(7):1431-1442.

[22]Cao Y,Rodriguez A,Vacanti M,et al.Comparative study of the use of poly(glycolic acid),calcium alginate and pluronics in the engineering of autologous porcine cartilage[J].J Biomater Sci Polym Ed,1998,9(5):475-487.

[23]Bhat S,Kumar A.Biomaterials and bioengineering tomorrow's healthcare[J].Biomatter,2013,3(3):e24717.

The Feasibility of Using Cell-Hydrogel to Integrate PCL Inner Support with Cell-Sheet

XU Yawen1,2,HE Aijuan1,2, LIU Yu2,3,ZHOU Guangdong1,2,3,CAO Yilin1,2．
1 Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's HospitaL,Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China;2 Shanghai Key laboratory of Tissue Engineering,Shanghai 200011,China;3 Plastic Surgery Research Institute,Weifang Medical College,Weifang 261042,China.Corresponding author:CAO Yilin(E-mail:yilincao@yahoo.com).

ObjectiveTo explore the feasibility of using sandwich model,PCL as an inner support encapsulated by chondrocyte sheet,to create tissue-engineered(TE)cartilage;To explore the feasibility of integrating PCL with chondrocyte sheet by injecting the mixture of Pluronic F-127 hydrogel and chondrocytes.MethodsThe isolated auricular chondrocytes of passage 1 were seeded in six-well plate at a high density.Chondrocyte sheet formed after 4 weeks in vitro.PCL inner support encapsulated by chondrocyte sheet was set up as non-treated control group(NC group).Sandwich model injected with Pluronic F-127 hydrogel was set up as control group(PC group).Sandwich model injected with the mixture of Pluronic F-127 hydrogel and chondrocytes was set up as the experiment group(Exp group).The above constructs were implanted subcutaneously into the same nude mice(n=8).The samples were harvested 12 weeks after implantation for the evaluation of cartilage formation.ResultsAfter in vitro high cell-density culture,chondrocyte sheet formed into cartilaginous tissue. Histologically,sheet showed specific cartilage characters including cartilage lacunae and expressed GAG and collagenⅡ. After in vivo culture,sheet from the＂sandwich＂structure formed more mature cartilaginous tissue with smooth surface and flexible texture.The results of wet weight,thickness and volume from every group were significantly different.However,therewas no significant difference for Young＇s modulus.Histologically,an abundance of cartilage-like tissue was found between PCL inner support and chondrocyte sheet in Exp group,strongly expressing GAG.Although sheet developed into mature cartilage tissue in the NC and PC group,none of cartilaginous tissue was found between the PCL inner support and chondrocyte sheet.ConclusionPCL inner support encapsulated by chondrocyte sheet could construct TE cartilage with high mechanical strength.The approach of injection with the mixture of Pluronic F-127 hydrogel and chondrocytes could realize the cartilaginous integration of PCL inner support and chondrocyte sheet.

Tissue engineering;PCL inner support;Cartilage sheet;Thermo-sensitive gel

Q813.1+2

A

1673－0364（2017）03－0131－06

2017年2月12日；

2017年4月28日）

10.3969/j.issn.1673-0364.2017.03.004

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科（徐亞文，何愛娟，周廣東，曹誼林）；200011上海市上海市組織工程研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（徐亞文，何愛娟，劉豫，周廣東，曹誼林）；261042山東省濰坊市濰坊醫(yī)學(xué)院整形外科研究所（劉豫，周廣東）。

曹誼林（E-mail：yilincao@yahoo.com）。