朱砂根皂苷高產(chǎn)愈傷組織的誘導(dǎo)與篩選

黃素華+陳清坤+林小婷+洪燕萍

摘要：采用比色法測定了以朱砂根（Ardisia crenata）胚、根、莖及葉等4種外植體誘導(dǎo)的愈傷組織中皂苷含量，篩選高皂苷含量的愈傷組織。結(jié)果表明，朱砂根的胚和根誘導(dǎo)出來的愈傷組織皂苷含量最高，達(dá)到24.07 mg/g和21.25 mg/g，莖和葉誘導(dǎo)的愈傷組織皂苷含量較低，根和莖誘導(dǎo)的愈傷組織生長較好。

關(guān)鍵詞：朱砂根（Ardisia crenata）；愈傷組織；外植體；皂苷

中圖分類號：Q944.6 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號：0439-8114（2017）12-2359-03

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.12.040

Induced and Selected of High Saponin Content Calluses of Ardisia crenata

HUANG Su-hua，CHEN Qing-kun，LIN Xiao-ting，HONG Yan-ping

（College of Life Science ，Longyan University，Longyan 364000， Fujian， China）

Abstract： Using colorimetric method to determine the content of saponin of calluses induced from embryos， roots， stems and leaves， the high saponin calluses of Ardisia crenata was screened. Results showed that the calluses which were induced from the embryos and roots contained the higher content of saponin， the amount of them was 24.07 mg/g and 21.25 mg/g respectively； while the calluses those were induced from stems and leaves contained significant lower content of saponin. And the growth of calluses from root and stem were higher than others.

Key words： Ardisia crenata； callus； explant； saponin

朱砂根（Ardisia crenata）為紫金?？谱辖鹋僦参?，又名大羅傘、平地木、紅銅盤、硃砂根、八角金龍、金玉滿堂、黃金萬兩，主要分布于中國長江流域[1]。朱砂根為1977年版中國藥典收載的紫金牛屬2種藥用植物之一，其根具有較高的藥用價(jià)值，可治療急性咽峽炎、咽喉腫痛、上呼吸道感染、扁桃體炎、白喉、丹毒、淋巴結(jié)炎，能抗菌消炎退熱、治肺病、勞傷吐血、跌打損傷、活血化瘀、關(guān)節(jié)風(fēng)痛以及抗腫瘤等[2]。

陳尚钘等[1]研究發(fā)現(xiàn)朱砂根中含有醌類、有機(jī)酸、黃酮類、三萜皂苷、糖類等多種物質(zhì)，其中三萜皂苷具有顯著抗腫瘤、抗HIV等活性[3]，是朱砂根中重要的有效成分。朱砂根總皂苷抗腫瘤新藥現(xiàn)已進(jìn)入臨床研究階段，成為中國具有獨(dú)立知識(shí)產(chǎn)權(quán)的中藥二類口服抗癌新藥物[4]。高效液相色譜法測定朱砂根皂苷含量，結(jié)果表明，在天然野生朱砂根的根中含量遠(yuǎn)高于莖、枝和葉，可達(dá)5.6%；在組培苗植株中同樣是根的含量遠(yuǎn)高于莖和葉，為3.06%；在疏松愈傷組織和致密愈傷組織中分別為0.22%和0.058%[2]。

本試驗(yàn)采用朱砂根無菌實(shí)生苗的根、莖、葉、胚等不同器官為外植體進(jìn)行愈傷組織的誘導(dǎo)，采用香草醛-高氯酸比色法測定總皂苷含量，系統(tǒng)地比較了不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織皂苷成分的含量，篩選皂苷含量高的愈傷組織，為進(jìn)一步利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)進(jìn)行朱砂根有效成分的生產(chǎn)打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

市售朱砂根盆栽苗木（帶果實(shí)），室內(nèi)培養(yǎng)數(shù)周。

齊墩果酸標(biāo)樣購買于Sigma公司，其他試劑均為分析純。

1.2 朱砂根愈傷組織誘導(dǎo)

1.2.1 朱砂根無菌實(shí)生苗的準(zhǔn)備 采取當(dāng)年生長健壯、無病蟲害、成熟的朱砂根果實(shí)，先用自來水沖洗干凈，在無菌操作臺(tái)中用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡 30 s，無菌水沖洗2次，每次3 min，再用體積分?jǐn)?shù)0.1% HgCl2溶液浸泡 8 min，最后用無菌水沖洗3次，每次3 min，將種子接種于1/2MS培養(yǎng)基中，光照度1 500 lx，溫度25 ℃下經(jīng)30 d無菌萌發(fā)，獲得無菌實(shí)生苗。

1.2.2 不同外植體愈傷組織的培養(yǎng)

1）胚誘導(dǎo)愈傷組織：采取當(dāng)年生長健壯、無病蟲害、成熟的朱砂根果實(shí)，先用自來水沖洗干凈，在無菌操作臺(tái)中用體積分?jǐn)?shù)75%乙醇浸泡30 s后無菌水沖洗2次，每次3 min，再用體積分?jǐn)?shù)0.1% HgCl2溶液浸泡8 min 最后用無菌水沖洗3次，每次3 min，取胚接種于MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中，每瓶接種3個(gè)胚，在光照度1 500 lx，光照時(shí)間12 h/d，溫度25 ℃下經(jīng)60 d誘導(dǎo)成愈傷組織。

2）根、莖、葉誘導(dǎo)愈傷組織：將無菌實(shí)生苗，分別取根（盡量為根尖）長度為0.5～0.8 cm，每瓶接3塊；莖長度為0.5～0.8 cm，每瓶接3塊；葉大小為0.5 cm×0.3 cm左右，每瓶接3片。在MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L培養(yǎng)基中在光照度1 500 lx，光照時(shí)間12 h/d，溫度25 ℃下經(jīng)60 d誘導(dǎo)成愈傷組織備用。

1.3 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作

甲醇配制齊墩果酸母液1 mg/mL。分別取0.01～0.45 mL母液，50 ℃水浴蒸干，即取10～450 μg齊墩果酸，加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸，0.8 mL高氯酸，搖勻，70 ℃水浴反應(yīng)15 min，立即冰浴降溫終止反應(yīng)。然后加入5 mL乙酸乙酯搖勻，560 nm下測定吸光度，以齊墩果酸量（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，線性回歸得齊墩果酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 朱砂根愈傷組織皂苷含量的測定

1.4.1 愈傷組織干粉的準(zhǔn)備 選擇生長旺盛且沒有出現(xiàn)褐化的材料，置真空干燥箱中50 ℃烘干，時(shí)間約為7 h。將干燥后的愈傷組織研磨至粉末狀后，將4種愈傷組織粉末分別用封口袋密封保存，置于冰箱儲(chǔ)藏待用。

1.4.2 愈傷組織中皂苷的提取 分別取0.5 g 4種外植體誘導(dǎo)愈傷組織粉末，加入10 mL體積分?jǐn)?shù) 80%甲醇溶液，然后超聲輔助提取20 min，中間間隔10 min，再超聲提取20 min，取上清液。每種材料3個(gè)重復(fù)。

1.4.3 比色法測定朱砂根愈傷組織中皂苷的含量 分別取提取液溶液200 μL，50 ℃水浴蒸干。加入0.2 mL 5%香草醛冰乙酸，0.8 mL高氯酸，搖勻后，70 ℃水浴反應(yīng)15 min，立即冰浴降溫終止反應(yīng)。然后加入10 mL乙酸乙酯搖勻稀釋，靜置20 min，在波長為560 nm下測定吸光度。

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算朱砂根不同器官誘導(dǎo)的愈傷組織中皂苷含量，通過提取率計(jì)算胚、根、莖、葉中的總皂苷含量

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 朱砂根愈傷組織的誘導(dǎo)率

朱砂根的胚、根、莖、葉分別接種于培養(yǎng)基，20 d左右愈傷組織出現(xiàn)，并不斷長大，持續(xù)觀察至60 d，記錄20、40、60 d時(shí)的愈傷組織數(shù)量及誘導(dǎo)率，結(jié)果見表1。

從表1可以看出，試驗(yàn)所用培養(yǎng)基對于朱砂根莖和根誘導(dǎo)愈傷組織是較為適宜的，誘導(dǎo)率分別達(dá)到了91.7%和88.3%，對于胚和葉相對較低，誘導(dǎo)率分別為80.0%和76.7%。從不同培養(yǎng)時(shí)間誘導(dǎo)率來看，根前期誘導(dǎo)率較低，40 d時(shí)誘導(dǎo)率為4種外植體中最低的，但到60 d后誘導(dǎo)率可以達(dá)到88.3%，說明其愈傷組織的誘導(dǎo)需要較長時(shí)間。

2.2 不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織的長勢

分別記錄下各種愈傷組織在20、40、60 d時(shí)各個(gè)愈傷組織的長、寬、高。由于每種愈傷組織接種的瓶數(shù)較多，測量時(shí)隨機(jī)抽取5瓶，分別記錄下20、40、60 d的體積，采用SPSS分析胚、根、莖和葉之間的愈傷組織長勢差異，結(jié)果見表2。經(jīng)SPSS單因素方差分析及Duncan多重比較表明，20 d時(shí)生長量有顯著差異，其中根和莖誘導(dǎo)的愈傷組織顯著高于胚和葉；40 d時(shí)生長量有顯著差異，其中根顯著高于胚和葉，根與莖差異不顯著，莖與胚、葉差異不顯著；60 d時(shí)生長量無顯著差異。從統(tǒng)計(jì)結(jié)果可以看出，根與莖在培養(yǎng)前期生長較快，生長量顯著高于胚和葉，隨培養(yǎng)時(shí)間增加，到60 d后，生長量的差異減弱。

2.3 朱砂根愈傷皂苷含量的測定

2.3.1 齊墩果酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 以齊墩果酸（mg）為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，線性回歸得齊墩果酸含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=3.190 1x+0.012 2，R2=0.999 5。

2.3.2 朱砂根不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織中皂苷含量 不同外植體誘導(dǎo)的愈傷組織中皂苷含量測定經(jīng)SPSS方差分析和多重比較，結(jié)果見表2。結(jié)果表明，4種外植體誘導(dǎo)的愈傷組織中皂苷含量存在顯著差異，胚和根愈傷組織樣品粉末中的皂苷含量達(dá)到了24.07 mg/g和21.25 mg/g，顯著高于莖和葉愈傷組織樣品粉末中的皂苷含量，胚和根之間無顯著差異，而莖又顯著高于葉。朱砂根的胚和根誘導(dǎo)出來的愈傷組織皂苷含量較高，可以作為高皂苷含量愈傷組織誘導(dǎo)的外植體來源。

3 小結(jié)與討論

皂苷含量的測定方法包括生物學(xué)測定法和化學(xué)測定方法等。比色法的顯色反應(yīng)靈敏、操作簡單、成本低，同時(shí)也適合總皂苷的測定。本試驗(yàn)參考其他植物總皂苷含量的測定方法[5-11]，以齊墩果酸作為對照品，采用香草醛-冰乙酸-高氯酸比色法在560 nm測定朱砂根愈傷組織的皂苷含量。皂苷多易溶于熱水、熱乙醇、含水乙醇、熱甲醇等，但難溶于或不溶于乙醚、石油醚等極性較小的有機(jī)溶液。因而，提取溶劑局限于熱水、熱甲醇以及熱乙醇等，由于無水乙醇不能充分提取等原因，甄鏵等[2]分別用水、甲醇、乙醇為溶劑提取朱砂根皂苷。結(jié)果表明，甲醇和95%乙醇效果與水比較有明顯差異。綜合考慮本試驗(yàn)選擇了甲醇作為提取皂苷的溶劑。

本試驗(yàn)中采用的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS+2，4-D 2.0 mg/L+NAA 0.5 mg/L+6-BA 0.2 mg/L，是在參考了相關(guān)文獻(xiàn)[12-15]的基礎(chǔ)上選定的，取其中各種外植體誘導(dǎo)率都較高的2，4-D 2.0 mg/L，同時(shí)考慮到NAA和6-BA對愈傷組織誘導(dǎo)也有一定的作用，綜合考量選取了培養(yǎng)基配方。所采用的培養(yǎng)基對于朱砂根莖和根誘導(dǎo)愈傷組織是較為適宜的，誘導(dǎo)率分別達(dá)到了96.7%和88.3%，胚和葉的誘導(dǎo)率也能達(dá)到80.0%和76.7%。從不同時(shí)間誘導(dǎo)率變化來看，40 d時(shí)僅莖的誘導(dǎo)率相對較高，但到60 d時(shí)4種外植體的誘導(dǎo)率均較高，特別是根從40 d時(shí)的38.3%提高到88.3%，說明其愈傷組織的誘導(dǎo)可能需要較長時(shí)間。

從愈傷組織的生長量來看，20 d和40 d結(jié)果可以看到，根和莖誘導(dǎo)的愈傷組織生長量較大，但到了60 d時(shí)4種外植體誘導(dǎo)的愈傷組織生長量無顯著差異。綜合誘導(dǎo)率和生長速度來看，莖和根是愈傷組織來源的一個(gè)較好選擇。

從皂苷含量比較而言，朱砂根的胚和根誘導(dǎo)出來的愈傷組織皂苷含量較高，可以作為高皂苷含量愈傷組織誘導(dǎo)的外植體來源。綜合考量愈傷組織誘導(dǎo)率、生長量及皂苷含量，以根作為外植體誘導(dǎo)是獲得高皂苷含量細(xì)胞株一個(gè)較好的選擇。

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