一個新杉木纖維素合酶ClCesA基因的克隆與植物表達載體構建

魏曉驍, 王士亞, 陳瀟瀟, 汪鳳林, 曹光球, 曹世江

(1.福建農林大學林學院;2.國家林業(yè)局杉木工程技術研究中心，福建 福州 350002)

一個新杉木纖維素合酶ClCesA基因的克隆與植物表達載體構建

魏曉驍1,2, 王士亞1,2, 陳瀟瀟1,2, 汪鳳林1,2, 曹光球1,2, 曹世江1,2

(1.福建農林大學林學院;2.國家林業(yè)局杉木工程技術研究中心，福建 福州 350002)

為探索杉木木材形成的分子機制，以杉木嫩葉總RNA反轉錄的cDNA為模板，運用RT-PCR技術克隆出一個新杉木纖維素合酶基因ClCesA.該基因的開放閱讀框(ORF)為2 955 bp，共編碼984個氨基酸.通過TMHMM Server v.2.0和MEGA 5.1軟件預測ClCesA蛋白的跨膜結構和功能，發(fā)現(xiàn)該蛋白N端含有鋅指結構，共有8個跨膜結構，平均跨膜區(qū)域18個氨基酸殘基，并具有保守的DDDQXXLRW結構域.系統(tǒng)進化樹分析結果表明，ClCesA可能與細胞次生壁形成有關.熒光定量PCR分析表明，ClCseA基因在杉木的不同器官(根、莖、葉)中均有表達，但在杉木根中的表達含量最高，莖中次之，葉中最低.隨后，為后續(xù)該基因功能驗證提供基礎，將ClCesA克隆到含有GFP標簽和潮霉素抗性的pGWB506載體，構建植物過表達載體pGWB506-35S-ClCesA-GFP.

杉木; 纖維素合酶; 基因克隆; 表達分析; 載體構建

纖維素作為地球上最豐富的可再生資源，是木材次生木質部細胞壁的主要組成成分之一，約占木材干重的40%，是決定木材品質的重要因子之一.為此揭示植物纖維素生物合成機制對木材材質改良、木材定向培育都具有十分重要的意義.纖維素合酶(CesA)是纖維素生物合成的關鍵酶之一[1,2].研究表明，CesA基因通過在轉錄水平上對纖維素合成進行調控，對植物細胞壁發(fā)育起到重要作用[3-5].美國密西根大學在2000年初次從歐洲顫楊(Populustremuloides)中克隆得到林木的纖維素合酶基因PtrCesA1[6]，并且研究發(fā)現(xiàn)該基因主要在植物莖中表達，表達高峰期主要出現(xiàn)在次生壁形成期間.此后，在毛果楊(Populustrichocarpa)[7]、大青楊(Populusussuriensis)[8]、松樹(Pinusradiata)[9]、苧麻(Boehmerianivea)[10]、桉樹(Eucalyptus)[11]、馬尾松(Pinusmassoniana)[12]、杉木(Cunninghamialanceolata)[13]、毛竹(Phyllostachysedulis)[14]等木本植物中都陸續(xù)克隆分離出CesA基因，其中毛果楊中鑒定出18個CesA基因[7]，雜交楊(Populustremula(L)×P.tremuloides)中鑒定出10個CesA基因，綠竹(Bambusabambusaoldhami)中鑒定出8個CesA基因[14].這些基因共同構成了林木的纖維素合酶基因家族.對ClCesA基因功能的研究結果表明，PtrCesA1、PtrCesA2、PtrCesA3這3個基因可能組成同一個纖維素合成酶復合體，共同完成楊樹次生壁的合成[15]；而PtrCesA4、PtrCesA5、PtrCesA7這3個基因可能與初生壁的形成有關[16].在毛果楊中，PtCesA4、PtCesA5、PtCesA7、PtCesA8、PtCesA17和PtCesA18在木質部特異高表達[17].Song et al[18]通過研究楊樹的纖維素合酶發(fā)現(xiàn)，楊樹的木質部細胞膜上至少具有2種纖維素合酶復合體，復合體Ⅰ由CesA4、CesA7、CesA8、CesA17和CesA18組成，參與細胞次生壁的合成；復合體Ⅱ由CesA3、CesA10、CesA11、CesA13、CesA15和CesA16組成，參與細胞初生壁和次生壁的合成.

杉木作為中國南方重要的速生用材樹種之一，用途非常廣泛.近幾年，與杉木材性相關的分子機制研究取得一定進展[19,20]，而有關杉木的纖維素生物合成分子機制的研究報道甚少.彭沙沙等[21]克隆了杉木纖維素合成酶類似蛋白ClCslD1；而龐景等[13]克隆了杉木纖維素合成酶基因CesA，通過將本研究克隆出的基因ClCseA與龐景等克隆的CesA基因的DNA和蛋白序列進行比較，發(fā)現(xiàn)2個基因在核苷酸的編碼區(qū)有11處位點存在差異，分別為773、821、1 249、1 537、1 545、1 554、2 166、2 436、2 580、2 823、2 856位點；在氨基酸的編碼區(qū)序列也發(fā)現(xiàn)3處位點存在差異，分別為258、274、513位點.由于杉木基因組測序未完成，關于杉木纖維素合成酶基因家族的數(shù)量、各個基因的確切功能，以及各基因間的相互作用關系均不清楚.雖然克隆出的2個基因存在相似性，但也存在差異，有可能為2個不同的基因.關于基因的功能尚需進一步驗證.探索杉木中纖維素合酶基因家族的功能，特別是相關次生細胞壁形成的纖維素合酶基因，對于利用現(xiàn)代分子生物學手段改良杉木木材品質具有重要意義.本研究以杉木三代種子園種子發(fā)育植株為材料，利用RT-PCR技術分離克隆出1個新的杉木ClCesA基因，長度為2 955 bp，編碼984個氨基酸；同時進行了生物信息學分析以及不同器官表達情況的研究；采用Invitrogen公司的gateway特異性位點重組技術將ClCesA基因構建到植物表達載體中，以期為進一步的功能解析提供依據(jù)，同時也為杉木材性的改良提供重要的基因資源.

1 材料與方法

1.1 材料收集與RNA提取

試驗材料由國家林業(yè)局杉木工程技術研究中心提供，為杉木種子發(fā)育而成的杉木幼苗.取長勢好的杉木幼嫩葉片組織0.2 g，按照TIANGEN公司的總RNA提取試劑盒操作說明書提取杉木總RNA，通過1%(質量分數(shù))的瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計Nanodrop分別檢測樣品的RNA質量及濃度.

1.2ClCesA基因克隆與序列分析

利用NCBI網(wǎng)上的GenBank數(shù)據(jù)庫查詢到已知杉木的DNA序列，采用gateway技術設計特異引物(表1).取檢測合格的杉木總RNA，利用TIANScript cDNA第一鏈合成試劑盒進行第1條鏈cDNA的合成.合成的cDNA稀釋10倍后進行PCR反應，具體反應體系見表2.反應程序為：95 ℃預變性3 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火3 min，72 ℃延伸3 min，共30循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min.擴增后的產物經1%(質量分數(shù))的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，通過BP連接到pDONR207載體上，熱激轉化到大腸桿菌DH-5α感受態(tài)細胞，進行Gen抗性篩選.選取單菌落做菌落PCR，將檢測為陽性的菌落進行液體LB過夜培養(yǎng)，使用天根質粒試劑盒提取質粒，并送鉑尚生物公司進行全長測序.利用實時熒光定量PCR儀研究ClCesA基因在不同組織的表達情況.qPCR擴增試劑為SYBR Premix Ex Taq，采用的熒光染料為SYBR GreenⅠ，以杉木EF1α基因作為內參基因.在進行qCR分析前，先使用普通PCR檢測體系的反應條件，如退火溫度、模板量等，并將PCR產物進行測序，以保證qPCR結果的準確性.

表1 基因克隆及q-PCR反應中所用引物序列Table 1 Primers used in gene cloning and q-PCR reaction

1.3 植物表達載體的構建

表2 PCR反應體系Table 2 Reaction System of PCR

使用Gateway BP反應試劑盒，將回收帶有attB位點的ClCesA基因PCR產物與入門載體pDONR207在室溫下進行BP反應1 h.反應體系為：PCR產物0.6 μL，入門載體0.4 μL，BP酶0.25 μL.隨后將反應產物全部轉化到E.coliTrans 5α感受態(tài)細胞，涂布于含Gen(50 mg·L-1)的LB平板；次日隨機挑選陽性克隆搖菌并提取質粒，經PCR檢測驗證正確后進行測序，即可獲得入門克隆載體pDONR207-ClCesA.參考Gateway LR反應試劑盒的操作說明書，將入門載體與目的載體pGWB506進行LR反應，室溫25 ℃，反應后轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，并涂布于LB平板(含50 mg·L-1潮霉素)，37 ℃培養(yǎng)過夜.次日挑單菌落，搖菌后用試劑盒提取質粒，經PCR檢測載體構建的正確性，并進行測序驗證.

1. 4 纖維素合酶基因的序列分析

在DNAMAN V6軟件上設計引物；通過Vecter NTI軟件進行序列比對；在TMHMM Server v.2.0軟件上進行蛋白質結構分析；運用MEGA 5.1軟件通過鄰接法構建不同植物的基因進化樹；采用Microsoft Excel 2007軟件對基因表達進行作圖.

2 結果與分析

2.1 杉木總RNA提取

杉木葉片總RNA經1%(質量分數(shù))瓊脂糖凝膠電泳，結果見圖1.從圖1可以看出，RNA條帶完整，28 S rRNA和18 S rRNA 2條主帶明顯，28 S rRNA的亮度約為18 S rRNA的2倍，且無DNA污染.采用超微量分光光度計進行濃度測定和質量分析、檢測，結果顯示，樣品總RNA濃度為231 μg·μL-1，D260 nm/D280 nm=1.86，其濃度與質量均滿足反轉錄的要求，可用于后續(xù)試驗.最后，將總RNA樣品置于-80 ℃冰箱保存.

2.2 擴增產物的堿基序列測定與分析

取上述總RNA，采用天根公司的逆轉錄酶試劑盒獲得cDNA，通過RT-PCR反應得到1個約3 000 bp的產物(圖2)，將該產物連接到pDONR207載體且轉化DH-5α，挑取陽性克隆測序.測序結果顯示該序列與CesA基因的同源性很高，并含有保守結構域.其氨基酸序列及結構如圖3所示.

2.3 蛋白質跨膜結構的預測

從圖4可以看出，新的ClCesA蛋白具有8個跨膜區(qū)，分別為175～197、204～223、760～782、794～816、831～853、878～900、910～932、945～964，最大跨膜區(qū)域為22個氨基酸殘基，最小跨膜區(qū)域為12氨基酸殘基，平均跨膜區(qū)域為18個氨基酸殘基.

2.4 基因序列系統(tǒng)發(fā)生樹

本研究運用MEGA 5.1軟件構建系統(tǒng)進化樹，將克隆到的杉木ClCesA基因編碼區(qū)與擬南芥(Arabidopsisthaliana, At)、顫楊(P.tremuloides, Ptr)、歐洲山楊×顫楊(Populustremula×P.tremuloides, Ptt)、火炬松(PinustaedaL., Pt)、銀灰楊(Populuscanescens(Ait.) Smith, Pca)、毛白楊(PopulustomentosaCarrière, Pto)的初生壁和次生壁形成的CesA基因進行系統(tǒng)進化樹分析.初生壁有關基因有AtCesA1(O48946)、AtCesA2(O48947)、AtCesA5(Q8L778)、AtCesA9(Q9SJ22)、PtrCesA7(AAO25581)、PttCesA2(AAT09895)、PtrCesA4(AAO25536)、PtrCesA6(AAP40636).次生壁有關基因有PtCesA1(AAX18647)、PtCesA2(AAX18648、PtCesA3(AAX18649)、PtrCesA2(AAM26299)、PtrCesA7(AAO25581)、PtrCesA3(AAQ08987)、PcaCesA1(AAC78476)、PttCesA1(AAT09894)、PttCesA3-1(AAT09896)、PttCesA3-2(AAT09897)、AtCesA4(Q84JA6)、AtCesA8(Q8LPK5)、PtoCesA1(AAY21910).從圖5可以看出ClCesA分布在次生壁較密集的分支，且與杉木ClCesA1在一個小分支，說明兩者的親緣關系較近，可能執(zhí)行類似的功能，由此推測ClCesA基因可能與次生壁合成有關.

圖1 杉木幼苗總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 Agarose gel of total RNA extracted from seedling of Chinese fir

圖4 杉木ClCesA蛋白氨基酸序列跨膜區(qū)域預測Fig.4 Prediction on trasmembrane domains of amino acids of ClCesA

2.5ClCesA基因在不同組織的表達

杉木纖維素合酶基因在不同器官表達情況的分析結果(圖6)顯示，杉木的根、莖、葉3個器官均有纖維素合酶基因表達，而且相對表達量在杉木根中最高，莖中次之，葉中最低.因此，可以推測ClCesA基因與杉木木材生長發(fā)育的調控有著密切關系.

圓圈代表與次生細胞壁有關的基因；三角形代表與初生細胞壁有關的基因.

圖6 不同器官中ClCesA基因的相對表達量Fig.6 Relative expressions of ClCesA gene in different organs

2.6 植物過表達載體的構建

將檢測正確的入門載體pDONR207-ClCesA和目的載體pGWB506進行LR反應，獲得植物表達載體pGWB506-35S-ClCesA-GFP，載體構建策略如圖7所示.使用特異性的載體引物和基因特異性引物做菌落PCR，擴增出1 000 bp的片段(圖8)，表明LR反應成功.重組質粒的測序結果顯示，ClCesA并未產生突變，并且和原序列相同，說明本試驗的植物表達載體連接正確.

圖7 植物表達載體pGWB-35S-ClCesA-GFP的構建策略Fig.7 Construction strategy of vector pGWB-35S-ClCesA-GFP

3 討論

圖8 菌落PCR反應Fig.8 Colony PCR reaction

通過序列比對與分析，Pear et al[22]首先從棉花中克隆得到與細菌CelA基因同源的纖維素合酶基因GhCesA1、2.通過基因組學分析研究，Richmond et al[23]得到了擬南芥基因組中的10個CesA基因的蛋白質序列結構特點.Suzuki et al[17]分析了楊樹基因組的18個CesA基因的結構特點.目前為止，研究發(fā)現(xiàn)CesA基因編碼的蛋白質有著相類似的結構，共有8個跨膜結構域， N端有2個， C端有6個.1個鋅指結構域在N端，可能和蛋白質之間的相互作用有關.CesA蛋白都含有較典型的結構如DDDQxxRW(天冬氨酸、天冬氨酸、天冬氨酸、谷氨酞胺-x-x精氨酸—色氨酸)[24].通過對CesA基因功能的研究，已陸續(xù)鑒定出與初生壁和次生壁形成相關的基因.在歐洲顫楊中，PtrCesA1、PtrCesA2、PtrCesA3可能形成一個纖維素合成酶復合體，共同完成楊樹次生壁的合成[15,24]，而PtrcesA4、PtrCesA5、PtrCesA7可能與初生壁的形成有關[16].本研究克隆到一個新杉木ClCesA基因，通過系統(tǒng)進化樹，該基因與聚類在一個進化分支并在根中表達量最高，推測該基因可能參與植物次生細胞壁的形成.而龐景等克隆到的2個CesA基因，ClcesAl與PtrCesAl的同源性最高；ClCesA2與ZmCesA2聚類在一起，兩者在莖中高度表達.本研究中所用材料為培養(yǎng)30 d左右的杉木種子萌發(fā)而成的幼苗，而龐景所用的杉木材料為1年生杉木幼苗，且纖維素合酶CesA在植物不同發(fā)育階段、不同器官中的表達量不同，所以這可能是造成ClCesA在杉木器官中表達量不同的原因.植物中除了CesA基因外，還有類纖維素合酶(cellulose synthase-like, CSL)基因家族參與纖維素的生物合成.擬南芥CSL蛋白有9個家族，分別為CSL(A/B/C/D/E/F/G/H/J)[25]；在基因序列上，CSL基因與CesA基因具有部分同源，主要參與各種β-聚糖鏈的合成[23,25].彭莎莎等[21]也從杉木中克隆到了CSL基因，并分析其序列結構特點.

[1] KUMAR M, TURNER S. Plant cellulose synthesis: CESA proteins crossing kingdoms[J]. Phytochemistry, 2015,112:91-99.

[2] KAUR S, DHUGGA K, GILl K. Novel structural and functional motifs in cellulose synthase (CesA) genes of bread wheat (TriticumaestivumL.)[J]. PLoS ONE, 2016,11(1):e0147046.

[3] DESPREZ T, JURANIEC M, CROWELLE E F. Organization of cellulose synthase complexes involved in primary cell wall synthesis inArabidopsisthaliana[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 2007,104(39):15 572-15 577.

[4] TAYLOR N G. Cellulose biosynthesis and deposition in higher plants[J]. New Phytologist, 2008,178(2):239-252.

[5] TANAKA K, MURATA K, YAMAZAKI M. Three distinct rice cellulose synthase catalytic subunit genes required for cellulose synthesis in the secondary wall[J]. Plant Physiology, 2003,133(1):73-83.

[6] WU L, JOSHI C P, CHIANG V L. A xylem-specific cellulose synthase gene from aspen (Populustremuloides) is responsive to mechanical stress[J]. The Plant Journal, 2000,22(6):495-502.

[7] DJERBIJ S, LINDSKOG M, ARVESTAD L. The genome sequence of black cottonwood (Populustrichocarpa) reveals 18 conserved cellulose synthase (CesA) genes[J]. Planta, 2005,221(5):739-746.

[8] 許雷,劉一星,方連玉.大青楊纖維素合成酶PuCesA6基因cDNA的克隆及序列分析[J].西南林業(yè)大學學報,2012,32(5):26-32.

[9] KRAUSKOPF E, HARRIS P J, PUTTERILL J. The cellulose synthase genePrCESA10 is involved in cellulose biosynthesis in developing tracheids of the gymnospermPinusradiata[J]. Gene, 2005,350(2):107-116.

[10] 劉昱翔,陳建榮,彭彥,等.苧麻纖維素合成酶基因BnCesA4 cDNA序列的克隆與表達分析[J].作物研究,2014,28(5):472-478.

[11] RANIK M, MYBURG A A. Six new cellulose synthase genes fromEucalyptusare associated with primary and secondary cell wall biosynthesis[J]. Tree Physiology, 2006,26(5):545-556.

[12] 阮維程,潘婷,季孔庶.馬尾松纖維素合成酶基因PmCesA1的克隆及其分析[J].分子植物育種,2015,13(4):861-870.

[13] 龐景,童再康,黃華宏,等.杉木纖維素合成酶基因CesA的克隆及表達分析[J].浙江農林大學學報,2015,32(1):40-46.

[14] 鄧小波,胡尚連,曹穎,等.綠竹與毛竹纖維素合成酶(CesA)的生物信息學分析[J].福建林學院學報,2011,31(1):84-90.

[15] SAMUGA A, JOSHI C P. Cloning and characterization of cellulose synthase-like gene,PtrCSLD2 from developing xylem of aspen trees[J]. Physiologia Plantarum, 2004,120(4):631-641.

[16] KALLURI U C, JOSHI C P. Differential expression patterns of two cellulose synthase genes are associated with primary and secondary cell wall development in aspen trees[J]. Planta, 2004,220(1):47-55.

[17] SUZUKI S, LI L, SUN Y H. The cellulose synthase gene superfamily and biochemical functions of xylem-specific cellulose synthase-like genes inpopulustrichocarpa[J]. Plant Physiology, 2006,142(3):1 233-1 245.

[18] SONG D, SHEN J, LI L. Characterization of cellulose synthase complexes inPopulusxylem differentiation[J]. New Phytologist, 2010,187(3):777-790.

[19] 蔣向輝,佘朝文,許棟,等.杉木CCoAOMT基因部分cDNA克隆與序列分析[J].中南林業(yè)科技大學學報,2009,29(6):24-28.

[20] 呂運舟,鄭佳,陳金慧,等.參與杉木次生壁合成調控的轉錄因子ClMYB4的克隆及在大腸桿菌中表達[J].分子植物育種,2012,10(5):512-519.

[21] 彭沙沙,童再康,黃華宏,等.杉木纖維素合成酶類似蛋白基因ClCslD1的克隆及其生物信息學分析[J].浙江農林大學學報,2012,29(1):1-6.

[22] PEAR JR, KAWAGOE Y, SCHRECKENGOET W E. Higher plants contain homologs of the bacterialcelAgenes encoding the catalytic subunit of cellulose synthase[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences, 1996,93(22):12 637-12 642.

[23] RICHMOND T A, SOMERVILLE C R. The cellulose synthase superfamily[J]. Plant Physiology, 2000,124(2):495-498.

[24] SAMUGA A, JOSHI CP. A new cellulose synthase gene (PtrCesA2) from aspen xylem is orthologous toArabidopsisAtCesA7 (irx3) gene associated with secondary cell wall synthesis[J]. Gene, 2002,296(1):37-44.

[25] LIEPMAN A H, CAVALIER D M. The cellulose synthase-like A and cellulose synthase-like C families: recent advances and future perspectives[J]. Front Plant Sci, 2012,3(109):1-7.

(責任編輯:葉濟蓉)

Cloning of a newClCesAgene ofCunninghamialanceolataand plant expression vector construction

WEI Xiaoxiao1,2, WANG Shiya1,2, CHEN Xiaoxiao1,2, WANG Fenglin1,2, CAO Guangqiu1,2, CAO Shijiang1,2

(1.College of Forestry, Fujian Agriculture and Forestry University; 2.Chinese Fir Engineering, Technology Research Center under State Forestry Administration, Fuzhou, Fujian 350002, China)

In order to explore the molecular mechanism of Chinese fir wood formation, total RNA was extracted from Chinese fir new leaves and cDNA was synthesized. A newClCesAwas cloned using RT-PCR. The length of open reading frame ofClCesAis 2 955 bp, with 984 amino acids. Based on TMHMM Server v. 2.0 and MEGA5.1 software,ClCesAproteins consist of 8 across-membrane structures, with average 18 amino acid residues and zinc finger in N end. Also, a conservative DDDQXXLRW structure domain was found inClCesAprotein. Phylogenetic tree analysis showed thatClCesAmay be associated with secondary cell wall formation. The fluorescent quantitative PCR analysis showed thatClCesAcan be expressed in organs of root, stem and leaf in Chinese fir, with the highest expression in the root and the least in leaf. Lastly, a plant overexpression vector pGWB506-35s-ClCesA-GFP was successfully constructed from pGWB506 vector which contains GFP tag and hygromycin resistance gene by Gateway technology.

Cunninghamialanceolata; cellulose synthase; gene cloning; expression analysis; vctor construction

2016-07-03

2016-09-20

福建農林大學校重點建設項目(6112C039B);福建農林大學林學院青年基金項目(k13xjj02a).

魏曉驍(1990-)，女，碩士研究生.研究方向:森林培育理論與技術.Email：695194330@qq.com.通訊作者曹世江(1984-)，男，講師,博士.研究方向:樹木遺傳育種教學與科研.Email:379612064@qq.com.

Q785; S791.27

A

1671-5470(2017)01-0066-07

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.01.011