一種通用高效液相色譜測定植物葉片內源激素水楊酸的方法

林文芳, 張 虹, 洪莊玉, 繆 穎, 林文雄

(福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002)

一種通用高效液相色譜測定植物葉片內源激素水楊酸的方法

林文芳, 張 虹, 洪莊玉, 繆 穎, 林文雄

(福建農林大學生命科學學院，福建 福州 350002)

以3-羥基-苯甲酸為內標，利用甲醇提取擬南芥葉片水楊酸，然后用三氯乙酸和鹽酸溶解，再用乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1)萃取濃縮，高效液相色譜法測定.結果表明流動相0.2 mol·L-1醋酸鈉∶甲醇(9∶1)pH為6.0時，水楊酸獨立出峰，分離效果最好.用水稻及水仙葉片驗證該提取及測定方法，效果良好，說明該方法在植物中具有一定的通用性.

水楊酸; 高效液相色譜; 3-HBA; 植物葉片

水楊酸(salicylic acid, SA)是廣泛存在于植物體內的一類小分子酚類物質.它在植物新陳代謝、生長發(fā)育過程和免疫應答中發(fā)揮重要作用[1-3].同時作為天然信號因子，SA提高許多植物的生物及非生物脅迫抗性[4]，例如臭氧脅迫[5]、UV-B脅迫[6]、干旱脅迫[7]、冷害[8]、鹽和滲透壓脅迫[9]，提高重金屬耐受性[10]等.準確測定植物的SA含量是深入研究其功能的必要前提.但是，SA在植物體內含量甚微，長期以來，為了探索出靈敏準確且簡單易行的測定方法，國內外學者做了很多研究.

早期，基于專一抗體的放射免疫法和酶聯(lián)免疫法常被用于激素的測定，這兩種方法對激素提取液的純度要求不高，但準確性低，重復性差[11].高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)及氣相色譜質譜聯(lián)用儀(gas chromatograph-mass spectrometer, GC-MS)是目前測定SA的兩種常用方法[12-15].GC-MS主要用于定性定量分析沸點較低、熱穩(wěn)定性好的化合物。GC-MS測定SA時需經過甲基化、吸附劑吸附、有機溶劑洗脫提純后再測試[15-16]，增加了試驗的復雜性，且大批量檢測會隨著有機溶劑的揮發(fā)出現(xiàn)較大誤差。 HPLC作為一種高效分離純化技術，靈敏度高、專一性強、重復性好，被廣泛用于植物激素測定(乙烯除外)[17-20].由于SA自發(fā)熒光，HPLC熒光檢測SA具有靈敏度高、分離效果好，檢出限低等優(yōu)點，是應用最廣泛的SA測定方法，而國內外學者也針對樣品研究更合適的提取及測試技術.

本試驗以雙子葉模式植物擬南芥為供試材料，探討以3-羥基-苯甲酸(3-hydroxy benzoic acid, 3-HBA)[14,21]為內標提取擬南芥葉片中的SA 及HPLC測定SA的最佳條件，以單子葉模式植物水稻及葉片中次生物質較多的水仙作為供試材料，驗證本方法的適用性，以構建植物通用的SA提取及測定方法.

1 材料與方法

1.1 材料

擬南芥種植于蛭石小缽中，在人工氣候室條件下培養(yǎng)(恒溫22 ℃，晝夜時長比13/11).用0.1%花多多澆灌.取材部位為蓮座葉時期的葉片，每份樣品取3株擬南芥混合，重復3次.液氮速凍后移至-80 ℃冰箱待用.水稻室外土培，種子萌發(fā)后苗期用Hoagland[22]營養(yǎng)液培育，移栽入土后施復合肥；水仙采用室內沉淀過夜后的自來水水培.

1.2 植物葉片水楊酸提取

參考Verberne et al建立的方法[18]：在液氮條件下充分研磨葉片，取少量轉入2 mL離心管(如無特別說明，本試驗所用的離心管規(guī)格均為2 mL)，準確稱量并記錄每管樣品重量(精確到0.000 1g)，3個重復.多余干粉存于-80 ℃冰箱.每個離心管加入1 mL 90%甲醇，并加入內標3-HBA(Sigma-Aldrich，USA)，渦旋1 min后，超聲5 min，4 ℃下、12000 rpm離心5 min.轉移上清液到新的離心管，下層沉淀加入0.8 mL甲醇，重復上述操作，混合兩次上清液.在混合上清液中加入10 μL 0.2 mol·L-1的NaOH溶液，在真空離心濃縮儀上濃縮，待離心管中剩下約10 μL液體時加入250 μL 5%TCA，渦旋1 min；再加入0.8 mL乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1)，渦旋1 min，充分萃取，4 ℃下、12000 rpm離心5 min，轉移上層有機相到新的離心管；于下層水相中加入0.3 mL 8 mol·L-1HCl，放入80 ℃水浴鍋溫育1 h，讓結合態(tài)SA充分被HCl提取.溫育結束后于離心管中加入0.8 mL乙酸乙酯：環(huán)己烷(1∶1)，重復上述操作，混合兩次上層有機相.混勻后加入60 μL流動相 0.2 mol·L-1醋酸鈉水溶液，真空干燥濃縮，待離心管中剩下約60 μL液體時取出加入940 μL 流動相醋酸鈉水溶液，渦旋1 min，讓其充分溶解于流動相.通過0.22 nm水相濾膜過濾至進樣瓶，存于4 ℃冰箱待測.

1.3 回收率測定

相較于以往SA的HPLC和GC-MS檢測，SA的提取回收率只有 25%～73%[12,23-25]，而Verberne et al[18]方法自由態(tài)SA的回收率能達到71%～91%，結合態(tài)SA回收率能達到65%～79%，本試驗按照其方法測定關鍵提取步驟回收率.

1.3.1 蒸發(fā)測試 離心管中加入1.5 mL 90%甲醇、2 μL 1 μg·μL-1SA 標準樣品、2 μL 10 μg·μL-13-HBA，混勻后加入10 μL 0.2 mol·L-1的NaOH后于真空濃縮干燥儀上濃縮，剩余10 μL溶液時加入1 mL流動相，HPLC測定分析，重復3次.

1.3.2 升華測試 離心管中加入1.5 mL乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1)、2 μL 1 μg·μL-1SA 標準樣品、2 μL 10 μg·μL-13-HBA.混勻后加入60 μL醋酸鈉水溶液后放入真空濃縮干燥儀上濃縮，剩60 μL時加入940 μL流動相，用HPLC檢測SA及3-HBA，重復3次.

1.3.3 SA和3-HBA回收測試 取2 μL 1 μg·μL-1SA、2 μL 10 μg·μL-13-HBA按照上述水楊酸提取過程操作，提取后過濾至進樣瓶待檢，做3個平行.

1.4 高效液相色譜測定水楊酸方法的優(yōu)化

本試驗采用日本島津的高效液相色譜(LC-20A)，島津inertsil ODS-3液相色譜柱(5 μm，4.6 mm×150 mm)，熒光檢測器(RF-20A)檢測.根據Verberne et al[18]設定測定參數(shù)：流動相0.2 mol· L-1醋酸鈉(pH 5.5)∶甲醇=9∶1，流速0.8 mL·min-1，恒溫40 ℃，20 μL進樣.SA檢測波長λex/λem=305 nm/407 nm.分別調整醋酸鈉水溶液比例為85%及pH為5.65、5.75、6.0進行HPLC測定，確定最適檢測條件.流動相醋酸鈉水溶液用6 mol·L-1的 HCl和1 mol·L-1的NaOH水溶液調節(jié)相應pH，定容.

凡音樂材料來自劇種主調的單節(jié)型過腔，即為單節(jié)型主調性過腔。如“昆南”陽入聲字“月”的唱調（《白兔記·養(yǎng)子》【鎖南枝】“星月朗”，670），該單字唱調的過腔是該過腔的音樂材料來自“昆南”主調，故謂之單節(jié)型主調性過腔。

1.5 SA及3-HBA標準曲線及3-HBA回歸曲線的制作

SA和3-HBA分別溶解在50%甲醇中配成母液備用.SA按照0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1、5 μg·mL-1濃度梯度，3-HBA按照0.2 、1、2、4、10、20、100 μg·mL-1濃度梯度制作標準曲線，重復3次.分別將5、10、20、50、100 μg·mL-1的3-HBA加入擬南芥干粉提取SA，測定3-HBA的含量，制作回歸曲線，重復3次.根據檢測得到的SA與3-HBA數(shù)值確定內標使用量.

1.6 其他植物水楊酸提取及測定

水稻及水仙按照上述方法進行水楊酸的提取及測定，檢驗該方法的通用性.

2 結果與分析

2.1 回收率測定

由表1可得，甲醇蒸發(fā)試驗中SA和3-HBA的回收率均在85%以上且較相近，說明甲醇適用于SA的提取.乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1)升華試驗中兩者的回收率范圍為80%～90%，說明乙酸乙酯∶環(huán)己烷(1∶1)適用于SA的提取及其內標的萃取.回收試驗中二者回收率高且相近，說明此提取方案對SA和3-HBA損失小，可行性高，同時證實3-HBA適合作為SA含量測定時的內標.

表1 SA和3-HBA的回收率1)Table 1 Recovery of SA and 3-HBA

1)所有數(shù)值為平均值±標準差.

2.2 流動相最佳pH值的確定

通常認為SA測定時，流動相0.2 mol·L-1醋酸鈉的最佳pH值為5.5[19,26].在本試驗中，當pH值為5.5時，SA峰在后半段有1個凸起，推斷是相鄰2個峰疊加(圖1A)；內標3-HBA與相鄰的物質疊加在一起，無法很好地分開.因峰疊加無法準確計算峰面積比例，即待測物的含量 .因此本試驗對流動相的比例及pH進行調整.

A和C-F:流動相分別為醋酸鈉(pH 5.5、5.65、5.75、6.0、6.0)∶甲醇=9∶1；B：流動相為pH 5.5醋酸鈉∶甲醇=85∶15圖1 流動相醋酸鈉水溶液在不同pH條件下SA的HPLC檢測圖Fig.1 HPLC detection images of SA in sodium acetate under different pH

2.3 SA、3-HBA標準曲線及3-HBA回歸曲線

由圖2可得，SA和3-HBA標準曲線的R值性在0.999以上，線性關系好.3-HBA回歸曲線的R值也達到0.999以上，說明內標3-HBA不受植物本身物質及提取過程的影響，表明提取方案及內標選擇的可行性.同時對比測得的SA與3-HBA含量，確定最適內標含量為20 μg·mL-1.

A:3-HBA標準曲線；B:SA標準曲線C:3-HBA回歸曲線.圖2 3-HBA、SA標準曲線及3-HBA回收曲線Fig.2 Standardization curve of 3-HBA and SA and recovery curve of 3-HBA

2.4 其他植物水楊酸含量的測定

按照以上優(yōu)化后的條件,分別以醋酸鈉pH 5.75和6.0對水仙及水稻葉片進行SA的提取及測定，檢測結果如圖3.

流動相為醋酸鈉∶甲醇(9∶1)時水稻(A和B)和水仙(C和D)葉片SA檢測HPLC圖.圖3 水稻和水仙葉片SA的HPLC檢測圖Fig.3 HPLC detection image of SA in rice and narcissus leaf

從圖3看出，在水稻葉片中SA含量高，在水仙葉片中SA含量幾乎檢測不到，同時可以看出二者檢測物與擬南芥相比比較單一，而且流動相醋酸鈉pH為5.75或6.0時3-HBA和SA都顯示為單峰，2個pH值都適合.這提示我們可以根據不同植物的提取物對流動相pH進行微調以獲得最佳條件.

3 討論

3.1 樣品制備

濃縮蒸發(fā)是樣品制備的重要環(huán)節(jié).在濃縮過程中加入適量適當pH值的緩沖液，對保護SA在濃縮過程中不被破壞有一定作用；否則樣品干燥后會隨著放置時間延長，回收率逐漸降低甚至降至30%[18].本試驗在濃縮過程中分別加入NaOH和醋酸鈉水溶液檢測獲得的3-HBA和SA的回收率高，重復性好.

此外，性質穩(wěn)定、檢測波長與待測物質相近，且不受提取條件及植物自身物質的影響是內標選擇的基本要求.鄰甲氧基苯甲酸和3,4-HBA也可作為SA測定時的內標[18,25]，但鄰甲氧基苯甲酸的重復性較差，3,4-HBA的回收率低于SA[18].本試驗采用的3-HBA和SA的回收率接近，回收曲線線性關系好，說明3-HBA不受提取過程及葉片自身提取物影響，適合作為SA的內標.

3.2 高效液相色譜檢測條件的優(yōu)化

色譜條件的選擇對檢測圖譜的分析很重要.流動相對色譜峰圖影響比較大，不合適的流動相導致色譜圖峰形不好且拖尾嚴重，流動相的比例和種類應根據色譜柱的分離對象和檢測器的情況綜合考慮，盡可能地增大流動相和固定相的極性差別以得到最好的分離效果[26].流動相的pH影響分離效果，過酸將導致出峰錯誤，峰形不好，不同pH對準確區(qū)分各類物質尤其是待測物意義重大，本研究針對性地討論不同pH流動相對SA檢測的影響.

試驗結果表明，流動相pH為6.0時擬南芥葉片SA檢測效果最好；pH的改變對內標3-HBA的檢測影響較大，對于SA影響較??；流動相pH為5.65～6.0時都能較好地分離SA.優(yōu)化后的方法同時適用于水稻、水仙葉片SA檢測，水稻、水仙葉片提取物檢測到的峰圖比較簡單，流動相pH值的影響比較小，說明可針對不同樣品及內標，調整流動相pH以獲得最佳檢測效果.

[1] KAWANO T, BOUTEAU F. Crosstalk between intracellular and extracellular salicylic acid signaling events leading to long-distance spread of signals[J]. Plant Cell Rep, 2013,32(7):1 125-1 138.

[2] AN C, MOU Z. Salicylic acid and its function in plant immunity[J]. J Integr Plant Biol, 2011,53(6):412-428.

[3] RIVAS-SAN VICENTE M, PLASENCIA J. Salicylic acid beyond defence: its role in plant growth and development[J]. J Exp Bot, 2011,62(10):3 321-3 338.

[4] HAYAT Q, HAYAT S, IRFAN M, et al. Effect of exogenous salicylic acid under changing environment: a review[J]. Environ Exp Bot, 2010,68(1):14-25.

[5] KOCH J R, CREELMAN R A, ESHITA S M, et al. Ozone sensitivity in hybrid poplar correlates with insensitivity to both salicylic acid and jasmonic acid. The role of programmed cell death in lesion formation[J]. Plant Physiol, 2000,123(2):487-496.

[6] NAWRATH C, HECK S, PARINTHAWONG N, et al. EDS5, an essential component of salicylic acid-dependent signaling for disease resistance in Arabidopsis, is a member of the MATE transporter family[J]. Plant Cell, 2002,14(1):275-286.

[7] CHINI A, GRANT J J, SEKI M, et al. Drought tolerance established by enhanced expression of the CCI-NBS-LRR gene, ADR1, requires salicylic acid, EDS1 and ABI1[J]. The Plant Journal, 2004,38(5):810-822.

[8] KANG H M, SALTVEIT M E. Chilling tolerance of maize, cucumber and rice seedling leaves and roots are differentially affected by salicylic acid[J]. Physiologia Plantarum, 2002,115(4):571-576.

[9] BORSANI O, VALPUESTA V, BOTELLA M A. Evidence for a role of salicylic acid in the oxidative damage generated by NaCl and osmotic stress inArabidopsisseedlings[J]. Plant Physiology, 2001,126(3):1 024-1 030.

[10] ZHANG Y, XU S, YANG S, et al. Salicylic acid alleviates cadmium-induced inhibition of growth and photosynthesis through upregulating antioxidant defense system in two melon cultivars (CucumismeloL.)[J]. Protoplasma, 2015,252(3):911-924.

[11] ALBRENT T, KEHLEN A, STAHL K, et al. Quantification of rapid, transient increases in jasmonic acid in wounded plants using a monoclonal antibody[J]. Planta, 1993,191(1):86-94.

[12]VERBERNEM C, BROUWER N, DELBIANCO F, et al. Method for the extraction of the volatile compound salicylic acid from tobacco leaf material[J]. Phytochem. Anal, 2002,13(1):45-50.

[13] SCHMELZE A, ENGELBERTH J, ALBORN H T, et al. Simultaneous analysis of phytohormones, phytotoxins, and volatile organic compounds in plants[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences USA, 2003,100(18):10 552-10 557.

[14] ABOUL-SOUD M A M, COOK K, LOAKE G J. Measurement of salicylic acid by a high-performance liquid chromatography procedure based on ion-exchange[J]. Chromatographia, 2004,59(1-2):129-133.

[15] ENGELBERTH M J, ENGELBERTH J. Monitoring plant hormones during stress responses[J]. Journal of Visualized Experiments, 2009(28):e1127.

[16] 宋圓圓,徐建峰,梁笑婷,等.利用氣相色譜法同時測定番茄葉片中的信號物質水楊酸和茉莉酸[J].江西農業(yè)大學學報,2010,32(5):1 056-1 060.

[17] ARTECA R N, POOVAIAH B W, SMITH O E. Use of high performance liquid chromatography for the determination of endogenous hormone levels inSolanumtuberosumL. subjected to carbon dioxide enrichment of the root zone[J]. Plant Physiol, 1980,65(6):1 216-1 219.

[18] VERBERNE M C, BROUWER N, DELBIANCO F, et al. Method for the extraction of the volatile compound salicylic acid from tobacco leaf naterial[J]. Phytochem Anal, 2002,13(1):45-50.

[19] XIONG X J, RAO W B, GUO X F, et al. Ultrasensitive determination of jasmonic acid in plant tissues using high-performance liquid chromatography with fluorescence detection[J]. J Agric Food Chem, 2012,60(20):5 107-5 111.

[20] LI G, LU S, WU H. Determination of multiple phytohormones in fruits by high-performance liquid chromatography with fluorescence detection using dispersive liquid-liquid microextraction followed by precolumn fluorescent labeling[J]. J Sep Sci, 2015,38(2):187-196.

[21] ESHITA S M. 3-hydroxybenzoic acid as an internal standard for the high-pressure liquid chromatography quantitation of salicylic acid in plants[J]. Analytical Biochemistry, 2001,289(1):99-102.

[22] HOAGLAND D R, ARNON D I. The water-culture method for growing plants without soil. Calif Agric Exp Stn Circ[J].1950, 347(5406):357-359.

[23] ENYEDI A J, YALPANI N, SILVERMAN P, et al. Localization, conjugation, and function of salicylic acid in tobacco during the hypersensitive reaction to tobacco mosaic virus[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 1992,89(6):2 480-2 484.

[24] CHAERLE L, CAENEGHEM W V, MESSENS E, et al. Presymptomatic visualization of plant-virus interactions by thermography[J].Nat Biotechnol, 1999,17(8):813-816.

[25] MEUWLY P, METRAUX J P. Ortho-anisic acid as internal standard for the simultaneous quantitation of salicylic acidand its putative biosynthetic precursors in cucumber leaves[J]. Anal Biochem, 1993,214(2):500-505.

[26] 張衛(wèi),孫國新,徐玉新,等.植物體內水楊酸分析方法的探討及其應用[J].生態(tài)毒理學報,2009,4(6):889-897.

(責任編輯:蘇靖涵)

A general method for detecting the content of endogenous salicylic acid in plant leaf by HPLC

LIN Wenfang, ZHANG Hong, HONG Zhuangyu, MIAO Ying, LIN Wenxiong

(College of Life Sciences, Fujian Agriculture and Forestry University, Fuzhou, Fujian 350002, China)

To accurately determine salicylic acid (SA) level in plant, methanol was used to extract SA fromArabidopsisleaf, with 3-hydroxy benzoic acid being the internal standard. After acid hydrolysis, the hydrolysate was partitioned with ethyl acetate and hexane mixture (1∶1), and followed by high performance liquid chromatography (HPLC) analysis under different ratios and pH of the mobile phase. Results showed that SA was thoroughly separated from the complex mixture when methanol accounted for 10% of sodium acetate and methanol mixture under pH 6.0. Furthermore, rice and narcissus leaf was used to verify this method, whose results confirmed that this method was generally applicable for SA detection in plants.

salicylic acid; high performance liquid chromatography; 3-hydroxy benzoic acid; plant leaf

2016-04-02

2016-05-23

福建省自然科學基金項目(2016J01103).

林文芳(1981-),女,講師，碩士.研究方向:植物生理與分子生物學.Email:ivy9940@sina.com.通訊作者林文雄(1957-),男,教授,博士生導師.研究方向:植物生理與分子生態(tài)學.Email:wenxiong181@163.com.

Q946.885；Q946.82+8.3

A

1671-5470(2017)01-0109-06

10.13323/j.cnki.j.fafu(nat.sci.).2017.01.017