一種基于TaqMan探針法的阪崎腸桿菌qPCR全自動檢測技術體系的建立

王芬 劉寬 馬龍

摘要 [目的]建立快速準確地檢測食物樣品中食源性致病菌的體系。[方法]配套湖州市微生物制劑與農產品安全重點實驗室自主研發(fā)的微生物分子檢測儀，建立一種基于TaqMan探針法的阪崎腸桿菌qPCR檢測體系。[結果]體系建立成功，標準曲線斜率為-3.44，R2 =0.995 5，擴增效率為95.3%。[結論]該qPCR體系特異性強，靈敏度高，明顯縮短了檢測時間，并具有良好的穩(wěn)定性與重復性，為食品中阪崎腸桿菌的高通量和自動化檢測提供了一個新的途徑。

關鍵詞 阪崎腸桿菌；qPCR；全自動檢測

中圖分類號 TS207.4 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0144-04

Abstract [Objective]To establish a rapid and accurate detection system for foodborne pathogens in food samples.[Method]A qPCR detection system for Enterobacter sakazakii based on TaqMan probe method was established，which was supported by the microbial molecular detector researched by key laboratory of Huzhou mocrobilogical agents and agricultural products safety.[Result]The system was successfully established and the standard curve slope，R2，amplification efficiency was 3.44，0.995 5，95.3%，respectively.[Conclusion]The qPCR detection system has strong specificity，high sensitivity，good stability and repeatability，which could shorten the detection time greatly.The system provides a new way for high throughput and automated detection of E.sakazakii in food.

Key words Enterobacter sakazakii； qPCR；Automatic detection

近年來隨著社會經濟的發(fā)展以及一些食品安全事件的普遍發(fā)生，人們對食品安全問題越來越關注。引起食品安全問題的因素涉及方方面面，而微生物污染是導致食品安全問題的重要原因之一，其中阪崎腸桿菌污染是一種廣泛存在的微生物污染。阪崎腸桿菌即克羅諾桿菌屬，耐酸、耐干燥、抗?jié)B透壓，在食品、飲料、加工材料、環(huán)境中廣泛存在并且很容易生存[1-4]。國際食品微生物標準委員會（ICMSF）在2002年將阪崎腸桿菌列為“嚴重危害特定人群生命、引起長期慢性實質性后遺癥的一種致病菌”[5]。該菌易引起腦膜炎、小腸結腸炎和敗血癥等疾病，是引起嬰幼兒死亡的重要條件致病菌，死亡率高達50%[6-8] 。因此，加強對食品中阪崎腸桿菌的檢測對于維護食品安全和維持人體健康尤其是嬰幼兒的健康具有非常重要的意義。

目前檢測阪崎腸桿菌的方法已有很多，如普通微生物學檢測、基于α-葡萄糖苷酶活性的檢測、免疫學檢測（ELISA、 IMB、 IFA）和分子檢測等。其中分子檢測法又包括普通 PCR、熒光定量 PCR 、環(huán)介導恒溫擴增 （LAMP） 等方法[9-10]。國標法對于阪崎腸桿菌的鑒定是增菌培養(yǎng)后以TSA平板上產生黃色素為基礎進行生物檢測，而黃色素產生并不是阪崎腸桿菌所特有的，同時一些研究也表明，自然界中存在一些不產黃色素的阪崎腸桿菌[11]。與國標法相比，qPCR檢測技術的特異性和靈敏度要強得多，并且時間會明顯縮短。該研究主要基于TaqMan探針法qPCR檢測技術，配套湖州市微生物制劑與農產品安全重點實驗室自主研發(fā)的微生物分子檢測儀以完成阪崎腸桿菌檢測體系的建立。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株。試驗總共涉及5種菌株，其名稱與來源見表1。

1.1.2 儀器與試劑。

普通PCR儀為美國BIO-RAD公司生產；臺式高速冷凍離心機和加樣器均為德國Eppendorf公司生產；微生物智能檢測設備為湖州市微生物制劑與農產品安全重點實驗室自主研發(fā)設計；DNA 提取試劑盒購自湖州高億諾有限公司；PCR反應試劑購自大連寶生物（TaKaRa）公司；引物與探針為英濰捷基（上海）貿易有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 阪崎腸桿菌 qPCR引物與探針。試驗涉及引物與探針序列均來自于國家檢驗檢疫總局頒布的標準。引物序列為F：5-GGGATATTGTCCCCTGAAACAG-3，R：5-CGAGAATAAGCCGCGCATT-3；探針序列為5FAM-AGAGTAGTAGTTGTAGAGGCCGTGCTTCCGAAAG-BHQ-1-3。

1.2.2 細菌基因組DNA提取。

將各菌株的單菌落分別接種于LB培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)12 h完成細菌培養(yǎng)，利用細菌基因組DNA提取試劑盒（GYN106-100T，高億諾）提取基因組DNA。

1.2.3 引物特異性驗證。

提取不同菌種的基因組DNA，利用阪崎腸桿菌的引物和探針進行qPCR驗證，確定阪崎腸桿菌檢測引物的特異性。

1.2.4 qPCR試驗。

反應體系為Premix Ex TaqTM （RR390A，TaKaRa） 12.5 μL，10 μmol/L primer F 2 μL，10 μmol/L primer R 2 μL，10 μmol/L probe S 0.5 μL，模板DNA 2 μL，DEPC處理水6 μL，總體積25 μL。反應條件為95 ℃30 s；95 ℃5 s；60 ℃30 s，40個循環(huán)，退火過程中收集熒光信號。每個樣品重復3次。

1.2.5 qPCR標準曲線的建立。

分別以阪崎腸桿菌基因組DNA進行10倍稀釋，利用超微量核酸測定儀（BioDrop μLite）測定基因組的濃度，以基因組拷貝數(shù)的對數(shù)與反應循環(huán)數(shù)（Ct）之間建立標準曲線。基因拷貝數(shù)的計算公式為：

1.2.6 面包樣品的前處理及基因組提取。

取冷凍干燥后的面包樣品0.2 g加入到2 mL離心管中，依次加入100 μL梯度稀釋的阪崎腸桿菌菌液，再加入900 μL的超純水（將阪崎腸桿菌菌液稀釋成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6共6種不同濃度的菌液），渦旋混勻后在4 ℃，12000r/min的條件下離心3 min，棄上清。再利用試劑盒（GYN106-100T，高億諾）提取基因組。

1.2.7 面包加標樣品的qPCR檢測。利用“1.2.6”中得到的基因組DNA為模板，進行qPCR驗證。

2 結果與分析

2.1 阪崎腸桿菌檢測引物的特異性

分別提取阪崎腸桿菌、單增李斯特菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌5種菌株的基因組，以該5種菌株的基因組為qPCR模板，進行qPCR試驗。引物與探針均為阪崎腸桿菌專屬的引物與探針。由圖1可知，僅有阪崎腸桿菌的基因組模板有對應的Ct值，F(xiàn)AM 通道有明顯的擴增曲線；單增李斯特菌、副溶血性弧菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌4種菌株基因組模板對應的通道沒有明顯的擴增曲線，說明阪崎腸桿菌引物的特異性較好，且擴增體系無污染。所得擴增片段送往上海生工測序后證實確為阪崎腸桿菌片段。

2.2 阪崎腸桿菌qPCR標準曲線的靈敏度與重復性

2.2.1 標準曲線的建立。

將阪崎腸桿菌基因組DNA 10倍梯度稀釋后，作為qPCR模板DNA，進行qPCR試驗。以標準品稀釋后對應的拷貝數(shù)（copies）為橫坐標，Ct值作為縱坐標建立阪崎腸桿菌qPCR標準曲線，結果如圖2所示。利用該qPCR體系檢測阪崎腸桿菌，標準曲線斜率為 -3.44，R2=0.995 5，擴增效率E為95.3%。

2.2.2 qPCR體系的重復性試驗。

為驗證該檢測體系的重復性，人工污染面包后，提取各不同稀釋梯度的人工污染面包的基因組，分別每隔12 h進行1次qPCR檢測，總共3次，每次3個重復。由表2可知，3次重復的變異系數(shù)為1.30%～3.89%，結果顯示該qPCR體系有良好的重復性。

2.2.3 模擬樣本檢測。

將加有不同稀釋梯度阪崎腸桿菌原菌液的面包樣品的宏基因組直接作為PCR模板DNA，進行PCR電泳驗證，試驗結果如圖3所示。從圖中可以明顯看出條帶的亮度逐漸變暗，表明面包的人工污染成功。

再將加標面包樣品的宏基因組直接作為qPCR模板DNA，進行qPCR試驗，試驗結果如表3所示。結果表明，未增菌的面包加標樣品在系列梯度稀釋下，阪崎腸桿菌在37～9.33×105 拷貝/mL濃度條件下均有明顯的擴增曲線，因此實際樣品中的最低檢測限為37拷貝/mL。

3 討論與結論

qPCR技術因具有快速、靈敏性高、特異性好等特點，近年來在食源性病原微生物的快速檢測中大受歡迎，是一種可靠的檢測方法。該技術定量和擴增同步進行，克服了PCR的平臺效應，有效解決了傳統(tǒng)PCR只能終點檢測的局限性[15]。

該試驗以食源性致病微生物中常見的阪崎腸桿菌為供試菌株，針對

湖州市微生物制劑與農產品安全重點實驗室

自主研發(fā)的微生物分子檢測儀，成功建立了一種配套該儀器的阪崎腸桿菌qPCR檢測體系。通過特異性、敏感性、重復性驗證結果表明該試驗建立的檢測體系具有較好的特異性、穩(wěn)定性和重復性。根據 SN/T 1870—2016[16]，樣品在檢測前需經過二次增菌才能進行基因組提取，整個qPCR檢測過程至少需要3 d；GB 4789.4—2016[17]中的傳統(tǒng)培養(yǎng)法以分離培養(yǎng)和生化鑒定為主，最快也需要4 d；黃燾等[18]用Taq Man-MGB 探針法對食品樣品中阪崎腸桿菌進行實時熒光PCR檢測時（不包括增菌過程）最快需要10 h；而在該研究建立的檢測體系中，樣品的前處理只需經過簡單增菌，不必經過增菌后的選擇培養(yǎng)，可直接提取基因組進行檢測，并且該試驗配套食品有害微生物智能檢測設備，可以實現(xiàn)樣品富集與處理、核酸提純、靶基因定量、分析等步驟一體化，是全封閉、一體式自動化檢測系統(tǒng)，可以保證樣品和試驗操作的安全性，降低檢測過程污染風險，也可降低人工操作引起的誤差，且對從業(yè)人員的專業(yè)素養(yǎng)要求不高。該體系的檢測通量為192個樣本/（d·臺），整個檢測過程不超過16 h，這樣不僅縮短了檢測時間，又有著常規(guī)檢測方法和快速檢測裝備所不能實現(xiàn)的高通量，為食源性致病菌檢測提供了理想的平臺。

Seo等[19]建立的實時熒光定量PCR方法靈敏性為100 CFU/mL；張朝[20]在用熒光定量qPCR檢測嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌的研究中的測限可以達14.117拷貝/μL；而該研究建立的檢測體系靈敏度達37拷貝/mL，且樣品的前處理不必經過增菌后的選擇培養(yǎng)，直接提取基因組的優(yōu)勢更為明顯。

該qPCR檢測體系的特異性強，準確性和重復性好，檢測下限較低，可以明顯提高檢測效率和檢測通量，該體系的建立可為阪崎腸桿菌的快速檢測提供新的參考。但仍不能排除結果中的假陽性，即檢測樣品中死菌與活菌的區(qū)分，另外，是否所有食品樣品都適合不經過增菌后的選擇培養(yǎng)的前處理這一問題仍需要進一步研究。

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