連翹酯苷A對內毒素致雞脾淋巴細胞白介素—17的影響

程廣東 張強 岳麗紅

摘要 [目的]研究內毒素和連翹酯苷A對雞脾淋巴細胞中白介素-17（IL-17）水平的影響。[方法]將1日齡雛雞正常飼養(yǎng)至50日齡時，心臟采血處死，表面消毒后，剖檢用脾淋巴細胞分離液分離脾淋巴細胞，將脾淋巴細胞分為20個組，具體為4個劑量組×5個時間點。4個劑量組分別為：對照組、LPS組（5 μg/mL）、連翹酯苷A預防低劑量組（200 μg/mL連翹酯苷 A+5 μg/mL LPS）、連翹酯苷A預防高劑量組（400 μg/mL連翹酯苷 A+5 μg/mL LPS）。5個時間點分別為0、6、12、24、48 h。通過采用ELISA和Real time-PCR方法檢測脾臟淋巴細胞中IL-17水平。[結果]ELISA結果顯示，與正常組相比，LPS組脾臟淋巴細胞中炎癥因子IL-17含量升高；與LPS組比較，連翹酯苷A組脾臟淋巴細胞中上述炎癥因子含量下降，表明脾臟中炎癥因子的變化呈正相關性，通過抑制LPS誘導的雞脾臟中上述炎癥因子的升高，減輕炎癥反應。Real time-PCR結果顯示，與正常組相比，LPS組脾臟淋巴細胞中炎癥因子IL-17 mRNA 表達量升高；與LPS組比較，連翹酯苷A組預防組脾臟淋巴細胞中上述炎癥因子表達量下降，變化呈相關性，試驗表明連翹酯苷A可以通過轉錄水平抑制LPS誘導的雞脾臟淋巴細胞中上述炎癥因子表達量的升高，減輕炎癥反應。[結論]連翹酯苷A抑制雞脾臟淋巴細胞中IL-17水平，可起到抗炎功能。

關鍵詞 連翹酯苷A；內毒素；淋巴細胞；白介素-17

中圖分類號 S853.7 文獻標識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）34-0106-03

Abstract [Objective] Effect of Forsythiaside A on IL17 level in spleen lymphocyte of chickens induced by lipopolysaccharide was studied.[Method]Dayold chickens were fed normally for 50 days， chickens were killed， collecting the spleen sterilely， by lymphotocyte separation medium， spleen lymphocytes were divided into 20 groups（4 doses×five time points）.Four groups included control group， LPS injection group（5 μg/mL），F(xiàn)orsythiaside A low dose treatment group （Forsythiaside A 200 μg/kg+LPS 5 μg/mL）， Forsythiaside A high dose treatment group （Forsythiaside A 400 μg/kg+LPS 5 μg/mL）.Five time points were：0 h，6 h，12 h，24 h，48 h.Lymphocyte IL17 level was determined by ELISA and Real timePCR. [Result]ELISA results showed that protein content of IL17 of spleen lymphocytes increased in LPS groups compared with control group. Forsythiaside A decreased content of above inflammation factor compared with LPS group.Decrease inflammation response showed positive correlation with inflammation factor change of spleen lymphocytes through inhibiting IL17 of spleen lymphocytes in the chicken by LPS to reduce inflammation reactions. Real timePCR results showed that IL17 mRNA expression level of inflammation factor of spleen lymphocytes increased in LPS groups compared with control group.While Forsythiaside A decreased mRNA expression of IL17.Decreasing inflammation response showed positive correlation with inflammation factor change of spleen lymphocytes through inhibiting inflammation factor of spleen in the chicken by LPS to reduce inflammation reactions.[Conclusion]Forsythiaside A perhaps decreased IL17 level，it had antioxidant and antiinflammatory function.

Key words Forsythiaside A；Lipopolysaccharide；Lymphocyte；IL17

連翹酯苷A具有鎮(zhèn)痛、解熱、抗氧化、抗病毒及抗菌等藥理學活性，是連翹的主要有效成分之一，其可介導各種炎癥因子，調控機體免疫應答。脂多糖是革蘭氏陰性細菌細胞壁的成分之一，可引起機體炎癥反應，常被用于復制炎癥模型[1]。IL-17等炎癥因子往往作為免疫反應的重要指示物，IL-17是一種強力炎癥細胞因子，IL-17包括IL-17A～F等6個家族成員，其主要是由Th17細胞（新近發(fā)現(xiàn)的CD4+ T細胞亞群）產生的[2-3]。IL-17F具有獨特的生物學功能，可誘導多種趨化因子和細胞因子的表達，參與免疫細胞應答及炎癥反應，在發(fā)揮抑制腫瘤細胞進展的同時，亦有促進腫瘤進展和轉移的風險[4]。當炎癥發(fā)生時，除了脾臟作為機體外周免疫器官，產生免疫應答外，IL-17與IL-17受體（IL-17 receptor，IL-17R）后引起生物學效應。IL-17募集、活化中性粒細胞，進而放大炎性效應，引起機體IL-6等細胞因子生成，加速炎癥反應，在機體的腫瘤和免疫性疾病中等也起到重要作用[5]。故采用LPS誘導雞脾淋巴細胞炎癥模型，在連翹酯苷A作用下，從體外模型研究雞脾淋巴細胞炎癥因子的變化和相關性，探討體外雞脾淋巴細胞因子與炎癥的關系，從調控炎癥因子的角度，闡明連翹酯苷A抗LPS誘導的雞脾炎癥中的機制，為連翹酯苷A在雞免疫調控中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1日齡AA肉雞均購自中國農業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所動物中心。

主要試劑盒：連翹酯苷 A（純度>98%）購于成都瑞芬思生物科技有限公司。內毒素LPS（血清型O55：B5，Sigma產品，批號L-2880）購自美國SIGMA 公司。

主要儀器：LightCycler480（FACS CantoⅡ，美國Roche公司），酶標儀型號（DENLEY DRAGON Wellscan MK3，Thermo，荷蘭）。

1.2 試驗方法

1.2.1 試驗分組與處理。

脾淋巴細胞的分離：將1日齡雛雞正常飼養(yǎng)至50日齡時，心臟采血處死，表面消毒后，移至超凈工作臺中剖檢，無菌取出脾臟，按程廣東[6]的方法，用配好的淋巴細胞分離液分離淋巴細胞，用加10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液稀釋，將獲得淋巴細胞進行計數(shù)，然后稀釋到4×106個/mL，移到一次性培養(yǎng)瓶中，每瓶加入10 mL培養(yǎng)液。然后將連翹酯苷 A和LPS按如下4種劑量組分別加入到含淋巴細胞的DMEM培養(yǎng)液中，該試驗將脾淋巴細胞共分為20個組，具體為4個劑量組×5個時間點。4個劑量組分別為：對照組、LPS組（5 μg/mL）、連翹酯苷A預防低劑量組（200 μg/mL連翹酯苷 A+5 μg/mL LPS）、連翹酯苷A預防高劑量組（400 μg/mL連翹酯苷 A+5 μg/mL LPS）。5個時間點分別為0、6、12、24、48 h。

1.2.2 ELISA檢測雞脾淋巴細胞中IL-17蛋白含量。

收集不同處理組脾淋巴細胞后，按程廣東[6]的方法檢測各組血清樣品IL-17含量。

1.2.3 qRT-PCR檢測雞脾淋巴細胞中IL-17 mRNA表達量。

收集各不同處理組脾淋巴細胞后，直接加入TRIZOL試劑0.9 mL，提取RNA，按程廣東[6]的方法，將RNA反轉錄成cDNA，以cDNA為模板，用于檢測脾臟IL-17的CP值，經內參 β-actin校正，以歸一法比較各組雞血液中IL-17的mRNA表達量。

其中提取RNA所用物品均應嚴格按消除RNase的常規(guī)方法處理。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計

試驗數(shù)據(jù)通過SPSS 18.0軟件進行統(tǒng)計分析，以（±s）表示數(shù)據(jù)，采用P檢驗進行試驗統(tǒng)計，*P<0.05和**P<0.01表示與對照組比較，#P<0.05和##P<0.01表示與LPS組比較。

2 結果與分析

2.1 脾淋巴細胞中IL-17蛋白含量

由圖1可以看出，同一時間不同處理組進行比較，與正常對照組比較，LPS組中雞脾淋巴細胞不同時間點中IL-17蛋白含量明顯升高，差異極顯著（P<0.01）；與LPS組比較，不同劑量組的（200 μg/mL和400 μg/mL）連翹酯苷 A抑制LPS誘導的IL-17的蛋白含量升高，差異均極顯著（P<0.01），并成劑量依賴性。隨著連翹酯苷 A與LPS作用雞脾淋巴細胞作用時間延長，LPS作用時間組整體IL-17蛋白含量升高，且在作用6 h時IL-17蛋白含量達到最高值；連翹酯苷A預防低劑量組與連翹酯苷A預防高劑量組IL-17蛋白在0、6、12 h含量升高，且隨著作用時間延長，IL-17蛋白含量呈線性上升，且在12 h組IL-17蛋白含量達到最高值，在24、48 h，隨著作用時間延長，IL-17蛋白含量下降。

2.2 脾淋巴細胞中IL-17 mRNA表達量

由圖2可以看出，同一時間點不同處理組進行比較，與正常組相比，LPS可顯著提高雞脾淋巴細胞不同時間點中IL-17 mRNA含量，差異均極顯著（P<0.01）；連翹酯苷 A預防組抑制LPS引發(fā)的雞脾淋巴細胞不同時間點中IL-17 mRNA含量上升，差異均極顯著（P<0.01），并成劑量依賴性。隨著連翹酯苷 A與LPS作用雞脾淋巴細胞作用時間延長，LPS作用時間12 h組IL-17 mRNA含量達到最高值；連翹酯苷A預防低劑量組與連翹酯苷A預防高劑量組IL-17 mRNA在12 h組達到最高值。表明連翹酯苷 A與LPS可以通過影響IL-17 mRNA含量影響炎癥反應。

3 結論與討論

3.1 LPS致脾淋巴細胞炎癥機制

吳景華等[7]研究表明，青蒿素作用后肝癌組織中Caspase 3的表達較陰性對照組增加，較陽性對照組表達有所減少，但IL-17R的表達較陰性對照組及陽性對照組降低；青蒿素組荷瘤鼠血清IL-17的濃度明顯下降。阮洪生等[8]研究表明，LPS能明顯誘導小鼠單核巨噬細胞RAW264.7分泌炎癥因子NO、TNF-α、IL-1β和IL-6，而表兒茶素可以明顯降低LPS誘導的RAW 264.7細胞釋放炎癥因子NO、TNF-α、IL-1β和IL-6。葛建彬等[9]研究表明，小鼠缺血再灌后缺血側大腦皮層p65蛋白水平明顯增高，枸杞多糖能顯著降低p65蛋白水平，能顯著降低缺血再灌后TNF-α、IL-6和IL-1β的蛋白生成。王玉明等[10]研究表明，與LPS組相比，芹菜素治療組可以顯著升高肺泡盥洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平，而芹菜素可以顯著降低肺泡盥洗液中TNF-α、IL-1β、IL-6的表達水平，并抑制NF-κB信號通路的激活，芹菜素可以通過抑制NF-κB的激活并降低炎性細胞因子的水平，從而對小鼠急性肺損傷產生抗炎保護作用。脾臟是雞體外周免疫器官，其對細胞免疫和體液免疫起著重要作用，在機體的免疫系統(tǒng)中起重要作用。而脾淋巴細胞是脾臟發(fā)揮免疫反應的直接效應細胞。體外試驗觀察和分析LPS和連翹酯苷A對體外分離培養(yǎng)的雞脾淋巴細胞的炎癥因子水平，可更直觀地分析和比較效應細胞的直接抗炎作用。該試驗研究LPS和連翹酯苷A作用于雞脾淋巴細胞后，雞脾淋巴細胞中炎癥因子mRNA表達量與蛋白含量上升，但也存在時間和劑量效應，雞脾臟和0、6、12、24和48 h組脾淋巴細胞IL-17的mRNA表達量升高，表明LPS 能引發(fā)機體炎癥，導致機體IL-17等炎癥因子上升，加劇炎癥反應。