辣椒素對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜及P物質(zhì)表達的影響研究

王武臣　閆小會　馬瑞霞

[摘要] 目的 探討辣椒素對變應性鼻炎大鼠鼻黏膜形態(tài)、P物質(zhì)表達的影響及作用機制。 方法 建立變應性鼻炎動物模型，采用辣椒素滴鼻，記錄大鼠噴嚏次數(shù)、抓鼻次數(shù)、流涕情況評分疊加計分。對比正常組、未治療組、治療組鼻黏膜形態(tài)，對比治療后鼻黏膜肥大細胞、P物質(zhì)含量變化。 結(jié)果 治療后治療組變應性鼻炎癥狀明顯緩解（P<0.05），治療組肥大細胞、P物質(zhì)含量較未治療組明顯減少（P<0.05）。 結(jié)論 辣椒素對變應性鼻炎有治療作用，其作用機制與減少P物質(zhì)含量、降低IgE介導的I型變態(tài)反應相關。

[關鍵詞] 辣椒素；P物質(zhì)；變應性鼻炎

[中圖分類號] R765.21 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2017）16-0033-03

[Abstract] Objective To investigate the effect of capsaicin on nasal mucosal morphology and substance P expression in allergic rhinitis rats and its mechanism. Methods Animal model of allergic rhinitis was established. Capsaicin was used intranasally， and the number of sneezes and catching nose， runny nose situation were recorded and scored， and the scores were superimposed. The nasal mucosal morphology among normal group， untreated group and treated group was compared. The changes of nasal mucosa mast cells and substance P content after treatment were compared. Results The symptoms of allergic rhinitis in the treatment group after treatment were significantly relieved（P<0.05）. The nasal mucosa mast cells and the content of substance P in the treatment group were significantly lower than those in the untreated group（P<0.05）. Conclusion Capsaicin has a therapeutic effect on allergic rhinitis， and its mechanism is related to reduce the content of substance P and reducing IgE-mediated type Ⅰ allergic reaction.

[Key words] Capsaicin； Substance P； Allergic rhinitis

近年來研究發(fā)現(xiàn)，變應性鼻炎（allergic rhinitis，AR）的發(fā)生與神經(jīng)肽如P物質(zhì)（SP）、降鈣素基因相關肽（CGRP）關系密切[1]。這些神經(jīng)肽與血流量和鼻黏膜腺體的分泌有關，并參與免疫應答的調(diào)節(jié)[2]。SP可以增強神經(jīng)興奮性，若SP大量釋放，可引起鼻分泌的亢進[3-4]。辣椒素（capsaicin，CAP）可以選擇性消耗神經(jīng)末梢釋放出的神經(jīng)肽類物質(zhì)，因此又被稱為P物質(zhì)耗竭劑[5-6]，可以使感覺神經(jīng)敏感性下降。本研究通過建立AR動物模型觀察辣椒素對AR大鼠癥狀、鼻黏膜形態(tài)、P物質(zhì)表達的影響，從而探討辣椒素在變應性鼻炎防治中的作用機制。

1 材料與方法

1.1動物及分組

健康雄性SD大鼠[6]30只[動物批號：SCXK（京），2016-0002]，體重180～220 g；飼養(yǎng)條件：寧夏醫(yī)科大學動物實驗中心，無特殊病原體（SPF）；飼養(yǎng)濕度：40%，飼養(yǎng)溫度：（22±2）℃。隨機分為三組，每組10只，分別為正常對照組（正常組）、變應性鼻炎未治療組（未治療組）、變應性鼻炎辣椒素治療組（治療組）。應用苦杏仁酸進行標記，用以區(qū)別分組。

1.2 藥物及試劑

卵清蛋白（Sigma公司生產(chǎn)）、氫氧化鋁粉末（Sigma公司生產(chǎn)）、辣椒素（Sigma公司生產(chǎn)）、P物質(zhì)抗體[艾博抗（上海）貿(mào)易有限公司]。

1.3 動物模型建立方法

根據(jù)文獻[7-9]，建立AR大鼠動物模型：（1）OVA 基礎致敏階段：將卵清蛋白0.3 mg、氫氧化鋁粉末30 mg、生理鹽水1 mL混合制成混懸液，進行SD大鼠腹腔內(nèi)注射，每間隔1日進行1次，共注射7次；（2）局部激發(fā)階段：基礎致敏階段結(jié)束后，予以2% OVA滴鼻，每側(cè)鼻腔50 μL，每日1次，共行7次滴鼻。

1.4 辣椒素干預

AR動物模型成功后，采用70%乙醇制成3.3 mmol/L的CAP溶液，再用蒸餾水稀釋成終濃度為0.656 μmol/L備用。予以辣椒素溶液滴鼻，每側(cè)鼻腔50 μL，每日1次，共15次。正常對照組、變應性鼻炎未干預組以等量生理鹽水替代辣椒素溶液，方法及步驟不變。

1.5 標本獲取及處理

1.5.1 獲取血液標本 在CAP溶液及生理鹽水最后一次鼻腔治療24 h內(nèi)，將SD大鼠按照10%水合氯醛300 mg/kg的劑量腹腔注射麻醉后，暴露并分離腹主動脈，抽取動脈血5 mL，放入無菌EP管中，靜置1 h之后，于4℃環(huán)境下以3000 r/min轉(zhuǎn)速用離心機離心15 min后獲得上層血清，置于-20℃冰箱內(nèi)保存。

1.5.2 獲取鼻黏膜組織標本 將取血后的大鼠迅速處死并切取頭部，取鼻中隔黏膜，4%多聚甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋，制作切片。（1）常規(guī)HE染色，觀察鼻黏膜形態(tài)。（2）甲苯胺藍染色：肥大細胞計數(shù)。（3）免疫組織化學染色：常規(guī)脫蠟、水化、抗原修復（采用微波爐加熱法）、封閉、一抗孵育（一抗為免疫P物質(zhì)抗血清）、二抗孵育（二抗為生物素標記的羊抗兔血清）、顯色、復染、分化、脫水、透明、封片，4℃保存。

1.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù)，計量資料以均數(shù)±標準差表示，兩組均數(shù)比較采用t檢驗，多組比較采用方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義，P<0.01為差異具有高度統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1各組SD大鼠癥狀學評分結(jié)果

未治療組與治療組大鼠于末次鼻腔激發(fā)后30 min內(nèi)均出現(xiàn)打噴嚏、流清涕、易怒好動、騷鼻、撓癢等現(xiàn)象，癥狀學評分>5分。未治療組出現(xiàn)癥狀10只，治療組出現(xiàn)癥狀10只，兩組均造模成功，正常組未出現(xiàn)打噴嚏等AR表現(xiàn)。各組大鼠末次激發(fā)后癥狀評分比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1。

辣椒素治療15 d后再次觀察記錄上述打噴嚏、流清涕等AR癥狀，未治療組癥狀明顯緩解為2只（20%），治療組癥狀明顯緩解為8只（80%），差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。各組治療后癥狀評分比較差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05），見表2。

2.2 HE染色

正常組：黏膜形態(tài)正常，炎癥細胞少見。未治療組：黏膜連續(xù)性中斷，纖毛出現(xiàn)倒伏甚至脫落，炎癥細胞明顯浸潤。治療組：黏膜上皮損傷情況明顯好轉(zhuǎn)，炎癥細胞明顯減少。見封三圖2。

2.3 甲苯胺藍染色

未治療組肥大細胞計數(shù)較正常組增多，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。治療組肥大細胞計數(shù)較未治療組明顯減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見封三圖3及表3。

2.4 免疫組織化學染色

治療組較未治療組SP表達減少，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見封三圖4及表4。

3 討論

AR主要是吸入過敏原后產(chǎn)生的一種特異性反應，目前理論認為這是一種IgE介導的Ⅰ型變態(tài)反應[10-11]?？乖せ顫{細胞后產(chǎn)生IgE，并與肥大細胞結(jié)合，當抗原再次侵入時，致使肥大細胞脫顆粒，產(chǎn)生多種介質(zhì)，主要有組胺、蛋白酶、白三烯等，其引起血管擴張、液體滲出增加、腺體分泌亢進[12]等反應。SP是NANC神經(jīng)遞質(zhì)，作為鼻部異樣感及反射神經(jīng)的一個重要媒介，鼻黏膜受到刺激時，SP釋放增加，使得血管擴張、黏膜水腫、血漿外溢[13]。因此，SP對鼻黏膜環(huán)境的改變至關重要。SP和一些神經(jīng)遞質(zhì)、細胞因子在神經(jīng)-免疫系統(tǒng)中的信息轉(zhuǎn)移中起作用，它們可以整合SP及其受體表達[14]。在炎癥反應中，炎癥細胞和介質(zhì)激活來自周圍感覺神經(jīng)末梢的SP，導致炎癥組織SP的表達增加，并且還可以通過自分泌SP增強炎癥反應。本次實驗研究表明，辣椒素治療組SP表達減少，而此次實驗大鼠所處的鼻炎階段為早期。早期變應性鼻炎反應發(fā)生在過敏原暴露的幾分鐘內(nèi)，并且特征為打噴嚏、鼻癢和水性鼻涕，其主要由肥大細胞和嗜堿性細胞分泌的化學介質(zhì)引起。本結(jié)果可以解釋為將辣椒素滴鼻可使致敏的大鼠減輕鼻神經(jīng)源性炎癥的發(fā)展。

本研究發(fā)現(xiàn)連續(xù)辣椒素治療15 d，治療組鼻腔黏膜SP含量顯著降低，接近正常水平。未治療組鼻黏膜SP含量明顯高于正常對照組，提示SP在AR的發(fā)病中可能發(fā)揮了重要的作用。實驗表明，辣椒素能促進SP的大量釋放，引起鼻分泌增多，血管擴張，血流量增多。當反復多次大劑量應用辣椒素能使SP耗竭、SP能神經(jīng)變性和阻滯。為此，我們將辣椒素作為SP能神經(jīng)阻滯劑，通過對AR治療作用的觀察，證實辣椒素減低了AR實驗動物鼻部對變應原的超敏反應性。SP能神經(jīng)的軸索反射機制可能在AR中發(fā)揮作用，已有實驗初步表明此機制與P物質(zhì)能神經(jīng)末梢的逆向傳導有關[15]。

綜上所述，通過本次實驗，SD大鼠的辣椒素治療是成功的，同時初步探討了其可能的作用機制，希望能夠為CAP應用于AR的臨床治療提供理論參考。

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（收稿日期：2017-04-02）