蛋白激酶BIN2的純化及活性分析

袁敏齊玉榮王瑞菊

（1. 華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心，唐山 063000；2. 河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024）

蛋白激酶BIN2的純化及活性分析

袁敏1齊玉榮2王瑞菊2

（1. 華北理工大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 基因組學(xué)與計(jì)算生物學(xué)研究中心，唐山 063000；2. 河北師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，石家莊 050024）

BIN2是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，在油菜素內(nèi)酯（BR）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。為了獲得具有激酶活性且不帶標(biāo)簽的BIN2蛋白，將BIN2基因構(gòu)建到帶eXact標(biāo)簽的pPAL8表達(dá)載體上，獲得BIN2基因的原核表達(dá)載體eXact-BIN2，轉(zhuǎn)化大腸桿菌表達(dá)菌株BL21（DE3）。摸索合適的誘導(dǎo)條件后成功誘導(dǎo)出51 kD 的eXact-BIN2蛋白。經(jīng)eXact純化介質(zhì)純化并切除標(biāo)簽，獲得質(zhì)量較高、不帶標(biāo)簽的BIN2蛋白。該BIN2蛋白具有較高的激酶活性，能夠在體外磷酸化MBP-BZR1蛋白。

BIN2；磷酸化；蛋白激酶；蛋白純化

BIN2（Brassinosteroid Insensitive 2）是類糖原合成酶激酶3（Glycogen synthase kinase 3，GSK3）家族的成員。GSK3是一類在真核生物中非常保守的基因家族，廣泛參與調(diào)控眾多的生物學(xué)過程，具有典型的結(jié)構(gòu)特征，從N端到C端依次由可變域、保守激酶域及C末端域組成［1，2］。擬南芥中GSK-LIKE家族共有10個(gè)成員，依據(jù)序列同源性又可細(xì)分為4個(gè)亞家族，其中BIN2是II亞家族中的AtSK21。擬南芥GSK-LIKE成員在植物BR（Brassinosteroid，油菜素內(nèi)酯）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、花發(fā)育、側(cè)根的發(fā)育、非生物脅迫響應(yīng)和氣孔發(fā)育等多方面發(fā)揮重要作用［3-9］。

在擬南芥中BIN2作為負(fù)調(diào)控因子參與BR信號(hào)通路。BR是一種重要的植物內(nèi)源激素，在植物細(xì)胞伸長(zhǎng)，維管組織分化，植物的抗逆抗病等諸多生長(zhǎng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用，它是目前公認(rèn)的繼生長(zhǎng)素、赤霉素、細(xì)胞分裂素、脫落酸、乙烯之后被發(fā)現(xiàn)的第六大類植物激素。BR合成缺失突變體或?qū)R不敏感的突變體表現(xiàn)為植株矮小、葉片暗綠及暗中光形態(tài)建成等表型［10，11］。近年來，關(guān)于BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)方面的研究一直是生物學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)問題之一，并且取得了很多重大的科研成果，鑒定出了很多參與BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的組分，BR 通過一條磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)基因表達(dá)。當(dāng)植物體內(nèi)BR濃度較低時(shí)，BIN2持續(xù)磷酸化轉(zhuǎn)錄因子BZR1（Brassinazole Resistant 1）和BES1（bri1-Ethylmethane Suppressor 1）。隨著BR濃度升高，BIN2的活性受到抑制，失活的BIN2不能繼續(xù)磷酸化下游的BZR1和BES1，而BZR1和BES1會(huì)被蛋白磷酸酶PP2A（Protein Phosphatase 2A）去磷酸化進(jìn)而調(diào)控下游基因的表達(dá)。在這一系列的蛋白質(zhì)可逆磷酸化修飾過程中，激酶BIN2與磷酸酶PP2A相互配合控制核心轉(zhuǎn)錄因子BZR1/BES1的磷酸化狀態(tài)在BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮十分重要的作用［12-16］。近年來的研究表明，BIN2可以磷酸化并抑制MAPKKK（YDA）活性而參與植株氣孔發(fā)育［4，17］。BIN2在BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與植株氣孔發(fā)育的交叉互作中發(fā)揮核心作用?；贐IN2功能的重要性，純化BIN2蛋白并解析其晶體結(jié)構(gòu)將更有助于理解其結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系。

目前，純化蛋白通常利用融合表達(dá)的親和標(biāo)簽，獲得帶有標(biāo)簽蛋白的融合蛋白。常用的標(biāo)簽有兩類：一類是一些多肽表位，能夠與固定在樹脂上的分子配體或多肽結(jié)合。如Flag 標(biāo)簽，生物素受體多肽標(biāo)簽以及鈣調(diào)蛋白結(jié)合多肽標(biāo)簽等；另一類是能夠與固定在層析介質(zhì)上的小分子配體結(jié)合的大蛋白標(biāo)簽，如GST，MBP標(biāo)簽等。無論哪種標(biāo)簽都會(huì)干擾蛋白的生物學(xué)活性，影響其晶體結(jié)構(gòu)。通常情況下可以用一種高度特異性的蛋白內(nèi)切酶切割和去除標(biāo)簽，但是這些蛋白酶對(duì)不同蛋白質(zhì)的切割效率差異很大，并且蛋白切割操作步驟比較復(fù)雜，很可能在切割過程中對(duì)蛋白造成影響，比如蛋白質(zhì)變性、降解等。本研究中利用Bio-Rad公司的Profinity eXact 純化系統(tǒng)很好的解決了上述問題。該系統(tǒng)把eXact標(biāo)簽與固定在純化介質(zhì)上的突變的絲氨酸蛋白酶結(jié)合，利用鹵素離子氟離子或者疊氮化鈉在標(biāo)簽和目的蛋白之間剪切，使標(biāo)簽滯留在純化介質(zhì)上，而目的蛋白從層析柱上洗脫下來。蛋白洗脫與切割一步完成，切割下來的目的蛋白不含有eXact純化標(biāo)簽的殘留，能夠保持目的蛋白本身的生理特性［18-20］。本研究擬利用Profinity eXact 純化系統(tǒng)來純化不帶標(biāo)簽的、且具有較好激酶活性的BIN2蛋白，為進(jìn)一步研究其蛋白晶體結(jié)構(gòu)及生物學(xué)功能奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

基因克隆所用酶類及試劑購(gòu)于康為世紀(jì)公司；IPTG誘導(dǎo)劑購(gòu)于Sigma公司；eXact純化介質(zhì)購(gòu)于美國(guó)Bio-Rad 公司。

1.2 方法

1.2.1 BIN2基因的克隆及eXact-BIN2原核表達(dá)載體的構(gòu)建 利用BIN2的基因特異引物擴(kuò)增獲得其全長(zhǎng)基因。將BIN2擴(kuò)增片段與空載體pPAL8分別用SpeⅠ和NotⅠ雙酶切，回收目的條帶，經(jīng)連接酶連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。挑取一些克隆進(jìn)行雙酶切鑒定，選取酶切鑒定的陽(yáng)性克隆測(cè)序。測(cè)序正確的重組載體eXact-BIN2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）。1.2.2 IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)eXact-BIN2蛋白表達(dá)的影響 將轉(zhuǎn)化eXact-BIN2重組載體的BL21大腸桿菌在LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，1∶200擴(kuò)培后繼續(xù)培養(yǎng)至菌液OD600在0.6-0.8之間，分別使用終濃度為0.1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG，在37℃、30℃和23℃ 3種不同溫度下誘導(dǎo)1-6 h收集菌體。SDS-PAGE電泳檢測(cè)eXact-BIN2蛋白表達(dá)情況，確定合適的IPTG濃度、誘導(dǎo)溫度以及誘導(dǎo)時(shí)間。

1.2.3 BIN2蛋白的純化 利用eXact介質(zhì)進(jìn)行純化。收集經(jīng)IPTG誘導(dǎo)的菌體，棄去上清，用樣品緩沖液（0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH7.2）重懸菌體，超聲破碎后，14 000 r/min 4℃離心15 min。收集上清液與eXact介質(zhì)低溫混勻1-2 h。1 500-2 000 g/min離心，棄去上清。用加入0.2% Triton-X100的樣品緩沖液洗滌eXact介質(zhì)數(shù)次除去雜蛋白。利用蛋白洗脫緩沖液（0.1 mol/L 磷酸鹽緩沖液，pH7.2，0.1 mol/L NaF）與eXact介質(zhì)孵育5-10 min，離心收集洗脫液，重復(fù)洗脫多次。取0.5-1 μg獲得的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳，檢測(cè)蛋白純化效果。

1.2.4 體外蛋白激酶試驗(yàn) 準(zhǔn)備50 mmol/L Tris.HCl，pH7.4，10 μmol/L ATP，1 mmol/L MgCl2作為激酶反應(yīng)液。將1 μg BIN2蛋白與0.5 μg MBP-BZR1蛋白加入到激酶反應(yīng)液中至總體系20 μL，室溫孵育10-30 min。然后利用SDS-PAGE電泳通過分析電泳遷移率的變化判斷MBP-BZR1是否被BIN2磷酸化。蛋白質(zhì)被磷酸化后，分子量變大，電泳時(shí)遷移速度變慢，使用合適濃度的蛋白分離膠可以區(qū)分出磷酸化前后蛋白質(zhì)分子量的差異。因此，可以通過分析底物蛋白質(zhì)在激酶反應(yīng)前后的電泳遷移情況來判斷MBPBZR1是否被BIN2磷酸化。

2 結(jié)果

2.1 BIN2基因的克隆及eXact-BIN2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

利用基因特異性引物擴(kuò)增獲得1 143 bp的BIN2全長(zhǎng)基因（圖1-A），經(jīng)SpeⅠ和NotⅠ雙酶切鑒定獲得大約1 000 bp的小片段和大約6 000 bp的大片段，分別與基因片段和空載體大小相符。再利用SpeⅠ進(jìn)行單酶切鑒定，獲得大約7 000 bp 的片段，與BIN2基因加空載體的總大小相符（圖1-B）。挑取克隆測(cè)序后獲得正確的eXact-BIN2原核表達(dá)載體。

圖1 eXact-BIN2原核表達(dá)載體的構(gòu)建

2.2 IPTG誘導(dǎo)濃度、誘導(dǎo)溫度和誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)BIN2蛋白表達(dá)的影響

將轉(zhuǎn)化eXact-BIN2重組載體的BL21大腸桿菌分別使用終濃度為0.1 mmol/L和0.5 mmol/L的IPTG，在37℃、30℃和23℃ 3種不同溫度下誘導(dǎo)1-6 h收集菌體。SDS-PAGE檢測(cè)結(jié)果（圖2）表明，誘導(dǎo)的eXact-BIN2融合蛋白為51 kD，并且該蛋白對(duì)誘導(dǎo)條件的要求并不十分嚴(yán)格，在37℃、30℃和23℃溫度下eXact-BIN2蛋白表達(dá)量均較高，0.1 mmol/L和0.5 mmol/L IPTG的誘導(dǎo)效果也沒有明顯差異。

圖2 不同誘導(dǎo)條件下eXact-BIN2融合蛋白的表達(dá)

2.3 BIN2蛋白的純化

經(jīng)過摸索，確定IPTG誘導(dǎo)濃度為0.1 mmol/L，然后在37℃、30℃和23℃溫度下分別對(duì)BIN2蛋白進(jìn)行誘導(dǎo)和純化。SDS-PAGE表明獲得的eXact-BIN2融合蛋白純度質(zhì)量均較高，洗脫后切除eXact標(biāo)簽的BIN2蛋白分子量大小為43 kD（圖3）。測(cè)定蛋白濃度，發(fā)現(xiàn)37℃誘導(dǎo)后純化的蛋白濃度較低，為93.4 μg/L；30℃誘導(dǎo)后純化的蛋白濃度為420.4 μg/L；23℃誘導(dǎo)后純化的BIN2蛋白濃度最高，為997.2 μg/L，可能是23℃誘導(dǎo)時(shí)產(chǎn)生的可溶性BIN2蛋白量最多。

2.4 蛋白激酶BIN2能夠磷酸化MBP-BZR1

將試驗(yàn)所獲得的BIN2蛋白通過體外蛋白激酶試驗(yàn)檢測(cè)其活性，結(jié)果如圖4所示，跟孵育前的MBP-BZR1（泳道2）相比，與BIN2共同孵育后的MBP-BZR1分子量變大，電泳遷移變慢，表明MBPBZR1已經(jīng)被BIN2磷酸化成為磷酸化狀態(tài)的BZR1（pBZR1）（泳道3）。泳道1為單獨(dú)的MBP蛋白，泳道4為單獨(dú)的BIN2蛋白。

圖3 切除eXact標(biāo)簽的BIN2蛋白的洗脫結(jié)果

圖4 BIN2能夠體外磷酸化MBP-BZR1

3 討論

可逆磷酸化是一種重要的蛋白質(zhì)翻譯后修飾方式，廣泛參與植物體內(nèi)細(xì)胞分裂和伸長(zhǎng)、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、植物對(duì)逆境脅迫的反應(yīng)、光合作用和衰老等眾多生物學(xué)過程。植物體內(nèi)蛋白激酶種類很多，BIN2作為一類絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，屬于GSK3家族成員，對(duì)其大部分底物都以負(fù)調(diào)節(jié)的作用方式發(fā)揮作用。BIN2通過磷酸化BZR1在BR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮負(fù)調(diào)控作用［12］。

研究蛋白質(zhì)修飾的試驗(yàn)中經(jīng)常會(huì)利用標(biāo)簽來純化目的蛋白，然而，標(biāo)簽蛋白作為融合蛋白的一部分會(huì)一起被純化出來，并且標(biāo)簽的大小、親疏水性，以及帶電荷情況都會(huì)對(duì)目的蛋白的表達(dá)、可溶性以及活性等方面產(chǎn)生影響。為了避免標(biāo)簽的干擾，獲得更接近生理?xiàng)l件下的蛋白，純化不帶標(biāo)簽的蛋白是一種非常重要的手段。不帶標(biāo)簽的蛋白可以通過純化后對(duì)融合蛋白進(jìn)行標(biāo)簽剪切獲得，但是分離去除標(biāo)簽蛋白操作步驟比較復(fù)雜，并且可能在剪切過程中導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性、降解等。Bio-Rad公司的Profinity eXact 純化系統(tǒng)將蛋白洗脫與蛋白切割一步完成，切割下來的目的蛋白不含有純化標(biāo)簽，能夠保持目的蛋白本身的生理特性。這是與傳統(tǒng)的蛋白純化標(biāo)簽相比而具有的一個(gè)極大的優(yōu)點(diǎn)［19，20］。本研究獲得的不帶標(biāo)簽的BIN2蛋白保留了很好的激酶活性，能夠在體外磷酸化底物MBP-BZR1蛋白。在純化過程中，多次重復(fù)試驗(yàn)，收集的第一管蛋白洗脫液中都含有一個(gè)分子量大約70 kD的蛋白，推測(cè)可能是對(duì)維持BIN2正確構(gòu)象與激酶活性密切相關(guān)的伴侶蛋白，也可能是與純化介質(zhì)非特異結(jié)合的雜蛋白。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了eXact-BIN2原核表達(dá)載體，誘導(dǎo)出51 kD的eXact-BIN2融合蛋白。利用eXact純化介質(zhì)成功獲得了不帶標(biāo)簽的，大小約為43 kD的BIN2蛋白，該BIN2蛋白具有較好的激酶活性，能夠在體外磷酸化底物MBP-BZR1蛋白。

［1］Li J, Nam KH. Regulation of brassinosteroid signaling by a GSK3/ SHAGGY-like kinase［J］. Science, 2002, 295（5558）：1299-1301.

［2］Yan ZY, Zhao J, Peng P, et al. BIN2 functions redundantly with other Arabidopsis GSK3-Like kinases to regulate brassinosteroid signaling［J］. Plant Physiology, 2009, 150（2）：710-721.

［3］Kim TW, Guan S, Sun Y, et al. Brassinosteroid signal transduction from cell-surface receptor kinases to nuclear transcription factors［J］. Nature Cell Biology, 2009, 11（10）：1254-1260.

［4］Kim TW, Michniewicz M, Bergmann DC, et al. Brassinosteroid regulates stomatal development by GSK3-mediated inhibition of a MAPK pathway［J］. Nature, 2012, 482（7385）：419-U1526.

［5］Khan M, Rozhon W, Bigeard J, et al. Brassinosteroid-regulated GSK3/Shaggy-like kinases phosphorylate mitogen-activated protein（MAP）kinase kinases, which control stomata development inArabidopsis thaliana［J］. Journal of Biological Chemistry, 2013, 288（11）：7519-7527.

［6］Cho H, Ryu H, Rho S, et al. A secreted peptide acts on BIN2-mediated phosphorylation of ARFs to potentiate auxin response during lateral root development［J］. Nature Cell Biology, 2014, 16（1）：66-76.

［7］Vert G, Walcher CL, Chory J, et al. Integration of auxin and brassinosteroid pathways by Auxin Response Factor 2［J］. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 2008, 105（28）：9829-9834.

［8］Dal Santo S, Stampfl H, Krasensky J, et al. Stress-induced GSK3 regulates the redox stress response by phosphorylating glucose-6-phosphate dehydrogenase in Arabidopsis［J］. Plant Cell, 2012, 24（8）：3380-3392.

［9］Wang RJ, Liu MM, Yuan M, et al. The Brassinosteroid-activated BRI1 receptor kinase is switched off by dephosphorylation mediated by cytoplasm-localized PP2A B' Subunits［J］. Molecular Plant, 2016, 9（1）：148-157.

［10］Clouse SD, Langford M, McMorris TC. A brassinosteroid-insensitive mutant in Arabidopsis thaliana exhibits multiple defects in growth and development［J］. Plant Physiology, 1996, 111（3）：671-678.

［11］Li J, Nagpal P, Vitart V, et al. A role for brassinosteroids in lightdependent development of Arabidopsis［J］. Science, 1996, 272（5260）：398-401.

［12］Kim TW, Wang ZY. Brassinosteroid signal transduction from receptor kinases to transcription factors［J］. Annual Review of Plant Biology, 2010, 61：681-704.

［13］Tang W, Yuan M, Wang R, et al. PP2A activates brassinosteroidresponsive gene expression and plant growth by dephosphorylating BZR1［J］. Nature Cell Biology, 2011, 13（2）：124-131.

［14］Kim TW, Guan S, Burlingame AL, et al. The CDG1 kinase mediates brassinosteroid signal transduction from BRI1 receptor kinase to BSU1 phosphatase and GSK3-like kinase BIN2［J］. Molecular Cell, 2011, 43（4）：561-571.

［15］Hartwig T, Wang ZY. The molecular circuit of steroid signalling in plants［J］. Essays Biochem 2015, 58：71-82.

［16］ Fan M, Bai MY, Kim JG, et al. The bHLH transcription factor HBI1 mediates the trade-off between growth and pathogen-associated molecular pattern-triggered immunity in Arabidopsis［J］. Plant Cell, 2014, 26（2）：828-841.

［17］Gudesblat GE, Schneider-Pizon J, Betti C, et al. SPEECHLESS integrates brassinosteroid and stomata signalling pathways［J］. Nature Cell Biology, 2012, 14（5）：548-U214.

［18］Huang L, Mao X, Abdulaev NG, et al. One-step purification of a functional, constitutively activated form of visual arrestin［J］. Protein Expression And Purification, 2012, 82（1）：55-60.

［19］李青, 張強(qiáng), 鄒麗云, 等. 應(yīng)用 Profinity eXact 標(biāo)簽在真核表達(dá)系統(tǒng)中純化 EGFP 蛋白［J］. 免疫學(xué)雜志, 2011, 27（2）：144-148.

［20］馮金, 洪愉, 黃芬, 等. 基于 Profinity eXact 系統(tǒng)的可溶性 egfp表達(dá)和純化［J］. 生命科學(xué)研究, 2014, 18（4）：310-314.

（責(zé)任編輯 狄艷紅）

Purification and Activity Analysis of Tag- free Protein Kinase BIN2

YUAN Min1QI Yu-rong2WANG Rui-ju2
（1. Center for Genomics and Computational Biology，College of Life Sciences，North China University of Science and Technology，Tangshan 063000；2. College of Life Sciences，Hebei Normal University，Shijiazhuang 050024）

BIN2 is a kind of Ser/Thr protein kinase，and plays important roles in BR signal transduction pathway. In order to obtain the active and tag-free BIN2 protein，the BIN2 gene was cloned into the prokaryotic expression vector pPAL8 to obtain BIN2-pPAL8 expression vector. The correct plasmid BIN2-pPAL8 was transformed into E.coli expression strain BL21（DE3）. After exploring the proper induction conditions，the 51 kD eXact-BIN2 protein was successfully induced and purified using eXact purification system. The high-quality and tag-free BIN2 protein was obtained through cleaving the eXact tag. The purified BIN2 protein is highly active，which could phosphorylate MBP-BZR1 in vitro.

BIN2；phosphorylation；protein kinase；protein purification

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2016-1167

2016-12-26

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（31401212，31201063），河北省自然科學(xué)基金（C2014209134，C2012205042）

袁敏，女，博士，研究方向：植物生長(zhǎng)發(fā)育；E-mail：yuanmin308@163.com

王瑞菊，女，博士，研究方向：植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；E-mail：15100149962@126.com