家蠶GAPDH內參蛋白多克隆抗體的制備及其檢測

陳瑩 王遠卓 楊娟娟 郭興國 喬惠麗

（南陽師范學院農業(yè)工程學院 河南省伏牛山昆蟲生物學重點實驗室，南陽 473061）

家蠶GAPDH內參蛋白多克隆抗體的制備及其檢測

陳瑩 王遠卓 楊娟娟 郭興國 喬惠麗

（南陽師范學院農業(yè)工程學院 河南省伏牛山昆蟲生物學重點實驗室，南陽 473061）

制備家蠶GAPDH內參蛋白多克隆抗體，并對該抗體進行檢測。利用PCR技術從家蠶中克隆GAPDH基因，構建其原核表達載體，轉化大腸桿菌，誘導表達重組蛋白并純化。純化后的蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔制備GAPDH多克隆抗體。用酶聯(lián)免疫吸附法和Western blot檢測抗體的效價和特異性。結果顯示，成功構建GAPDH/pET-28a原核表達載體，獲得高純度的GAPDH重組融合蛋白；經SDS-PAGE和抗His單抗檢測，純化后蛋白的分子量大小與預測的一致；以該蛋白為免疫抗原，采用4次免疫方式對新西蘭大白兔進行免疫，獲得GAPDH多克隆抗體血清。酶聯(lián)免疫吸附檢測結果表明，GAPDH抗體的效價為1：8 000，并能與天然家蠶蛋白特異性結合。成功制備了家蠶內參蛋白GAPDH多克隆抗體，為深入研究家蠶中不同蛋白的生理功能和作用奠定了堅實的基礎。

家蠶；甘油醛-3-磷酸脫氫酶；多克隆抗體

甘油醛-3-磷酸脫氫酶（Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）是一種重要的糖酵解酶，它催化三磷酸甘油酸氧化磷酸化成為1， 3-二磷酸甘油酸，主要有參與能量代謝、DNA修復、蛋白表達調節(jié)等多種生理功能。關于哺乳動物GAPDH蛋白各種生物性能的鑒定已有較多報道［1］，包括運輸和膜融合中的作用、微管組裝、核輸出和蛋白磷酸轉移酶/激酶反應。同時也發(fā)現真核生物GAPDH 與細胞附著有關，可能起到增強細胞骨架結構的作用［2］。GAPDH作為管家基因，在真核和原核生物中高度保守，氨基酸序列同源性高達70%-100%，且在同種組織或細胞的不同時期表達量相對恒定，因而被作為內參蛋白廣泛應用［3］。

目前對基因進行表達定量的常用方法有實時定量PCR、RNA印跡、核糖核酸酶保護分析、基因芯片等，在蛋白水平進行定量的方法有蛋白印跡、免疫共沉淀等，都需應用內參基因對目的基因和蛋白進行校正，以獲得真實可靠的結果。管家基因有幾百種，最常用的有甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）［4-7］、肌動蛋白（Actin）［4，6-8］、微管蛋白（Tubulin）［6，9］、組蛋白3（H3）［10，11］、核糖體蛋白L3（RPL3）［7，12］和泛素結合蛋白（UBC）［13，14］等。GAPDH作為內參基因的一種，它具有高度的保守性，在各種類型組織和細胞中均恒定表達。

家蠶是重要的經濟昆蟲和鱗翅目模式生物，在研究昆蟲遺傳發(fā)育、基因調控分子機制和功能基因組學中具有重要作用。內參基因在家蠶的相關基因功能研究中發(fā)揮著必不可少的作用。本研究以家蠶為研究對象，通過對家蠶GAPDH基因進行克隆、原核表達和純化，獲得GAPDH蛋白的多克隆抗體，并檢測GAPDH多克隆抗體在家蠶不同時期不同組織樣品中的雜交效果，旨在為家蠶不同蛋白表達水平分析提供了前提，同時為家蠶和其他同源物種昆蟲的蛋白功能研究提供更加高效的抗體。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28a表達載體和原核表達菌株Rosetta由南陽師范學院河南省伏牛山昆蟲生物學重點實驗室保存，辣根過氧化物標記的羊抗兔抗體購自北京中山金橋；福氏完全佐劑，福氏不完全佐劑購自Sigma公司；2.5 kg左右雄性新西蘭純種大白兔 購自鄭州大學實驗動物中心。

1.2 方法1.2.1 家蠶總RNA的提取及cDNA的合成 利用Trizol試劑（Invitrogen）提取家蠶細胞的總RNA，按照大連寶生物的PrimeScript II 反轉錄試劑盒合成第一條鏈cDNA。

1.2.2 家蠶GAPDH基因的克隆及測序 根據NCBI數據庫中編碼家蠶GAPDH序列（LOC692786）設計特異引物（表1），以家蠶RNA反轉錄產物為模板，進行PCR擴增。PCR反應體系：10×buffer 2 μL，dNTP 1.6 μL cDNA 1 μL，rTaq酶 0.2 μL，上下游引物各0.8 μL，加無菌水補至20 μL。PCR反應條件：95℃預變性5 min，30個循環(huán)（95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s），72℃延伸10 min。檢測正確的PCR產物通過膠回收試劑盒對目的條帶進行切膠回收。將回收的目的片段連接pMD-19T載體（TaKaRa），轉化大腸桿菌，通過藍白斑篩選挑取陽性克隆，經PCR和雙酶切鑒定后送深圳華大基因科技服務有限公司進行測序。

1.2.3 原核表達載體GAPDH/pET-28a的構建與鑒定 將測序正確的GAPDH/pMD-19T用BamH I和EcoR I進行雙酶切，并切膠純化目的片段，將純化產物連接到帶有His標簽的pET-28a載體，對陽性菌落進行PCR和雙酶切鑒定，經鑒定正確的重組質粒用于轉化Rosetta感受態(tài)細胞進行蛋白誘導表達。1.2.4 GAPDH融合蛋白的原核表達純化及鑒定 將重組質粒GAPDH/pET-28a轉入大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細胞中，37℃，220 r/min振蕩培養(yǎng)過夜；次日，按照1∶100的比例（V/V），取1 mL菌液加入到100 mL新的含有卡那霉素培養(yǎng)基中，37℃，220 r/min至OD600值為0.6-0.8時按1∶1 000的比例（V/V）加入終濃度為0.4 mmol/L IPTG，37℃，220 r/min誘導3 h，SDS-PAGE檢測目的蛋白表達情況。誘導后有目的蛋白表達的菌液，4℃，6 000 r/min離心10 min收集菌體，棄上清，用2 mL pH7.4，50 mmol/L Tris-HCl緩沖液重懸沉淀，超聲破碎30 min并離心，SDS-PAGE檢測目的蛋白的表達形式。結果表明，GAPDH以包涵體的形式存在于沉淀中。

GAPDH包涵體蛋白按照文獻報道的KCl染色切膠方法進行純化［15］。將超聲破碎后的樣品4℃，12 000 r/min離心5 min，棄上清，沉淀加入適量蛋白上樣緩沖液重懸，沸水浴加熱10 min后SDSPAGE電泳分離，然后用適量的0.25 mol/L 的KCl 溶液染色5 min，用手術刀片切下染成銀白色的目的條帶，用PBS 洗3 次后，將膠條碾碎并移入EP 管中，并加入適量PBS 于4℃振蕩透析過夜。離心后取上清，電泳檢測目的蛋白的純度和濃度，并利用His單抗與純化后GAPDH融合蛋白進行Western blot 雜交鑒定。

1.2.5 GAPDH多克隆抗體的制備和效價測定 選取新西蘭純種大白兔，將純化后的GAPDH蛋白作為抗原與等體積的弗氏完全佐劑進行1∶1充分混合乳化，在雙肩周圍皮下進行多點注射，注射前取少量正常血清作為陰性對照。首次免疫10 d后，以相同抗原與等體積的弗氏不完全佐劑1∶1充分混合進行第2次免疫，之后每隔7-10 d免疫1次。免疫3次后取少許血清檢測免疫效果。經4次免疫10 d后，進行心臟采血，分離血清進行效價檢測。

采用酶聯(lián)免疫吸附（Enzyme-linked immuno sorbent assay，ELISA）測定方法檢測抗體的效價，用濃度為 0.5 mg/mL融合His-GAPDH于4℃過夜包被ELISA板，采用3%牛血清蛋白緩沖液進行封閉，將兔抗GAPDH的多抗血清按照1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000、1∶16 000和1∶ 32 000進行稀釋，一抗孵育2 h，二抗孵育1 h，最后加入顯色液反應15 min，用酶標儀檢測450 nm處吸光值，未免疫前的血清為陰性對照。

1.2.6 Western blot 檢測GAPDH多克隆抗體的特異性 將家蠶幼蟲不同齡期以及家蠶成蟲各個組織進行液氮研磨，然后加入適量含1 mmol/L PMSF蛋白酶抑制劑的50 mmol/L pH7.4 Tris-HCl緩沖液，充分混勻后在4℃，12 000 r/min離心20 min，取上清通過12% SDS-PAGE電泳檢測。將家蠶各樣品的總蛋白通過半干轉印系統(tǒng)（15 V，10 min）轉到PVDF膜上，用PBST + 2.5%的脫脂牛奶室溫封閉2 h，然后加入1：500稀釋的GAPDH多克隆抗體室溫孵育2 h，洗膜后加入1∶1 000稀釋的辣根過氧化物酶標記的羊抗兔IgG，室溫孵育1 h，最后用增強型DAB顯色試劑盒（Solarbio）顯色至條帶清晰。

表1 GAPDH的PCR克隆引物

2 結果

2.1 家蠶GAPDH的PCR克隆及序列分析

以家蠶RNA反轉錄后的cDNA為模板，用設計的特異引物進行PCR擴增，結果（圖1）顯示在1 000 bp處有一條與預期大小相同的目的帶。經試劑盒回收純化后與pMD19T載體連接，并篩選陽性重組子，經測序鑒定后用ClustalW軟件與家蠶GAPDH序列比對，結果一致。該基因全長999 bp，共編碼333個氨基酸（圖2-A），理論分子量為35.428 kD，等電點為8.31。在NCBI上用Blast分析發(fā)現家蠶GAPDH與部分鱗翅目昆蟲的氨基酸序列一致性達到90%以上。利用MEGA5軟件對不同物種模式生物的GAPDH氨基酸序列構建系統(tǒng)進化樹，通過Neighbor Joining法重復1 000次，其他參數采用默認設置。結果（圖2-B）表明，GAPDH在不同物種中具有一定的保守性，其中家蠶與棉鈴蟲（Helicoverpa armigera）的氨基酸保守性最為接近，氨基酸序列一致性達到93%，黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）和意大利蜜蜂（Apis mellifera）為83%，小家鼠（Mus musculus）為78%，人類（Homo sapiens）為77%，斑馬魚（Danio rerio）為75%。

圖1 GAPDH基因的PCR產物電泳檢測

2.2 家蠶GAPDH原核表達的載體構建

測序鑒定后的GAPDH/pMD19T載體用BamH I和EcoR I酶切后連接到表達載體pET-28a轉化感受態(tài)細胞，陽性重組子提取質粒后雙酶切鑒定經電泳檢測可看到大小為1 000 bp的目的基因片段（圖3）。鑒定正確的質粒經華大基因測序后用ClustalW分析表明，測序結果與家蠶GAPDH氨基酸序列一致，說明原核表達載體構建成功。

2.3 GAPDH蛋白的原核表達、蛋白純化及鑒定

將重組質粒GAPDH/pET-28a轉化大腸桿菌Rosetta感受態(tài)細胞，IPTG誘導前后的菌液樣品的SDS-PAGE電泳檢測結果顯示，誘導后的樣品中有一條明顯的大小約為39 kD的條帶，與融合His標簽的目的蛋白分子量一致。大量誘導表達后的菌液經超聲破碎、離心后，上清和沉淀通過SDS-PAGE檢測，結果表明GAPDH蛋白以包涵體的形式表達。進一步用切膠回收的方式純化包涵體中的目的蛋白，純化后蛋白經SDS-PAGE電泳檢測結果（圖4-A）顯示，目的條帶單一。為了驗證純化后的蛋白為帶His標簽的融合蛋白，利用His單抗與純化后GAPDH融合蛋白進行Western blot 雜交，雜交結果（圖4-B）顯色有一條單一的條帶，并與目的蛋白理論分子量一致，由此表明該蛋白為帶His標簽的融合目的蛋白，可作為抗原用于后續(xù)多克隆抗體制備。

圖2 家蠶GAPDH基因的cDNA序列、氨基酸序列及不同物種GAPDH系統(tǒng)進化樹

圖3 重組表達載體GAPDH/pET-28a的雙酶切產物電泳檢測

圖4 重組GAPDH誘導前后、超聲前后、純化后的SDSPAGE電泳檢測（A）及His單抗的Western blot雜交檢測（B）

2.4 ELISA檢測兔抗GAPDH抗體效價及其特異性

在GAPDH蛋白免疫新西蘭大白兔4次后，將制備的GAPDH多抗血清以不同比例稀釋后作為一抗進行ELISA檢測。結果如圖5所示，不同稀釋比例的抗血清均可與GAPDH融合蛋白進行特異結合，由此表明GAPDH多抗血清具有較好的免疫原性。按照酶標儀檢測的OD450值大于陰性對照2倍并且數值大于0.25的標準，能夠檢測到抗原抗體特異結合信號的最大稀釋濃度為1∶8 000，即GAPDH抗體的效價為1∶8 000。

為了進一步檢測制備抗體在家蠶中的特異性，采用Western blot方法分別與家蠶幼蟲（圖6-A）、家蠶雄性成蟲（圖6-B）和家蠶雌性成蟲（圖6-C）不同部位的總蛋白進行雜交檢測。結果顯示，所有樣品中在分子量為35 kD處都有一清晰的條帶，與GAPDH的理論分子量一致。由此表明，GAPDH抗體能特異的結合家蠶幼蟲各齡期蛋白、家蠶成蟲雄性與雌性不同部位的GAPDH蛋白，從而為后續(xù)研究家蠶中其他蛋白的功能奠定了基礎。

圖5 ELISA檢測GAPDH多克隆抗血清的效價

3 討論

目前，對于功能蛋白的定性和定量分析最常用的方法即Western雜交，而用于Western雜交的內參蛋白抗體的種類和來源也很多。其中國外文獻報道中使用GAPDH內參的較多［4-7］，對于細胞核蛋白，組蛋白H3使用較多［10，11］，而對于植物樣本常用ACTIN蛋白作為內參［16-18］。市場上商品化的動物多克隆和單克隆抗體、內參抗體的抗原為同時具有蛋白特異性和種屬通用性的內參蛋白部分序列，其檢測種屬較為廣泛。如目前商品化的GAPDH、ACTIN和TUBULIN的抗體在大部分動物和部分昆蟲中都具有保守性，但其在昆蟲中的雜交結果不太穩(wěn)定。

GAPDH是真核細胞和細菌都表達的具有關鍵作用的蛋白［19-20］，同時作為一種多功能蛋白參與許多亞細胞水平活動，包括催化圍觀聚合，參與膜融合和膜轉運、參與蛋白磷酸化修飾、調節(jié)蛋白表達、促進細胞凋亡、參與DNA損傷修復、作為鐵蛋白受體等［21-23］。GAPDH廣泛存在于眾多生物體中，在細胞中含量豐富，占總蛋白的10%-20%［24］。GAPDH作為內參基因的一種，具有高度的保守性，在各種類型組織和細胞中均恒定表達?；贕APDH的特點及其在蛋白功能研究中的作用，利用PCR技術對家蠶GAPDH基因進行克隆，并連接到pET-28a載體上，通過原核表達最終得到了GAPDH蛋白，為制備家蠶GAPDH 抗體提供了前提。家蠶GAPDH基因序列全長999 bp，編碼333個氨基酸，理論分子量為35 kD，等電點為8.31。將切膠回收后的GAPDH蛋白免疫純種新西蘭大白兔，獲得了家蠶GAPDH的兔抗血清。ELISA檢測GAPDH抗體的效價為1∶8 000，Western blot檢測結果顯示該血清能與前期純化的His-GAPDH融合蛋白和天然家蠶總蛋白結合，表明該血清具有較好的特異性。

GAPDH作為應用最廣泛的內參抗體之一，在蛋白功能研究中仍存在障礙。目前商品化的GAPDH抗體大部分為哺乳動物來源，價格昂貴。本課題組選擇同源性較高的商品化小鼠GAPDH單克隆抗體檢測家蠶總蛋白，但未能與家蠶蛋白特異性的結合。因而獲得GAPDH多克隆抗體是檢測家蠶及鱗翅目昆蟲中不同蛋白表達規(guī)律的前提條件。針對家蠶特殊的生命周期，其信號傳導、蛋白合成與代謝的變化快速顯著，其各組織的分化特異性高，組織之間的功能差異較大，選擇合適的內參基因不僅可用于分析家蠶中基因和蛋白表達水平，也為進一步比較分析GAPDH與ACTIN和TUBULIN抗體在家蠶不同發(fā)育時期、不同組織和不同刺激條件下的穩(wěn)定性和優(yōu)缺點奠定了基礎。

圖6 GAPDH抗體在家蠶不同齡期幼蟲（A）、雄性成蟲（B）和雌性成蟲（C）中的Western blot雜交檢測

4 結論

本研究從家蠶中克隆得到了GAPDH基因，構建了其原核表達載體，并在原核中成功表達并純化了GAPDH蛋白。利用純化的融合GAPDH蛋白作為抗原免疫新西蘭大白兔，獲得針對家蠶GAPDH特異性較高，并能特異結合家蠶天然蛋白的多克隆抗體。

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（責任編輯 李楠）

Preparation and Detection of Polyclonal Antibody of GAPDH Protein from Bombyx mori

CHEN Ying WANG Yuna-zhuo YANG Juan-juan GUO Xing-guo QIAO Hui-li
（Henan Provincial Key Laboratory od Funiu Mountain in Insect Biology，College of Agricultural Engineering，Nanyang Normal University，Nanyang 473061）

This work is to prepare and detect the polyclonal antibody of GAPDH protein in Bombyx mori. GAPDH gene was cloned from silkworm by PCR，then prokaryotic expression vector was constructed and transformed into Escherichia coli competent cell. The recombinant protein was induced and purified. The purified protein was used as antigen to prepare the polyclonal antibody by immunizing New Zealand purebred rabbit. The titer and specificity of the polyclonal antibody was detected by enzyme-linked immune sorbent assay（ELISA）and Western blot. As results，GAPDH/pET-28a vector was constructed successfully，and recombinant GAPDH fusion protein in high purity was obtained. SDS-PAGE and anti-His monoclonal antibody detection showed that the molecular weight of the purified protein was consistent with that predicted. GAPDH polyclonal antiserum was obtained by immunized New Zealand purebred rabbit for four times using the purified protein as an antigen. The titer of GAPDH polyclonal antibody was 1：8 000 by ELISA，and the antiserum was able to bind specifically with the total protein of B mori. Conclusively，the polyclonal antibody of GAPDH is successfully prepared，which lays a solid foundation for further studying the physiological function of different proteins in B. mori.

Bombyx mori；glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；polyclonal antibody

10.13560/j.cnki.biotech.bull.1985.2017-0104

2017-02-19

河南省教育廳高等學校重點科研項目（17A180031）

陳瑩，女，碩士研究生，研究方向：昆蟲生理生化與分子生物學；E-mail：1142605287@qq.com

喬惠麗，女，博士，副教授，研究方向：昆蟲生理生化與分子生物學；E-mail：qiaohuili@nynu. edu.cn