糖尿病胃輕癱大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl—2與Bax的表達(dá)與意義

張聞達(dá)

摘要：目的 觀察Bcl-2與Bax在糖尿病胃輕癱大鼠胃平滑肌細(xì)胞中的變化，探討其在糖尿病胃輕癱發(fā)生中的意義。方法 成年SD大鼠20只，鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)制備糖尿病大鼠模型，另取20只作為正常對(duì)照組，飼養(yǎng)6 w后處死取胃組織。利用免疫組織化學(xué)染色檢測(cè)胃平滑肌組織Bcl-2與Bax的表達(dá)。結(jié)果 正常對(duì)照組Bcl-2顯色指數(shù)（5.68±3.24）；糖尿病組Bcl-2顯色指數(shù)（1.58±0.72）；兩組比較有明顯差異P<0.01。而B(niǎo)ax在正常對(duì)照組顯色指數(shù)（1.74±0.75）；在糖尿病組顯色指數(shù)（5.75±2.12），兩組比較有明顯差異P<0.01。結(jié)論 Bcl-2 與Bax表達(dá)的變化可能在糖尿病胃輕癱的發(fā)生中發(fā)揮重要作用。

關(guān)鍵詞：糖尿??；胃輕癱；Bcl-2；Bax；表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào)：R587.1 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：1006-1959（2017）13-0083-02

Abstract：Objective To observe the changes of Bcl-2 and Bax in gastric smooth muscle cells of diabetic gastroparesis rats，and to explore the significance of Bcl-2 and Bax in the pathogenesis of diabetic gastroparesis.Methods 20 adult SD rats， streptozotocin（STZ）induced by preparation of diabetic rat model，another 20 rats as normal control group，feeding 6 w were obtained by the expression of gastric tissue.Immunohistochemical staining of Bcl-2 and Bax in gastric smooth muscle tissue.Results The normal control group Bcl-2 color index（5.68±3.24）；diabetes mellitus group Bcl-2 color index（1.58±0.72）；there was significant difference between the two groups，P<0.01.But Bax in the normal control group the color index（1.74±0.75）；In diabetic group，the color rendering index（5.75±2.12）was significantly different between the two groups.P<0.01.Conclusion Bcl-2 and Bax expression may play an important role in the development of diabetic gastroparesis.

Key words：Diabetes mellitus；Gastroparesis；Bcl-2；Bax；Expression

胃輕癱是糖尿病常見(jiàn)的慢性并發(fā)癥之一，主要表現(xiàn)為胃動(dòng)力低下、胃排空延遲、胃轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間延長(zhǎng)等引起的腹脹、惡心、嘔吐等。至今糖尿病所致胃輕癱的機(jī)理仍不完全清楚[1]。Bcl-2與Bax共屬于一個(gè)家族，通過(guò)控制線粒體膜的通透性來(lái)調(diào)節(jié)凋亡激活物。bax二聚體在膜上打開(kāi)通道，增加通透性；bcl-2與bax形成異聚體，降低通透性。所以，bcl-2水平的升高和bax的降低表明細(xì)胞對(duì)凋亡的抵抗性增強(qiáng)，應(yīng)該是保護(hù)藥物起作用的標(biāo)志；而反之則相反。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病大鼠成模6 w后出現(xiàn)胃輕癱機(jī)體癥狀，并發(fā)生胃平滑肌細(xì)胞凋亡[2]。為探討B(tài)cl-2與Bax在糖尿病胃輕癱中的變化及作用，本實(shí)驗(yàn)以糖尿病胃輕癱模型大鼠為研究對(duì)象，觀察了胃平滑肌細(xì)胞的Bcl-2與Bax蛋白與基因的表達(dá)，旨在進(jìn)一步闡明糖尿病胃輕癱的發(fā)生機(jī)制，為臨床探索新的治療方案提供科學(xué)的理論依據(jù)與實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1 材料與試劑

成年SD雄性大鼠40只，雌雄不限，體重200～220 g，由延邊大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。鏈脲佐菌素（STZ）（SIGMA），Bcl-2、Bax抗體（Cell Signaling），即用型SABC免疫組化試劑盒（博士德），小量柱離心式組織總RNA提取純化試劑盒（華舜）；PremixTaqR TaqTMVersion（寶生物）；Wizard〗〗（#A7170）純化試劑盒（Promega）；一步法RT-PCR試劑盒（Promega）。

1.2方法

1.2.1模型制備與分組 實(shí)驗(yàn)分為模型組和正常對(duì)照組，每組20只。0.1 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液（pH4.0）配制成0.5%的STZ溶液；大鼠禁食不禁水12 h，稱(chēng)重；將STZ用0.1 mol/L的檸檬酸鹽緩沖液（pH4.0）配制成0.5%的STZ溶液；糖尿病組大鼠一次性腹腔注射65 mg/Kg STZ，制備糖尿病大鼠模型。正常對(duì)照組一次性腹腔注射等量檸檬酸鹽緩沖液。給藥1 w后，采尾部靜脈血測(cè)定血糖濃度，血糖濃度高于350 mg/dl大鼠確定為造模成功。所有大鼠均單籠飼養(yǎng)，自由進(jìn)食和飲水，于飼養(yǎng)6 w后處死用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2免疫組織化學(xué)法觀察Bcl-2與Bax蛋白 采用S-P法檢測(cè)兩組實(shí)驗(yàn)大鼠為平滑肌Bcl-2與Bax的表達(dá)情況。雙盲法選取實(shí)驗(yàn)用每張切片不同部位隨機(jī)觀察五個(gè)400倍視野，分別記錄顯色程度和顯色范圍。顯色程度分弱+、中++、強(qiáng)+++表示。顯色范圍分：顯色范圍占高倍視野<1/4為+，占1/4～2/4為++，占2/4～3/4為+++，>3/4為++++。然后將每個(gè)高倍視野顯色程度和范圍換算成“顯色指數(shù)”。顯色指數(shù)=顯色程度×顯色范圍（+，++，+++，++++分別按1，2，3，4分計(jì)算）。取均數(shù)為每一種類(lèi)蛋白表達(dá)的最終顯色指數(shù)。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 16.5統(tǒng)計(jì)軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)采用（x±s）表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P<0.01為差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1兩組大鼠胃平滑肌Bcl-2蛋白的表達(dá)

免疫組化法結(jié)果顯示，正常對(duì)照組胃平滑肌細(xì)胞Bcl-2呈散在分布的棕色顆粒，顯色指數(shù)（5.68±3.24）；糖尿病組胃平滑肌細(xì)胞Bcl-2未見(jiàn)明顯棕色顆粒，顯色指數(shù)（1.58±0.72）；兩組比較有明顯差異（P<0.01），見(jiàn)圖1。

2.2兩組大鼠胃平滑肌Bax蛋白的表達(dá)

免疫組化法結(jié)果：Bax在正常對(duì)照組胃平滑肌細(xì)胞未見(jiàn)明顯棕色顆粒，顯色指數(shù)為（1.74±0.75）；在糖尿病組胃平滑肌細(xì)胞Bax呈散在分布的棕色顆粒，顯色指數(shù)（5.75±2.12），兩組比較有明顯差異（P<0.01），見(jiàn)圖2。

3 討論

糖尿病胃輕癱的發(fā)生是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程。目前，關(guān)于糖尿病胃輕癱發(fā)病機(jī)制的研究，主要集中在高血糖造成的神經(jīng)性病變、胃激素分泌障礙、應(yīng)激以及部分細(xì)胞第二信使的變化等方面，而關(guān)于細(xì)胞凋亡及其調(diào)控的研究，少見(jiàn)報(bào)道。細(xì)胞凋亡可以通過(guò)兩種途徑被介導(dǎo)：線粒體凋亡途徑和死亡受體介導(dǎo)的途徑。這其中細(xì)胞色素C的釋放是一個(gè)十分重要的事件。許多學(xué)者認(rèn)為線粒體細(xì)胞色素C的釋放是通過(guò)通透性轉(zhuǎn)變氣孔，而B(niǎo)cl-2家族蛋白直接調(diào)節(jié)PTP。在這些蛋白中，抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-Xl能夠保存膜電位，阻斷細(xì)胞色素C的釋放；而B(niǎo)ax、Bcl-Xs、Bak、Bid和Bad是前凋亡蛋白，它們通過(guò)影響PTP而消除了線粒體的膜電位，促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放。細(xì)胞凋亡可受多種細(xì)胞因子誘導(dǎo)與調(diào)控。同一組織或細(xì)胞受不同因子的作用其反應(yīng)結(jié)果不盡相同，同一細(xì)胞因子也可受不同的因子影響表現(xiàn)出不同的生物學(xué)效應(yīng)[3]。Bcl-2 與Bax蛋白是上述凋亡調(diào)控蛋白中研究較多的蛋白。研究發(fā)現(xiàn)Bax/Bcl-2 兩蛋白之間的比例關(guān)系是決定對(duì)細(xì)胞凋亡抑制作用強(qiáng)弱的關(guān)鍵因素，因此認(rèn)為，bax 是極重要的促細(xì)胞凋亡基因之一。

高血糖是糖尿病的特征性臨床表現(xiàn)，也是糖尿病并發(fā)癥發(fā)生的基礎(chǔ)。它能夠使細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激和代謝障礙，造成缺氧、氨基酸水平降低、低ATP或AMP增多等。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的上述變化可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生[4]。為了探討B(tài)cl-2 與Bax在糖尿病胃輕癱發(fā)生過(guò)程中的作用。本實(shí)驗(yàn)首先制備了糖尿病大鼠模型，并利用免疫組織化學(xué)染色法觀察了Bcl-2 與Bax蛋白的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)糖尿病狀態(tài)下Bcl-2表達(dá)下降，而B(niǎo)ax表達(dá)升高[5]。結(jié)果表明，糖尿病狀態(tài)下胃平滑肌細(xì)胞可能出現(xiàn)了細(xì)胞凋亡。同時(shí)這結(jié)果也表明，Bcl-2 與Bax參與糖尿病胃輕癱的發(fā)生，并可能調(diào)控細(xì)胞凋亡。

參考文獻(xiàn)：

[1]陳霞，趙宏賢，楊燕，等.糖尿病胃輕癱大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡的線粒體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究[J].中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2010（18）：2736-2739.

[2]張默函，姜京植，蔡英蘭，等.糖尿病胃輕癱大鼠胃平滑肌細(xì)胞凋亡與IGF-1 PI3K AKT信號(hào)通路的動(dòng)態(tài)變化及意義[J].中國(guó)糖尿病雜志，2015，23（11）：1023-1026.

[3]Childs BG，Baker DJ，Kirkland JL，et al.Senescence and apoptosis： dueling or complementary cell fates[J].EMBO Rep，2014，15（11）：1139-1153.

[4]Sankari SL，Babu NA，Rajesh E，et al.Apoptosis in immune-mediated diseases[J].J Pharm Bioallied Sci，2015，7（Suppl 1）：S200-2.

[5]姚東英，劉菲.糖尿病胃輕癱發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)展[J].國(guó)際消化病雜志，2011，31（1）：16-17，47.

[6]胥建輝，侯曉鈺，趙宏賢.糖尿病胃輕癱大鼠胃平滑肌細(xì)胞BKCa通道的變化[J].中國(guó)病理生理雜志，2015，31（7）：1288-1293.

[7]孫曼怡，劉燕，馮憑.糖尿病結(jié)腸動(dòng)力障礙近端結(jié)腸平滑肌細(xì)胞相關(guān)凋亡基因表達(dá)的研究[J].天津醫(yī)藥，2011，39（5）：448-451.

編輯/王朵梅