基于血清藥物化學(xué)和血清藥理學(xué)研究麻黃附子細(xì)辛湯抗炎和免疫抑制的物質(zhì)基礎(chǔ)

李媛　李貞

[摘要]目的：探討麻黃附子細(xì)辛湯抗炎和免疫抑制的物質(zhì)基礎(chǔ)。方法：通過比較麻黃附子細(xì)辛湯、給藥后含藥血清和空白血清的LC-MS/Ms圖譜，尋找麻黃附子細(xì)辛湯的入血成分；ELISA法測定各時間點含藥血清對抗原刺激RBL-2H3細(xì)胞釋放組胺、氨基己糖苷酶的影響；MTT法測定各時間點含藥血清對脂多糖誘導(dǎo)小鼠脾細(xì)胞增殖的影響，并對相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行回歸分析。結(jié)果：灌胃給予麻黃附子細(xì)辛湯后，從大鼠血清中發(fā)現(xiàn)32個成分，其中27個原型成分，其他5個未知成分。與空白血清相比，麻黃附子細(xì)辛湯各時間點含藥血清均能降低抗原誘導(dǎo)RBL-2H3細(xì)胞釋放組胺（P<0.05）；除麻黃附子細(xì)辛湯4h含藥血清外，其余各時間點含藥血清均能抑制抗原誘導(dǎo)的R BL-2H3細(xì)胞脫顆粒（P<0.05）；麻黃附子細(xì)辛湯15，30min含藥血清能顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖（P<0.05）。結(jié)論：甲基偽麻黃堿、偽庥黃堿、苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、新烏頭原堿等成分可能為麻黃附子細(xì)辛湯抗炎和免疫抑制的部分物質(zhì)基礎(chǔ)。

[關(guān)鍵詞]麻黃附子細(xì)辛湯 血清藥物化學(xué) 血清藥理學(xué) 抗炎 免疫抑制

[中圖分類號]R285.5 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A [文章編號]2095-3089（2017）12-0029-02

麻黃附子細(xì)辛湯為張仲景《傷寒論》中的經(jīng)典名方，由麻黃、附子、細(xì)辛3味中藥組成。相關(guān)臨床實踐及研究表明，該方在治療過敏性鼻炎方面，具有顯著的療效，且安全可靠、副作用小、療效持久。其藥理是通過抑制肥大細(xì)胞和巨噬細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)，發(fā)揮抗炎作用，能提高降低抗體活性及激活免疫保護(hù)作用。本研究擬運用血清藥物化學(xué)和血清藥理學(xué)相結(jié)合的方法，研究麻黃附子細(xì)辛湯抗炎和免疫抑制的物質(zhì)基礎(chǔ)，旨在為將其開發(fā)成預(yù)防和治療過敏性鼻炎新制劑，提供一定的實驗依據(jù)與參考。

一、材料與方法

（一）材料

1.藥物與試劑。所用的藥物有麻黃、制附子、細(xì)辛，均為本院提供的正品。另有辛芩顆粒、醋酸潑尼松片等。

2.動物。Wistar大鼠，雌雄各半，體重（200±20）g，雌雄各半，體重18-22g，SPF級。適應(yīng)性飼養(yǎng)3d后，開始用于實驗。

3.細(xì)胞林。大鼠嗜堿性細(xì)胞白血病細(xì)胞株RBL-2H3。

4.儀器。CO₂培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、多功能酶標(biāo)儀、800B離心機(jī)等。

（二）方法

先制備麻黃附子細(xì)辛湯，濾液濃縮至1.80g-mL^-1生藥量。再制備含藥血清和空白血清的麻黃附子細(xì)辛湯。同時，制備體內(nèi)、外供試品溶液。采用色譜條件和質(zhì)譜條件進(jìn)行分析。第四，麻黃附子細(xì)辛湯含藥血清的抗炎作用研究含藥血清對抗原誘導(dǎo)。研究麻黃附子細(xì)辛湯含藥血清的免疫作用。制備小鼠脾細(xì)胞懸液，分析含藥血清對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)的影響。

（三）統(tǒng)計分析

所有數(shù)據(jù)用表示，采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析。如方差齊，組間兩兩比較采用LSD法；如方差不齊，組間兩兩比較采用DunnettsT3，億P<0.05為有差異性顯著。采用SPSS20.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行線性回歸分析（linear regression）。

二、結(jié)果

（一）LC-MS/Ms分析體內(nèi)外麻黃附子細(xì)辛湯成分

含藥血清與空白血清比較，含藥血清中發(fā)現(xiàn)32個移行成分，其中27個為原型成分，其他5個為未知成分。見圖l。

（二）麻黃附子細(xì)辛湯含藥血清對抗原誘導(dǎo)

麻黃附子細(xì)辛湯各時間點含藥血清，均能抑制抗原誘導(dǎo)的RBL-2H3肥大細(xì)胞釋放組胺（P<0.05）。但不同時間點的強(qiáng)度不同。麻黃附子細(xì)辛湯2h含藥血清抑制抗原誘導(dǎo)的R BL-2H3肥大細(xì)胞釋放組胺強(qiáng)度，顯著優(yōu)于15，30min，6h含藥血清組。

（三）麻黃附子細(xì)辛湯含藥血清對抗原誘導(dǎo)

與空白血清組相比，除麻黃附子細(xì)辛湯4h含藥血清外，其余各時間點含藥血清均能抑制抗原誘導(dǎo)的RBL-2H3肥大細(xì)胞釋放β-氨基已糖苷酶（P<0.05）。不同時間點的β-氨基已糖苷酶強(qiáng)度不同。

（四）麻黃附子細(xì)辛湯含藥血清對脂多糖（LPS）誘導(dǎo)

與空白血清組相比，麻黃附子細(xì)辛湯15，30min含藥血清組能顯著抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖（P<0.05）；麻黃附子細(xì)辛湯1，2，4，6h含藥血清組抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠脾細(xì)胞增殖效果不明顯，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。麻黃附子細(xì)辛湯15min含藥血清組與30min含藥血清組之間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

（五）血清藥物化學(xué)與血清藥理學(xué)指標(biāo)相關(guān)性分析

在被引入回歸方程的9個色譜峰中，P₃₁為細(xì)辛中的一個未定性成分、P32為麻黃中的一個未定性成分、P₈為甲基偽麻黃堿、P₆為偽麻黃堿、P₁₃為次烏頭原堿、P₂₂為苯甲酰次烏頭原堿、P₂₀為苯甲酰烏頭原堿、P₁₈為14-苯甲酰-10-羥基-中烏頭原堿、P₁₀為新烏頭原堿。

三、討論

血清藥物化學(xué)、血清藥理學(xué)在研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及藥理作用機(jī)制方面，日漸顯示出重要作用。二者結(jié)合既能深入研究入血成分，實現(xiàn)快速、準(zhǔn)確地研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，體現(xiàn)中藥多成分多靶點協(xié)同發(fā)揮藥效作用特點。在本研究中，血清藥物化學(xué)和血清藥理學(xué)指標(biāo)性成分相關(guān)性分析表明，與抗炎指標(biāo)相關(guān)的主要為未定性成分P32（麻黃）、未定性成分P31（細(xì)辛）、甲基偽麻黃堿、偽麻黃堿，且呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，說明這4個成分的血藥含量增高，抗炎作用增強(qiáng)，且這4個成分主要來源于麻黃與細(xì)辛，這與文獻(xiàn)報道一致；發(fā)現(xiàn)麻黃類生物堿中副作用最大的麻黃堿未被引入回歸方程。次烏頭原堿與抗炎指標(biāo)成正相關(guān)，機(jī)制尚不清楚。與免疫指標(biāo)相關(guān)的主要為附子的生物堿成分，苯甲酰次烏頭原堿、苯甲酰烏頭原堿、新烏頭原堿，呈現(xiàn)正相關(guān)，說明這3個成分的血藥含量增高，免疫抑制作用增強(qiáng)。這與文獻(xiàn)報道附子生物堿具免疫抑制作用一致。14-苯甲酰-10-羥基-中烏頭原堿與免疫指標(biāo)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)，機(jī)制尚不清楚。本文后續(xù)實驗將對各化學(xué)成分作進(jìn)行一步的結(jié)構(gòu)確認(rèn)，并對推測的藥效物質(zhì)進(jìn)行細(xì)胞實驗和整體動物實驗驗證。