海南地不容中總生物堿的提取及含量測(cè)定

程莎+莫國(guó)平+戴華+白麗麗

摘 要 采用正交試驗(yàn)法優(yōu)選海南地不容的提取工藝并進(jìn)行含量測(cè)定。以提取的總生物堿為考察指標(biāo)，醇的體積分?jǐn)?shù)、提取功率、提取時(shí)間、次數(shù)、料液比分別為考察因素，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定超聲提取總生物堿的最優(yōu)工藝。以鹽酸小檗堿為對(duì)照品，利用分光光度法在418 nm處測(cè)定海南地不容中總生物堿的含量。最佳工藝為醇體積分?jǐn)?shù)80%、超聲提取30 min、功率160 W、料液體積比1∶20、提取2次。小檗堿在0.0～18.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r=0.999 4）。平均回收率為99.03%，RSD=2.38%（n=6）?？偵飰A含量可達(dá)到4.67%。確定的提取工藝簡(jiǎn)單，用時(shí)少，提取率高。建立的測(cè)量方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好，適用于海南地不容中總生物堿的含量測(cè)定。

關(guān)鍵詞 海南地不容 ；總生物堿 ；提取 ；含量 ；正交試驗(yàn)

中圖分類號(hào) S567.236 ；R284 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2017.06.017

Extraction and Determination of Total Alkaloids from

Stephania hainanensis

CHENG Sha1） MO Guoping1） DAI Hua2） BAI Lili1）

（1 School of Pharmaceutical Sciences， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571199；

2 School of Public Health， Hainan Medical University， Haikou， Hainan 571199）

Abstract An orthogonal experiment was designed to screen an optimum method for extraction of total alkaloids from Stephania hainanensis. The total alkaloids extracted was used as an index， and ethanol volume fraction， extraction time， altrasonic power， extraction frequency were used as factors to design the orthogonal experiment to optimize the altrasonic extraction of the total alkaloids from S. hainanensis. The content of total alkaloids extracted was determined by using spectrophotometry at 418 nm with berberine hydrochloride as a reference substance. The extraction was identified optimum when the volume fraction of ethanol was 80%， the extraction time was 30 min， the altrasonic power was 160 W， the solid-liquid ratio was 1：20， and the extraction frequency was 2 times. Berberine hydrochloride had a good linear relationship （r=0.999 4） at the range of 0～18.0 μg/mL. The average recovery was 99.03% （RSD=2.38%）. The content of total alkaloids extracted was 4.67%. This extraction technology was proved to be simple， time saving and higher in extraction rate. The determination method for total alkaloids was easy， highly sensitive and good in repeatability， and can be used for determination of the content of total alkaloids from S. hainanensis.

Keywords Stephania hainanensis ； total alkaloids ； extraction ； determination ； Orthogonal experiment

地不容（Stephania Hainanensis Lo et Y Tsoong）又名金不換、山烏龜、金錢吊，是防己科千金藤屬草質(zhì)藤本，屬海南特有植物。生于海南島大山石縫、峭壁、亂石堆的半陰處或溪邊叢林中[1]。地不容作為海南黎族的傳統(tǒng)醫(yī)藥，味苦而辛，性涼，有小毒，具有清熱解毒、鎮(zhèn)靜、理氣、止痛等功效[2]。國(guó)內(nèi)外對(duì)該屬植物化學(xué)成分和藥理活性的研究較多[3-6]，但有關(guān)海南地不容總生物堿的提取以及含量測(cè)定卻鮮有報(bào)道。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，海南地不容中主要含有嗎啡型生物堿、阿撲啡型生物堿、原小檗堿型生物堿和異喹啉型生物堿等[3，7]。生物堿由于其抑菌[8]、消炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤[9]及促進(jìn)免疫功能等生物活性，成為近年來(lái)研究的熱點(diǎn)之一。有關(guān)生物堿的提取方法有多種[10]，利用超聲技術(shù)可以縮短提取時(shí)間、提高提取率，并且無(wú)需加熱，提高了熱敏性生物堿的提取率，且對(duì)其生理活性基本無(wú)影響。本文探索超聲法提取海南地不容總生物堿的最優(yōu)工藝，以鹽酸小檗堿為對(duì)照品，采用紫外分光光度法測(cè)定總生物堿的含量，為進(jìn)一步研究和開(kāi)發(fā)海南地不容的藥用價(jià)值提供基礎(chǔ)研究數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

地不容藥材采自海南興隆，經(jīng)海南醫(yī)學(xué)院曾念開(kāi)教授鑒定為防己科千金藤屬（Menispermaceae Stephania）海南地不容（S. hainanensis）塊根，晾干，粉成細(xì)粉，備用。

試驗(yàn)所用儀器：KQ-200KDE型高功率數(shù)控超聲清洗器（昆山超聲儀器有限公司）、RE-201D旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上?？粕齼x器有限公司）、UV1600型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京瑞利分析儀器有限公司）、B210S分析天平（北京賽多利斯有限公司）、PHS-3C型酸度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；試劑：鹽酸小檗堿（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)B21449）；溴甲酚綠（天津市鼎盛鑫化學(xué)試劑公司），檸檬酸（天津大茂化學(xué)試劑廠），檸檬酸鈉（天津大茂化學(xué)試劑廠），三氯甲烷，無(wú)水乙醇、氫氧化鈉均為國(guó)產(chǎn)分析純，水為蒸餾水。

1.2 方法

1.2.1 相關(guān)溶液配制

1.2.1.1 對(duì)照品溶液配制

精密稱定在110℃干燥至恒重的鹽酸小檗堿20 mg，置于25 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線，搖勻；精密量取上述溶液2.5 mL于10 mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度線，搖勻，得200 μg/mL的對(duì)照品溶液。

1.2.1.2 顯色液和緩沖液的配制

參照文獻(xiàn)[6]配制溴甲酚綠酸性染料溶液以及pH=5.0的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液。

1.2.1.3 供試品溶液配制

精密稱定海南地不容粉末2.0 g，分別加入70%乙醇，120 W功率，超聲提取30 min，提取2次，濃縮后經(jīng)氯仿提取，于50 mL容量瓶中定容，搖勻，低溫冷藏儲(chǔ)存，備用。

1.2.2 方法學(xué)考察

1.2.2.1 吸收波長(zhǎng)的選擇

精密量取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液與供試品溶液各0.3 mL，置分液漏斗中，加檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液5 mL，溴甲酚綠溶液2 mL，搖勻，加入氯仿10 mL，充分振搖，靜置1 h，分出氯仿層后，于300～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描，同時(shí)以氯仿作為空白參比液。

1.2.2.2 線性關(guān)系考察

精密量取鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.5、0.7、0.9 mL加水0.9、0.8、0.7、0.5、0.3、0.1 mL按1.2.2.1項(xiàng)操作，充分振搖后，靜置1.5 h，分出氯仿層，在418 nm處測(cè)定吸光度值，同時(shí)以氯仿作為空白對(duì)照。

1.2.2.3 穩(wěn)定性考察

取對(duì)照品0.3 mL，按1.2.2.1項(xiàng)操作后在，室溫條件下密閉放置，分別在0、10、15、30、60、90、120 min時(shí)測(cè)定于418 nm處吸光度。

1.2.2.4 精密度試驗(yàn)

精密量取對(duì)照品溶液0.3 mL，按1.2.2.1項(xiàng)操作后，平行測(cè)6次，以空白溶液作為參比。

1.2.2.5 重復(fù)性試驗(yàn)

取0.3 mL供試品溶液6份，按1.2.2.1項(xiàng)操作后，依次測(cè)定吸光度值，以空白溶液作為參比。

1.2.2.6 加標(biāo)回收試驗(yàn)

取0.3 mL供試品溶液6份，分別加入對(duì)照品溶液0.1 mL，按1.2.2.1項(xiàng)操作后，分別測(cè)定吸光度值。

1.2.3 提取工藝篩選

分別考察乙醇的體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間、提取功率、提取次數(shù)和料液比對(duì)總生物堿提取率的影響，并在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)確定超聲提取法的最優(yōu)工藝。

2 結(jié)果與分析

2.1 波長(zhǎng)的選擇

取對(duì)照品溶液與空白參比溶液分別于300～600 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)進(jìn)行掃描。結(jié)果表明：鹽酸小檗堿對(duì)照品溶液在418 nm處有最大吸收峰，而空白參比溶液在418 nm處沒(méi)有吸收，故本實(shí)驗(yàn)選定418 nm為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.2 線性關(guān)系考察

精密量取對(duì)照品溶液于418 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度值（A）縱坐標(biāo)，濃度（μg/mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖1所示，線性回歸方程為A=0.077+0.051 C，相關(guān)系數(shù)r=0.999 4。結(jié)果表明：鹽酸小檗堿在0.0～18.0 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液分別在0、15、30、60、90、120 min平行測(cè)定6次后，得其RSD=1.70%（n=6）。結(jié)果表明：小檗堿在0～120 min內(nèi)可以保持穩(wěn)定，滿足試驗(yàn)的要求。

2.3.2 精密度試驗(yàn)

取對(duì)照品溶液平行測(cè)定6次后，得其RSD=0.70%（n=6），結(jié)果表明儀器精密度良好，符合試驗(yàn)的要求。

2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn)

取供試品溶液平行測(cè)定6次后，得其RSD=1.56%（n=6），表明重現(xiàn)性良好，符合試驗(yàn)的要求。

2.3.4 加標(biāo)回收試驗(yàn)

如表1所示，回收率為96.76%～102.60%，平均回收率為99.03%，RSD=2.38%（n=6）。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)方法具有良好的回收率，滿足試驗(yàn)的要求。

2.4 單因素試驗(yàn)

2.4.1 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)提取效果的影響

由圖2-A可知，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大，海南地不容中總生物堿的提取率先降低后逐漸增大，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí)提取率有最大值。生物堿與乙醇體積分?jǐn)?shù)呈非線性關(guān)系，乙醇濃度過(guò)高或過(guò)低都不利于生物堿的提取，且濃度過(guò)高，提取成本也明顯增加，因此，選定60%、70%、80%作為正交的3個(gè)合理水平。

2.4.2 超聲功率對(duì)提取效果的影響

由圖2-B可知，隨著超聲功率的增大，總生物堿的提取率先增大，隨后開(kāi)始減小，再增大。在超聲功率為200 W時(shí)提取率達(dá)到最大值。從節(jié)能的角度考慮，超聲功率不宜過(guò)高，所以選定120、160、200 W為正交的3個(gè)合理水平。

2.4.3 超聲時(shí)間對(duì)提取效果的影響

由圖2-C可知，隨著超聲時(shí)間的增加，總生物堿的提取率逐漸增大，在超聲時(shí)間為40 min時(shí)提取率有最大值，之后，超聲時(shí)間對(duì)提取率的影響不大。因此，選定30、40、50 min作為正交的合理水平。

2.4.4 提取次數(shù)對(duì)提取效果的影響

由圖2-D可知，當(dāng)提取次數(shù)超過(guò)2次后，總生物堿的提取率趨于平穩(wěn)。從經(jīng)濟(jì)及效率的角度考慮，提取次數(shù)為2次較為理想，不再進(jìn)行優(yōu)化。

2.4.5 提取料液比的影響

由圖2-E可知，隨著料液比增大，總生物堿的提取率先增大后減小，當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，達(dá)到最大值，再增加料液比沒(méi)有增加提取率，反而造成試劑的浪費(fèi)。因此，選定料液體積比1∶15、1∶20、1∶25作為正交的合理水平。

2.5 正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，優(yōu)選4個(gè)因素設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，因素與水平見(jiàn)表2。正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析見(jiàn)表4。

對(duì)表3結(jié)果進(jìn)行直觀分析和方差分析可知，極差大小顯示各因素的影響作用依次為乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）>提取功率（C）>提取時(shí)間（B）>料液比（D），乙醇的體積分?jǐn)?shù)（A）和提取功率（C）對(duì)地不容中總生物堿的提取有顯著影響，提取時(shí)間（B）和料液比（D）對(duì)提取影響較小。從直觀分析圖中可看出，時(shí)間因素B1和B3對(duì)提取影響不是很明顯，從節(jié)能和效率的角度考慮選擇B1較為理想。因此，綜合直觀分析和方差分析的結(jié)果，確定海南地不容中總生物堿的最優(yōu)提取工藝為：A3B1C2D2，即乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，超聲提取30 min，功率為160 W，料液比為1∶20，提取2次。

2.6 工藝驗(yàn)證及總生物堿含量測(cè)定

為進(jìn)一步考察最優(yōu)工藝的穩(wěn)定性，精密稱取地不容粉末2.0 g，3份，按照最優(yōu)工藝提取得供試品溶液，測(cè)得海南地不容中總生物堿含量平均為4.67%，RSD=1.58%（n=6）。

2.7 回流法提取生物堿

精密稱定地不容粉末約2.0g，3份，置于圓底燒瓶中，用30mL乙醇加熱回流2h，提取2次。過(guò)濾，用氯仿萃取，顯色，定容，測(cè)定總生物堿的含量為2.58%，RSD=2.01%（n=3）。

3 討論

本研究采用超聲法提取海南地不容中的總生物堿，通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)法確定超聲提取總生物堿的最優(yōu)工藝為乙醇的體積分?jǐn)?shù)為80%，超聲提取30 min，功率為160 W，料液比為1∶20，提取2次。與加熱回流提取法比較，超聲法操作簡(jiǎn)單、用時(shí)少、節(jié)能環(huán)保、提取效率高。采用酸性染料比色法于紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)上測(cè)定總生物堿含量，由于氯仿可有效萃取生物堿-溴甲酚綠離子對(duì)，因此選定為萃取劑，但在測(cè)定吸光度值時(shí)，氯仿極易揮發(fā)，故應(yīng)快速測(cè)定，以免影響測(cè)量結(jié)果。本研究建立的測(cè)量方法簡(jiǎn)單、靈敏度高、重現(xiàn)性好、測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確，可用于地不容中總生物堿的含量測(cè)定。本研究探索的超聲提取方法可為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和利用海南地不容的藥用價(jià)值提供科學(xué)依據(jù)。

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