模擬地下CO2泄漏對土壤微生物群落的短期影響

張旺園，張紹良，陳 浮，2，侯湖平，馮啟言，馬 靜，2*

（1.中國礦業(yè)大學(xué)環(huán)境與測繪學(xué)院，江蘇 徐州 221043；2.中國礦業(yè)大學(xué)低碳能源研究院，江蘇省煤基CO2捕集與地質(zhì)儲存重點實驗室，江蘇 徐州 221008）

模擬地下CO2泄漏對土壤微生物群落的短期影響

張旺園1，張紹良1，陳 浮1，2，侯湖平1，馮啟言1，馬 靜1，2*

（1.中國礦業(yè)大學(xué)環(huán)境與測繪學(xué)院，江蘇 徐州 221043；2.中國礦業(yè)大學(xué)低碳能源研究院，江蘇省煤基CO2捕集與地質(zhì)儲存重點實驗室，江蘇 徐州 221008）

為研究地質(zhì)封存CO2泄漏對土壤微生物的影響，以徐州市褐潮土為研究對象，利用減壓閥和可調(diào)節(jié)流量計控制CO2的通入，模擬地質(zhì)封存CO2泄漏，測定CO2通氣處理前后的土壤理化性質(zhì)、酶活性以及微生物群落多樣性。結(jié)果表明：土壤CO2濃度的增加使土壤pH值降低，最大變化幅度為8.15降至7.29；硝態(tài)氮平均含量從通氣前的1.01 mg·kg-1上升至4.03 mg·kg-1，有機質(zhì)和有效磷含量變化明顯。土壤CO2濃度的增加抑制了FDA水解酶的活性，各組平均含量從22.69 mg·kg-1·h-1下降至11.25 mg·kg-1·h-1，多酚氧化酶活性上升幅度達230%，脲酶活性也表現(xiàn)為上升趨勢。土壤CO2濃度的增加導(dǎo)致Alpha多樣性降低，表現(xiàn)為Chao1指數(shù)減小，Shannon指數(shù)從7.35降低至6.23。在確定種類的微生物中，變形菌門豐度迅速增大，比例從29%增至64%，酸桿菌門比例從20%降至13.25%；在屬水平上，Methylophilus、Methylobacillus、Methylovorus三屬豐度增大，Gp4、Gp6、Gp7豐度減小，其余菌屬變化不明顯。CCA分析結(jié)果表明，在土壤CO2濃度增加條件下，硝態(tài)氮、脲酶、多酚氧化酶活性的增加，F(xiàn)DA水解酶活性、全磷、有效磷的減少與變形菌門、酸桿菌門物種豐度變化之間存在相關(guān)性。

地質(zhì)封存CO2泄漏；模擬試驗；土壤；微生物群落；理化性質(zhì)；酶活性

二氧化碳捕集與封存技術(shù)（Carbon Dioxide Capture and Storage，簡稱CCS），是指從點源將CO2分離捕集后注入深層地質(zhì)儲層，并長期與大氣隔離[1]。在全球經(jīng)濟快速發(fā)展以及化石能源燃料迅速消費的背景下，因減排潛力大，長期應(yīng)用成本低等優(yōu)勢，CCS被視為一項重要的減排手段[2]。但CCS技術(shù)存在著地質(zhì)封存泄漏的可能性。強烈的快速泄漏會引起生命財產(chǎn)的巨大損失，而CO2緩慢向上入侵土壤，將會引發(fā)土壤氣體、土壤水分、土壤pH以及土壤微生物群落組成的改變，進而引起土壤理化性質(zhì)和土壤環(huán)境的變化。因此，重新衡量CCS技術(shù)的利弊是至關(guān)重要的。

從先前的研究來看，土壤CO2濃度變化對土壤性質(zhì)產(chǎn)生影響是必然的。但受技術(shù)手段限制，實驗較難反映真實的泄漏情景，土壤性質(zhì)及微生物群落與環(huán)境因子的對應(yīng)關(guān)系并不清晰。鄧書林等[3]認為土壤CO2濃度升高主要通過影響氮等養(yǎng)分來限制真菌和細菌的生長；張丙華等[4]以勝利油田正在實施CO2驅(qū)油的某區(qū)塊土壤為研究對象，發(fā)現(xiàn)隨著CO2泄漏濃度的增大，土壤pH降低，土壤含水率和有機碳含量降低；張習(xí)美等[5]在開頂式氣箱（OTC）中采用盆栽試驗，發(fā)現(xiàn)CO2濃度升高可以顯著增加美洲商陸（Phytolaccaamericana Linn）根際土壤中細菌、放線菌、真菌的數(shù)量，增幅分別為19%～32%、41%～21%、25%～58%。尹飛虎等[6]在新疆石河子棉田土壤進行的試驗表明，當(dāng)CO2濃度升高到540 μmol·mol-1和720 μmol·mol-1時，0～40 cm土壤中細菌和0～20 cm土壤中放線菌數(shù)量均呈增加趨勢，20～40 cm土壤中真菌數(shù)量則呈減少趨勢；施翠娥等[7]開展的OTC平臺和青菜盆栽試驗結(jié)果表明，CO2升高不同程度地提高了土壤可溶性有機碳、全磷、總碳、銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量，進而不同程度地提高了土壤微生物量以及土壤各種酶活性。

本研究建立了廉價實用的簡易地質(zhì)封存CO2泄漏模擬裝置，完全滿足短期影響實驗的要求，不同于我們先前的大田模擬實驗平臺[8-9]。通過模擬泄漏、土樣采集、實驗測試，研究土壤理化性質(zhì)、酶活性以及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)對CO2泄漏的響應(yīng)，探討在土壤CO2增加的情況下，土壤環(huán)境因子變化與微生物群落變化之間的關(guān)系，揭示地質(zhì)封存CO2泄漏可能產(chǎn)生的生態(tài)風(fēng)險，旨在為建立CCS技術(shù)安全評估提供科學(xué)依據(jù)，促進CCS項目更快、更安全的實施。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)計和樣品采集

原始土樣為褐潮土[9]，來源于中國礦業(yè)大學(xué)南湖校區(qū)內(nèi)農(nóng)田（117.2°N，34.2°E），未經(jīng)人為處理。當(dāng)?shù)貙倥瘻貛Ъ撅L(fēng)性氣候，年均降水量800～930 mm，年均氣溫14℃。

將原始土樣裝入室外露天放置的花盆中，以進行CO2泄漏模擬實驗。花盆高度30 cm，土層厚度至少可達25 cm。通過將氣瓶、減壓閥、分流器、塑料管等裝置的連接，形成CO2輸出控制裝置。將塑料管固定在花盆底部中心位置，使其出氣口位置保持在底部以上2～3 cm處（圖1）。試驗設(shè)置無氣體通入的控制組和其他四組CO2泄漏脅迫組，調(diào)整減壓閥和可調(diào)節(jié)流量計使得進氣濃度始終保持在400、1000、1500、2000 μL· L-1?？刂平M記為C組，脅迫組根據(jù)CO2濃度高低分別記為L、M、H、E組，共5組處理，每組3個重復(fù)，共15盆。實驗過程中，每天進行實驗裝置的檢查，保證氣體通入不間斷，同時使用便攜式CO2檢測儀確定采集點濃度是否穩(wěn)定。

圖1 地質(zhì)封存CO2泄漏模擬裝置Figure 1 CO2geological storage leakage simulation appliance

自2016年3月19日開始通氣，共采樣6次。通氣前，即3月19日，采集第一批土樣，第二批至第五批采樣時間分別為4月1日、4月16日、5月1日、6月3日。6月3日采集土樣后立即結(jié)束通氣，一個月后，即7月4日，采集第六批土樣，嘗試觀察解除CO2泄漏脅迫后的土壤環(huán)境的恢復(fù)狀況。上述6個時間點分別記為0、10、25、40、70、100 d。

不同樣點采用隨機多點土壤混合樣，一部分放置室內(nèi)陰干，手工去除砂石和植物殘枝，研磨過100目篩，用于測試土壤理化性質(zhì)和酶活性，另一部分新鮮土樣存入-20℃冰箱備用。

1.2 土壤理化性質(zhì)測定

土壤pH用電位法測定；電導(dǎo)率用電導(dǎo)率儀測定；土壤有機質(zhì)用水合熱重鉻酸鉀氧化-比色法測定；硝態(tài)氮用紫外分光光度法測定；全磷含量采用酸溶-鉬銻抗比色法測定；有效磷采用氯化銨浸提-鉬銻抗比色法測定[10]。

1.3 土壤酶實驗

脲酶用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法測定，脲酶活性以24 h后1 g土壤中NH3-N的毫克數(shù)表示；用鄰苯三酚比色法測定多酚氧化酶，其活性以培養(yǎng)2 h后1 g土壤中紫色沒食子素的毫克數(shù)表示；蛋白酶用茚三酮比色法測定，其活性以24 h以后1 g土壤中氨基氮的毫克數(shù)表示[11]；脫氫酶用氯化三苯基四氮唑（TTC）法測定，離心比色后，將1 h產(chǎn)生1 μg TF的量作為一個酶活力單位[12]；熒光素二乙酸酯（FDA）水解酶用熒光素比色法測定[13]。各測試均設(shè)置三組重復(fù)，并分別設(shè)置無基質(zhì)的土壤和無土壤的基質(zhì)作對照組。

1.4 土壤DNA測序

采用E.Z.N.ATM Mag-Bind Soil DNA Kit的試劑盒提取土壤樣品DNA，從20個土壤樣本提取DNA進行PCR擴增。20個土樣分別為通氣前（0 d）5個樣，此處記為C0、L0、M0、H0、E0；通氣一個月后（40 d）15個樣，控制組記為C1、C2、C3，脅迫組記為L1、L2、L3；M1、M2、M3；H1、H2、H3；E1、E2、E3。

第一輪PCR擴增利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對基因組DNA精確定量，以確定PCR反應(yīng)加入的DNA量。PCR所用引物已經(jīng)融合了Miseq測序平臺的V3-V4通用引物，341F（CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG（barcode）CCTACGGGNGGCWGCAG）和805R（GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC）。50 μL PCR聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包含：5 μL 10×PCR buffer，0.5 μL dNTP（10 mmol·L-1each），10 ng Genomic DNA，兩個特異引物各0.5 μL（50 μmol·L-1），0.5 μL Plantium Taq（5 U·μL-1），最后用超純無菌水加至50 μL。PCR擴增程序如下：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s，持續(xù)5個循環(huán)周期；94℃變性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，持續(xù)20個循環(huán)周期；最后72℃持續(xù)10 min，降溫至10℃。隨后第二輪擴增程序，PCR體系除DNA增加至20 ng，其余與第一輪一致，擴增程序則為：95℃預(yù)變性30 s；95℃變性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，持續(xù)5個循環(huán)周期；最后72℃持續(xù)5 min則程序結(jié)束。

PCR擴增結(jié)束后，PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳檢測，再對DNA進行純化回收。對于細菌和古菌擴增的PCR產(chǎn)物和正常擴增片段在400 bp以上的PCR產(chǎn)物，選用0.6倍的磁珠（Agencourt AMPure XP）處理。利用Qubit 2.0 DNA檢測試劑盒對回收的DNA精確定量，以方便按照1∶1等量混合后測序。進行等量混合時，每個樣品DNA量取10 ng，最終上機測序濃度為20 pmol。

1.5 測序數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 20軟件對土壤理化性質(zhì)和酶活性測定結(jié)果進行配對樣本t檢驗，將脅迫組與控制組數(shù)據(jù)進行差異性分析，可判定CO2通氣處理是否對土壤存在影響；同時對各脅迫組之間也進行差異性分析，判斷不同濃度的CO2是否產(chǎn)生不同影響。

測序所得原始數(shù)據(jù)采用雙端（Pair-end）FASTQ格式保存（R1.fastq和R2.fastq，Read1和Read2序列）。先對原始序列進行去接頭、質(zhì)量剪切等處理（即質(zhì)量控制），再通過去除特異性擴增序列及嵌合體等預(yù)處理，然后運用Qiime軟件進行OTU聚類分析，將序列劃分為操作分類單元（OTU）。根據(jù)樣本OTU數(shù)據(jù)，利用Mothur計算Chao1和Shannon豐富度指數(shù)，衡量樣本物種多樣性，隨后篩選每個OTU代表性序列，采用RDP classifier將序列進行物種分類，賦予物種分類單元。對每個樣本和每個物種單元分類進行序列豐度計算，已分類Reads數(shù)目較少的菌群種屬歸入Others，未確定種屬的菌群歸入Unclassified，并結(jié)合Origin 8構(gòu)建樣本和物種分類單元序列豐度矩陣，得到物種豐度條形圖。為檢測環(huán)境因子、樣品、菌群三者之間的關(guān)系，利用Canoco windows for 4.5將0 d和40 d的土壤理化性質(zhì)、酶活性、OTU信息數(shù)據(jù)繼續(xù)做CCA分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 地質(zhì)封存CO2泄漏對土壤理化性質(zhì)的影響

原始土樣為褐潮土，通氣前土壤pH為8.12± 0.03，電導(dǎo)率為（203.78±4.43）μS·cm-1，有機質(zhì)含量為（15.13±0.40）g·kg-1，有效磷和全磷含量分別為（15.99± 1.22）mg·kg-1和（0.41±0.01）g·kg-1，硝態(tài)氮和全氮含量分別為（1.02±0.04）mg·kg-1和（0.85±0.07）g·kg-1。

圖2A顯示，土壤pH在CO2脅迫下發(fā)生顯著變化（P＜0.05），相對控制組，脅迫組pH值隨著通氣時間的增加呈現(xiàn)顯著下降趨勢（P＜0.05）。L組、M組的pH值最終下降至7.34左右，而H、E組在100 d時已下降至7.29。隨著通氣的進行，pH值下降趨勢為先迅速下降，后逐漸趨于平緩，可能是由于CO2通氣造成的酸性影響趨于穩(wěn)定。電導(dǎo)率在通氣階段僅略有波動，基本穩(wěn)定，無顯著差異（圖2B）。

土壤有機質(zhì)是評價土壤肥力和質(zhì)量的重要指標(biāo)[14]。圖2C顯示土壤有機質(zhì)呈急劇下降后上升的趨勢。0～40 d期間，有機質(zhì)含量基本為下降趨勢，到70 d出現(xiàn)急劇增加的現(xiàn)象?；謴?fù)期階段，有機質(zhì)含量再次下降至接近初始含量，但控制組和脅迫組之間無明顯差異。

磷是植物生長發(fā)育不可缺少的營養(yǎng)元素，但絕大部分以非有效態(tài)積累于土壤中[15]。由圖2D可知，土壤有效磷總體變化趨勢復(fù)雜，表現(xiàn)為大幅升降。全磷變化趨勢較有效磷平緩（圖2E），經(jīng)檢驗控制組及各脅迫組之間無顯著差異，從通氣時長上來看，表現(xiàn)為前期累積，隨后消耗，后期保持不變。

CO2脅迫通過影響氮固定、硝化作用、反硝化作用、厭氧氨氧化等過程，影響土壤中的氮含量[16]。圖2F顯示各脅迫組硝態(tài)氮含量呈波動性上升，前期變化顯著，且各脅迫組相比控制組在CO2通氣后出現(xiàn)顯著變化（P＜0.05）。通氣前，各脅迫組平均值為1.01 mg·kg-1，而100 d時高達4.03 mg·kg-1。全氮含量略有波動，但無顯著變化（圖2G）。

2.2 地質(zhì)封存CO2泄漏對土壤酶活性的影響

土壤酶在土壤生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量轉(zhuǎn)化中起著重要的作用，是比理化性質(zhì)更敏感的指標(biāo)[17]。

經(jīng)檢驗，脅迫組和控制組的FDA水解酶含量存在顯著的差異（P＜0.05），說明CO2泄漏對FDA水解酶活性產(chǎn)生一定的抑制作用（圖3A）。通氣前各脅迫組FDA水解酶含量平均值為22.69 mg·kg-1·h-1，至100 d時已降至12.15 mg·kg-1·h-1。不同濃度脅迫組的響應(yīng)程度相似，不存在顯著差異。多酚氧化酶活性在通氣后出現(xiàn)顯著（P＜0.05）上升趨勢（圖3B）。根據(jù)通氣時長分析，各脅迫組在通氣初期立即出現(xiàn)活性變化，且變化顯著（P＜0.05），通氣后期雖有變化，但并不顯著，至100 d平均值相比通氣前增加了約230%，100 d恢復(fù)期的活性相對于70 d無變化。

蛋白酶活性無顯著變化。圖3C表明，通入CO2后蛋白酶活性出現(xiàn)波動，隨后基本不變。土壤脲酶和脫氫酶分別是影響尿素水解、氮素循環(huán)和土壤微生物活性的重要酶類[18]。圖3D表明，脫氫酶出現(xiàn)降-升-降的趨勢，變化顯著（P＜0.05），但各脅迫組響應(yīng)的時間點并不相同，總體上無顯著變化。經(jīng)檢驗，脲酶相鄰脅迫組之間存在顯著差異，通氣時長對脲酶活性也存在顯著影響（P＜0.05）。由圖3E可知，脲酶在10 d時含量下降，隨后上升并保持穩(wěn)定，且M組、E組上升幅度大于L組、H組。

2.3 地質(zhì)封存CO2泄漏對土壤微生物群落的影響

取通氣前及通氣一個月之后（40 d）的20個土壤樣本進行微生物多樣性檢測，0、40 d時樣本標(biāo)記與前文相同。Alpha多樣性分析可以反映微生物群落的多樣性和豐富度，結(jié)果如表1所示。對比通氣后各組Chao1指數(shù)可以發(fā)現(xiàn)，隨著通氣的進行和CO2脅迫濃度的增加，土壤群落豐富度在C、L、M組不斷下降，H、E組又出現(xiàn)微弱的上升。Shannon指數(shù)用于衡量群落的異質(zhì)性，數(shù)據(jù)顯示CO2濃度越高，香農(nóng)指數(shù)越低，說明土壤中微生物群落多樣性在CO2脅迫下降低。

圖4A顯示，20個樣本中所含菌群門類較豐富。變形菌（Proteobacteria）、酸桿菌（Acidobacteria）、擬桿菌（Bacteroidetes）、疣微菌（Verrucomicrobia）、放線菌（Actnobacteria）、芽單胞菌（Gemmatimonadetes）、綠彎菌（Chloroflexi）、浮霉菌（Planctomycetes）、厚壁菌（Firmicutes）、藍藻菌（Cyanobacteria）在各供試土樣中均有分布。變形菌門相對豐度最大，0 d時平均比例高達30.5%，隨著CO2濃度增加其豐度增大，E組變形菌門豐度甚至高達64%，是供試土樣的優(yōu)勢菌門。酸桿菌門的平均豐度從通氣前的20%降低至13.25%。其余門類豐度變化基本呈降低趨勢。

圖2 土壤理化性質(zhì)變化情況Figure 2 Change in soil physical and chemical properties

圖3 土壤酶活性變化情況Figure 3 Changes in soil enzyme activity

在屬水平上，按平均豐度大小排列的前11個屬中，變形菌門中的嗜甲基菌屬（Methylophilus）、甲基芽孢桿菌（Methylobacillus）、甲基營養(yǎng)菌（Methylovorus）在通氣后豐度迅速增長，而且CO2脅迫濃度越高，豐度越大（圖4B）。控制組三屬比例為0.1%、0.07%、0.01%，E組分別增加至22%、10.3%、10.2%。酸桿菌門的三個屬Gp6、Gp4、Gp7，在通氣脅迫下表現(xiàn)為抑制生長。

由于單因子無法完整解釋土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化，本研究引入典范對應(yīng)分析（Canonical correspondence analysis，CCA），解析多個環(huán)境因子和微生物群落之間的關(guān)系，結(jié)果如圖5所示。為使結(jié)果更加顯著，簡化0 d樣方信息，選擇C0、M0、H0重新定義為K1、K2、K3，其余標(biāo)記與前文相同?？紤]OTU序列特征，選擇豐度較大且具有樣點特征的15個OTU作為物種信息元數(shù)據(jù)。10個環(huán)境因子分別為pH、有機質(zhì)、有效磷、全磷、硝態(tài)氮、FDA水解酶、多酚氧化酶、蛋白酶、脫氫酶、脲酶。

結(jié)果（圖5A）表明，未通氣K組與一個月后控制組物種信息相近。脅迫組的微生物對應(yīng)菌屬豐度均產(chǎn)生明顯變化。比較樣方和物種的直線距離發(fā)現(xiàn)，OTU01、OTU02、OTU04、OTU05、OTU13相對其他OTU距離控制組樣方更遠，距脅迫組更近，說明這部分OTU隨脅迫組變化，相關(guān)性較大。

表1 土壤微生物Alpha多樣性Table 1 Alpha diversity of soil microorganism

圖4 樣本菌群豐度條形圖Figure 4 Abundance barplot of genus and phylum

圖5 環(huán)境因子與樣點、環(huán)境因子與OTU的CCA分析圖Figure 5 CCA environ+samples、environ+OTU analysis charts

同時，沿箭頭方向，樣方中的環(huán)境變量值增加，說明脅迫組中，硝態(tài)氮、脲酶、多酚氧化酶的含量是增加的。其余環(huán)境因子變量不同程度減小，僅部分樣方的脫氫酶含量增加，該結(jié)果與前文理化性質(zhì)及酶活性分析結(jié)果一致。環(huán)境因子和物種信息的相關(guān)性，可以通過物種點與中心點連線在環(huán)境因子箭頭上的投影來表示。圖5B表明，左側(cè)硝態(tài)氮、脲酶、多酚氧化酶和OTU01、OTU02、OTU04、OTU05、OTU13相關(guān)性較大。剩余環(huán)境因子，除脫氫酶外，與其他OTU信息相關(guān)性較大。根據(jù)酶的來源[19]推測，土壤CO2濃度升高，直接影響理化性質(zhì)及土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，從而影響酶活性。同時，理化性質(zhì)和酶活性的改變間接影響土壤群落結(jié)構(gòu)。因此，CO2脅迫下，硝態(tài)氮、脲酶、多酚氧化酶活性的增加及FDA水解酶、蛋白酶活性的減少可能導(dǎo)致OTU01等豐度的增加和OTU06、OTU07等豐度的減少，同時，OTU01等豐度增加產(chǎn)生的群落結(jié)構(gòu)變化促進了酶活性的變化。

3 討論

在本試驗中，供試材料為徐州市地區(qū)褐潮土，屬弱堿性土壤。土壤CO2濃度的增加使得土壤pH值大幅降低，而對電導(dǎo)率則基本無影響，有效磷和有機質(zhì)變化復(fù)雜，其余理化性質(zhì)與對照組無明顯差異，與先前報道[4]一致。在無植物土壤中，有機碳來源主要為微生物代謝活動，因此CO2濃度增加可能導(dǎo)致微生物數(shù)量下降從而影響有機質(zhì)含量。CO2氣體進入土壤后，形成酸性環(huán)境，可以通過影響碳酸根離子的濃度來改變銨根離子濃度，同時也可以通過形成厭氧環(huán)境來影響厭氧氨氧化過程。同理，土壤CO2濃度的增加可能促進了硝化作用，從而使得硝態(tài)氮濃度增加。

影響土壤酶活性的因素很多，土壤重金屬污染以及不良水熱條件會對土壤酶活性和土壤微生物多樣性產(chǎn)生影響[19]。本實驗中土壤CO2濃度的增加使得FDA水解酶活性出現(xiàn)明顯的下降，對多酚氧化酶和脲酶都表現(xiàn)出不同程度的促進作用，與先前報道[18]一致。脫氫酶活性與呼吸代謝作用相關(guān)，因此其復(fù)雜變化可能與CO2濃度升高后抑制土壤微生物呼吸代謝有一定關(guān)系。

結(jié)合Alpha多樣性以及物種豐度圖分析，土壤CO2濃度增加使得變形菌門豐度增加，微生物群落結(jié)構(gòu)逐漸趨于單一，證實了先前報道的結(jié)論[20-22]。Sibanc等[23]研究發(fā)現(xiàn)CO2濃度升高會導(dǎo)致土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化，但是優(yōu)勢種群不變而其豐度上升，與本研究結(jié)論基本一致。本研究中，在CO2通氣影響下，微生物群落多樣性略有變化，豐富度明顯越低，說明CO2模擬泄漏已產(chǎn)生重要影響。張帆等[24]對鄂爾多斯CO2地質(zhì)封存地區(qū)的土壤研究過程中，得到了高濃度CO2入侵包氣帶對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生顯著影響的結(jié)論，與本研究相似。另外，在CO2通氣過程中，不同微生物豐度出現(xiàn)的變化不同，與Dunbar等[25]在11年的大氣CO2濃度升高變化過程中檢測到的細菌群落豐度明顯增加趨勢有所不同。本實驗中酸桿菌門和擬桿菌門豐度也較高。土壤CO2濃度增加使得疣微菌門、放線菌門、芽單胞菌門豐度下降。也有研究表明，隨著CO2泄漏時間的變化，土壤中不同門類細菌豐度變化不同[20]。

在屬水平上，由CO2泄漏導(dǎo)致的土壤微生物屬水平測定結(jié)果可知，變形菌門下的嗜甲基菌、甲基芽孢桿菌、甲基營養(yǎng)菌豐度上升。針對嗜甲基菌屬的研究目前國內(nèi)較少，國外較多，而在地質(zhì)封存CO2泄漏脅迫研究中，尚未有提及嗜甲基菌屬的報道，測序結(jié)果分析一般表示到變形菌門為止。嗜甲基菌屬于變形菌門下β-變形菌綱，是一種專性甲基營養(yǎng)菌，因此土壤CO2濃度增加可能促進土壤中某些帶甲基有機物質(zhì)或其他間接刺激變量的增加，導(dǎo)致環(huán)境發(fā)生更適于嗜甲基菌的變化。Tsujimoto等[26]設(shè)計了甲基營養(yǎng)嗜甲基菌（Methylophilus methylotrophus）的L-賴氨酸的生物合成方式，研究表明嗜甲基菌有一個良好的賴氨酸生成量的控制系統(tǒng)。Xia等[27]在用甲烷富集甲烷氧化菌的過程中，從自來水中分離出了Methylophilus sp. TWE2，并通過其完整序列探究利用該細菌將甲烷基團轉(zhuǎn)換成甲醛的途徑。Khan等[28]通過在微生物菌劑中添加淀粉作為碳源提高了TNT的解毒效果，并在培養(yǎng)過程中發(fā)現(xiàn)嗜甲基菌豐度急劇增長逐漸成為優(yōu)勢菌屬。具體的相關(guān)變量因子，將在未來試驗中作更詳細的探索。

通氣后，土壤中的酸桿菌門下三屬Gp6、Gp4、Gp7豐度下降。王春香等[29]的研究提到，酸桿菌是異養(yǎng)型微生物，其在土壤中的分布隨著碳源濃度的變化而改變。Lauber等[30]的研究指出，土壤中酸桿菌相對豐度與土壤pH呈顯著負相關(guān)。其他學(xué)者亦發(fā)現(xiàn)，向土壤中施加氮肥會導(dǎo)致酸桿菌豐度降低。此外，研究還發(fā)現(xiàn)酸桿菌的相對豐度與平均降水量、土壤有機碳含量和土壤碳氮比呈顯著的正相關(guān)[20，23，31]。然而，中性甚至堿性的環(huán)境中也檢測到了酸桿菌的基因序列[32]，與本次實驗結(jié)果一致。此外，近幾年對酸桿菌屬的研究打破了一些既定規(guī)律，如對我國東北旱地黑土農(nóng)田細菌群落結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)[33]，黑土農(nóng)田中酸桿菌相對豐度與土壤pH值沒有顯著的相關(guān)關(guān)系。Jones等[34]對北美和南美的87個土壤樣品大尺度分析發(fā)現(xiàn)酸桿菌亞群Gp1、Gp2、Gp3、Gp12、Gp13和Gp15相對豐度與pH值呈顯著負相關(guān)關(guān)系，而Gp4、Gp6、Gp7、Gp10、Gp11、Gp16、Gp17、Gp18、Gp22和Gp25相對豐度與pH值呈顯著正相關(guān)關(guān)系。因此，不同屬的酸桿菌對土壤pH的響應(yīng)不同。

總之，小型模擬試驗仍需要長期持續(xù)定點監(jiān)測，完善監(jiān)測數(shù)據(jù)序列，提高試驗的操作便利性和數(shù)據(jù)的精確度，力求達到從機理上詳細解析土壤對CCS泄漏的反饋過程，在此基礎(chǔ)上優(yōu)化大田試驗方案，縮短試驗周期并節(jié)約經(jīng)費。

4 結(jié)論

（1）土壤CO2濃度的增加較大程度地改變了土壤理化性質(zhì)。土壤pH值、有效磷、有機質(zhì)以及硝態(tài)氮含量發(fā)生明顯變化。

（2）土壤CO2濃度的增加影響了土壤酶活性。FDA水解酶活性明顯下降，多酚氧化酶和脲酶活性增強，蛋白酶和脫氫酶活性變化不甚明顯。

（3）土壤CO2濃度的增加對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)影響顯著。隨著土壤CO2濃度的增加，變形菌門所占豐度上升，其余菌門基本表現(xiàn)為抑制作用，土壤微生物結(jié)構(gòu)多樣性逐漸降低，趨于單一。

（4）地質(zhì)封存CO2泄漏對土壤環(huán)境的擾動作用較大，可能出現(xiàn)危害性較大甚至不可逆的生態(tài)風(fēng)險。因此，需盡快完善CCS技術(shù)安全評估系統(tǒng)，建立CO2泄漏控制措施。

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Short-term effects of simulated underground CO2leakage on the soil microbial community

ZHANG Wang-yuan1,ZHANG Shao-liang1,CHEN Fu1,2,HOU Hu-ping1,FENG Qi-yan1,MA Jing1,2*
（1.School of Environment Science and Spatial Informatics,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221043,China;2.Coal-based CO2Capture and Geological Storage Key Laboratory,Low Carbon Energy Institute,China University of Mining and Technology,Xuzhou 221008,China）

The technology of CO2Capture and Storage（CCS）has provided a new option for mitigating global anthropogenic CO2emissions with its unique advantages.The potential risk of gas leakage from CO2sequestration and utilization processes has been attracting a large amount of attention.In addition,the resulting threat to soil ecosystems cannot be ignored.In this paper,a simulation experiment was designed to investigate the effects of CO2geological storage leakage on the soil microbial consortia,with fluvo-aquic soil as the research subject.A pressure relief valve and an adjustable flow meter were used to control the amount of CO2injected into the soil during the experiment. By comparing soil physicochemical properties,enzyme activity,and microbial community diversity before and after stress treatments of different CO2concentrations,some interesting results were obtained.The increase of soil CO2concentration decreased the soil pH,and the maximum variation amplitude ranged from 8.15 to 7.29.Nitrate nitrogen average content varied from 1.01 mg·kg-1to 4.03 mg·kg-1,whereas, both Olsen-phosphorus and organic matter contents changed significantly.The increase of soil CO2concentration inhibited the activity offluorescein diacetate（FDA）hydrolytic enzyme,with the average content varying from 22.69 mg·kg-1·h-1to 11.25 mg·kg-1·h-1,whereas the activity of polyphenol oxidase enzyme increased by 230%.The urease activity also increased.The increase of soil CO2concentration decreased the alpha diversity of the soil microbial community.The Chao1 index decreased and the Shannon index reduced from 7.35 to 6.23. Of the identified microorganisms,the abundance of Proteobacteria increased rapidly,with the proportion rising from 29%to 64%.However, the proportion of Acidobacteria decreased from 20%to 13.25%.On the genus level,the abundances of Methylophilus,Methylobacillus,and Methylovorus increased,whereas the abundances of Gp4,Gp6,and Gp7 decreased.Moreover,the abundances of other genera did not show obvious changes.The canonical correspondence analysis results showed that there was a correlation between the abundance variations of Proteobacteria and Acidobacteria and the increasing nitrate nitrogen,urease and polyphenol oxidase enzyme activities,as well as the decreasing FDA hydrolytic enzyme activity and Olsen-phosphorus and total phosphorus contents.These results might be useful for evaluating the risk of potential CO2leakages on the ecosystems associated with CCS processes.

CO2geological storage leakage;simulation experiment;soil;microbial community;physicochemical properties;enzyme activity

S154.3

A

1672-2043（2017）06-1167-10

10.11654/jaes.2016-1559

2016－12－06

張旺園（1993—），女，浙江舟山人，碩士研究生，從事環(huán)境微生物學(xué)研究。E-mail：zwy2014zs@126.com

*通信作者：馬 靜 E-mail：jingma2013@cumt.edu.cn

國家科技支撐計劃課題（2012BAC24B05）；江蘇省煤基CO2捕集與地質(zhì)儲存重點實驗室開放基金項目（2015A01，2015B02）

Project supported：The National Key Technology Research and Development Program of the Ministry of Science and Technology of China（2012BAC24B05）；Opening-funds Projects of the Key Laboratory of Coal-based CO2Capture and Geological Storage of Jiangsu Province（2015A01，2015B02）

張旺園，張紹良，陳 浮，等.模擬地下CO2泄漏對土壤微生物群落的短期影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報,2017,36（6）：1167-1176.

ZHANG Wang-yuan,ZHANG Shao-liang,CHEN Fu,et al.Short-term effects of simulated underground CO2leakage on the soil microbial community[J].Journal of Agro-Environment Science,2017,36（6）:1167-1176.