蘿卜葉不同萃取物對(duì)乙酰膽堿酯酶抑制活性研究

王樂　黃明遠(yuǎn)　高品一　劉學(xué)貴

摘要 [目的]研究蘿卜葉不同萃取組分對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制活性。[方法]通過對(duì)蘿卜葉水提原液、水提不同萃取組分及萃取后的水相進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制活性測試，對(duì)蘿卜葉抑制乙酰膽堿酯酶能力進(jìn)行評(píng)價(jià)。[結(jié)果]以石杉?jí)A甲為對(duì)照，蘿卜葉不同萃取物對(duì)乙酰膽堿酯酶的抑制能力從大到小依次為石杉?jí)A甲、二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、石油醚組分、正丁醇組分、水相、蘿卜葉水提原液。[結(jié)論]蘿卜葉具有較好的乙酰膽堿酯酶抑制活性，并呈現(xiàn)一定的濃度依賴性。

關(guān)鍵詞 不同萃取組分；乙酰膽堿酯酶；抑制活性；蘿卜葉水提原液；水相

中圖分類號(hào) S188 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 0517-6611（2017）01-0120-02

Study of Inhibitory Activity of Different Extracts from Radish Leaves to Acetylcholinesterase

WANG Le， HUANG Mingyuan， GAO Pinyi， LIU Xuegui*

（College of Pharmaceutical and Biological Engineering， Shenyang University of Chemical Technology， Shenyang， Liaoning 110142）

Abstract [Objective] To study inhibitory activity of different extraction fractions from radish leaves to acetylcholinesterase. [Method] The inhibitory activities of different polarities of water extracts from radish leaves to acetylcholinesterase were determined and the ability of radish leaves inhibiting acetylcholinesterase was evaluated. [Result] Using huperzine as the control， the order of inhibiting ability from strong to weak is huperzine， dichloromethane layer， ethyl acetate layer， petroleum ether layer， butanol layer， waterphase， radish leaf extract . [Conclusion] Radish leaves have a good inhibitory activity to acetylcholinesterase and present a concentrationdependent manner.

Key words Different extraction fractions；Acetylcholinesterase；Inhibitory activity；Radish leaf extract；Waterphase

蘿卜（Raphanus sativus L.）古漢語中又稱萊菔、雹突、菜頭等，始載于《唐本草》，是生活中常見的蔬菜，為十字花科蘿卜屬1～2年生草本植物[1]。蘿卜根部為主要的食用部位；蘿卜葉又名萊菔葉、蘿卜纓，其纓葉性味甘苦平，主要功能消食理氣[2]?；瘜W(xué)分析證明，蘿卜葉的主要成分是精油和多種維生素，還含微量元素和抗病毒成分[1-2]。

在生物體內(nèi)，乙酰膽堿酯酶（AChE）是以一種蛋白質(zhì)為結(jié)構(gòu)的生物催化劑，在神經(jīng)傳導(dǎo)過程中起關(guān)鍵作用，能降解乙酰膽堿，使得神經(jīng)遞質(zhì)在突觸后膜上失去活性，從而保證信號(hào)的正常傳導(dǎo)。AChE在體內(nèi)一般有6種不同的分子形式，包括3種球形與3種膠原尾樣亞基連接形成的不對(duì)稱形式，其主要在肝臟中合成，AChE在人體的紅細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、肝細(xì)胞甚至在骨細(xì)胞中廣泛表達(dá)[3]。乙酰膽堿酯酶抑制劑（AChEI）一般是從天然產(chǎn)物中提取出來的，主要為生物堿類、萜類、酚類等[4]。在天然產(chǎn)物中分離提取AChEI目前已經(jīng)成為醫(yī)藥研究的重點(diǎn)[3-6]。筆者通過對(duì)蘿卜葉水提原液、水提不同萃取成分及萃取后的水相進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制活性研究，旨在為發(fā)現(xiàn)天然乙酰膽堿酯酶抑制劑提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 研究對(duì)象。

白蘿卜葉產(chǎn)于遼寧省沈陽市，經(jīng)鑒定為蘿卜的葉子。

1.1.2 主要儀器。

電子天平TD5102（余姚市金諾天平儀器有限公司），ZF-20D暗箱式紫外分析儀（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），Biotek Synergy2多功能酶標(biāo)儀（基因有限公司），薄層色譜展開缸（上海信宜儀器廠制造），HZC 超聲波清洗器（福州志科學(xué)儀器公司），UV-3200PC紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），RE-5205旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮有限公司）。

1.1.3 主要試劑。

二甲基亞砜（DMSO，博迪化工股份有限公司），乙酰膽堿酯酶（AChE，北京索萊寶科技公司），PBS粉末（北京索萊寶科技公司），石杉?jí)A甲對(duì)照品（北京索萊寶科技公司），二硫二硝基苯甲酸（DTNB，北京索萊寶科技公司），碘代硫代乙酰膽堿（ATCI，北京索萊寶科技公司），其他化學(xué)試劑均為分析純。

1.2 方法

1.2.1 蘿卜葉不同萃取組分的制備。

將4 kg干燥的蘿卜葉放在恒溫水浴鍋中，設(shè)置溫度為20 ℃，加8 L蒸餾水，浸泡水解18 h；提取3次，減壓濃縮，得到濃縮液4 000 mL。取1 000 mL濃縮液，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇1 000 mL萃取3次，萃取完畢，旋蒸，揮干，制得4個(gè)不同極性萃取組分的浸膏，待用[5]。

1.2.2 樣品溶液的配制。

將蘿卜葉中不同萃取組分加入不同劑量的0.1% PBS-DMSO溶液分別配制成濃度為2、100、400、800 μg/mL的樣品儲(chǔ)備液，待用。

1.2.3 其他溶液的配制。

1.2.3.1

PBS緩沖液的配制。

將PBS粉末通過定容配制成pH 7.4、0.1 mol/L的PBS緩沖液。

1.2.3.2

P-D溶液的配制。

量取10 μL二甲基亞砜至15 mL的EP管中，加入9.99 mL PBS緩沖液，配制成P-D溶液。

1.2.3.3

DTNB的配制。

稱取40 mg DTNB加入無水乙醇將其配制成10 mmol/L的溶液，將溶液保存在4 ℃環(huán)境中。

1.2.3.4

底物ATCI的配制。

準(zhǔn)確稱取43 mg ATCI加入無水乙醇將其配制成15 mmol/L的ATCI溶液。

1.2.4 活性測試試驗(yàn)。

1.2.4.1 原理。

由于碘代硫代乙酰膽堿在AChE的作用下能夠分解生成碘代硫代膽堿，碘代硫代膽堿與顯色劑（DTNB）反應(yīng)生成5-巰基-2-硝基苯甲酸，而生成的5-巰基-2-硝基苯甲酸能夠在405 nm下具有紫外光吸收的黃色物質(zhì)[5]，反應(yīng)原理方程式見圖1。

1.2.4.2 步驟。

主要采用改良的酶標(biāo)儀法（Ellman法[6]）對(duì)蘿卜葉不同萃取組分進(jìn)行測試，步驟主要在于樣品組、樣品本底組以及對(duì)照組之間通過檢測其吸光度值來觀察乙酰膽堿酯酶抑制活性。

樣品組：在96孔酶標(biāo)板上中依次加入140 μL 0.1 mol/L pH 7.4的PBS緩沖液、20 μL樣品溶液、15 μL 0.4 U/mL AChE，在4 ℃條件下反應(yīng)20 min。加入10 μL 15 mmol/L底物ATCI，再加入20 μL 10 mmol/L DTNB，在37 ℃條件下反應(yīng)30 min，用酶標(biāo)儀在405 nm處測定其吸光度值，每組試驗(yàn)做3次平行試驗(yàn)。

樣品本底組：用15 μL PBS緩沖液代替15 μL AChE溶液，其他條件不變。

空白對(duì)照組：用20 μL PBS緩沖液代替20 μL樣品溶液，其他條件不變。

完全抑制對(duì)照組：用20 μL PBS緩沖液配制石杉?jí)A甲溶液（0.1 mg/mL）。

抑制率=[（空白組-完全抑制組）-（樣品組-樣品本底組）]/（空白組-完全抑制組）×100%，各組值均為吸光度值。

2 結(jié)果與分析

蘿卜葉經(jīng)過水提取以及石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇依次萃取，得到石油醚組分、二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、正丁醇組分、蘿卜葉水提原液、水相和石杉?jí)A甲7個(gè)樣品溶液。對(duì)這7個(gè)樣品分別進(jìn)行乙酰膽堿酯酶抑制活性檢測[7]。

由圖2可見，蘿卜葉不同萃取組分樣品均表現(xiàn)出一定的乙酰膽堿酯酶抑制活性，且其乙酰膽堿酯酶抑制活性與其樣

品濃度均表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。在樣品濃度梯度較

低時(shí)，抑制率隨著濃度增加近似為線性關(guān)系， 而濃度較大時(shí)抑制率趨于穩(wěn)定。其中二氯甲烷組分具有相對(duì)最強(qiáng)的AChE抑制活性，對(duì)其相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析得其IC50為344.02 μg/mL。 乙酸乙酯及石油醚組分對(duì)AChE也表現(xiàn)出較好的抑制活性，且呈明顯的線性相關(guān)， IC50分別為369.27、371.12 μg/mL。正丁醇組分的AChE活性相對(duì)較弱。蘿卜葉水提取原液及水相的AChE抑制效果不佳。

根據(jù)7個(gè)樣品的抑制曲線，確定各樣品的IC50值（表1）。結(jié)合圖2和表1可以確定，7個(gè)樣品的抑制能力從大到小依次為石杉?jí)A甲、二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、石油醚組分、正丁醇組分、水相、蘿卜葉水提原液。但參考陽性對(duì)照石杉?jí)A甲，發(fā)現(xiàn)蘿卜葉水提取物各萃取組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性相對(duì)偏低。

3 結(jié)論

對(duì)蘿卜葉中不同萃取組分及其AChE抑制活性進(jìn)行研究，以石杉?jí)A甲為對(duì)照品，對(duì)蘿卜葉中6個(gè)不同萃取組分的乙酰膽堿酯酶抑制活性進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，6個(gè)組分樣品均表現(xiàn)出一定的AChE抑制活性，其AChE抑制活性與其樣品濃度均表現(xiàn)出一定的濃度依賴關(guān)系。由6個(gè)不同萃取組分樣品的IC50值可知，其抑制AChE的活性從大到小為二氯甲烷組分、乙酸乙酯組分、石油醚組分、正丁醇組分、水相、蘿卜葉水提原液。由此可見，蘿卜葉具有較好的AChE抑制活性，同時(shí)為蘿卜葉中AChE抑制活性成分的跟蹤分離提供試驗(yàn)依據(jù)。

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