桑葉蛋白的功能和提取研究進(jìn)展

劉一靜 劉繼 張馳松 涂彩虹 鄭旗 樊雪飛 馮駿 張正周

摘要 桑葉中蛋白質(zhì)的含量可以占到干基重量的15%～30%，是蛋白含量較高的植物。對桑葉蛋白的功能特性及制備工藝等進(jìn)行了系統(tǒng)性的論述。通過分析蛋白質(zhì)的功能特性、提取方法及發(fā)展現(xiàn)狀，為深入研究桑葉蛋白以及開發(fā)桑葉蛋白新產(chǎn)品提供借鑒。

關(guān)鍵詞 桑葉蛋白；提??；功能性

中圖分類號 S789.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 0517-6611（2017）04-0089-03

Research Progress on the Function and Extraction of Mulberry Leaf Protein

LIU Yi-jing， LIU Ji， ZHANG Chi-song et al （Chengdu Academy of Agriculture and Forestry Sciences， Chengdu， Sichuan 611100）

Abstract The protein concentration of mulberry leaves ranges from 15% to 30%， which is quite high in plants. This paper described the functional characteristics and the extracting process of the mulberry protein. Through analyzing the functional characteristics， the extracting process and research status of mulberry protein， the study will provide reference for further research and development of mulberry protein products.

Key words Mulberry leaf protein； Extraction； Functionality

桑主要生長于熱帶和亞熱帶，在我國分布均勻，且種植面廣。桑樹在生態(tài)治理方面，具有防風(fēng)固土[1]、治理石漠化[2]、復(fù)墾礦區(qū)[3]、修復(fù)重金屬污染耕地[4]、修復(fù)鹽堿地[5]的作用。桑葉作為桑樹的主要產(chǎn)物，約占桑樹地上部分產(chǎn)量的64%[6]。除去每年向國外出口的桑葉，我國仍有大量的桑葉剩余，造成一定的浪費(fèi)。根據(jù)《本草綱目》《本草經(jīng)解》和《本草再新》的記載，桑葉不僅可作為家蠶飼料，也具備潤肺熱、鎮(zhèn)靜神經(jīng)、止咳的功效，已于1992年被衛(wèi)生部列為藥食兩用的品種[7]。

作為最早開發(fā)和研究桑葉保健食品的國家之一，目前日本保健品市場年需桑葉5萬t左右，其中大部分原料進(jìn)口自我國及東南亞國家。在歐美市場桑葉加工品的銷售額逐年增長，相關(guān)保健品逐漸暢銷的同時(shí)，國內(nèi)對桑葉的研究以及應(yīng)用還處于萌芽狀態(tài)。因此，深入研究桑葉功能成分及提取方法，對我國桑葉及相關(guān)產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義[8]。

目前我國桑葉的原料十分充足，成本低廉，應(yīng)用潛力巨大。若能在利用桑樹進(jìn)行環(huán)境治理的同時(shí)，充分開發(fā)桑葉的藥用、食用價(jià)值，將對桑資源廢物再利用和我國蛋白質(zhì)資源結(jié)構(gòu)的改善起到促進(jìn)作用。筆者就目前桑葉蛋白的研究開發(fā)現(xiàn)狀進(jìn)行綜述，希望能夠?yàn)樯Ｈ~蛋白的深度研究和高附加值產(chǎn)品的開發(fā)提供參考。

1 桑葉蛋白的營養(yǎng)價(jià)值及藥效特性

1.1 營養(yǎng)價(jià)值

桑葉中粗蛋白的含量為干基重量的25%左右[9]，比日常飲食中的奶粉、燕麥等的蛋白質(zhì)含量要高。通過酸沉法提取濃縮后所得桑葉粉的蛋白質(zhì)含量可達(dá)42%左右，與大豆中蛋白質(zhì)含量相當(dāng)[10]。桑葉蛋白中總氨基酸含量為361.1 mg/g，其中人體所必需的氨基酸較為齊全，占總氨基酸含量的34.7%，必需氨基酸/非必需氨基酸（E/N）值為0.531，接近聯(lián)合國糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織（FAO/WHO）標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的必需氨基酸含量（40%）和E/N值（0.6）。桑葉蛋白的氨基酸比值系數(shù)分（SRCAA）為69.71，高于黑麥草葉蛋白，與綠豆蛋白、紫花苜蓿葉蛋白相當(dāng)，與豬肉（74）營養(yǎng)價(jià)值接近，是營養(yǎng)價(jià)值較高的葉蛋白[7]。

1.2 藥效特性

喬璐[11]的研究發(fā)現(xiàn)，通過堿性蛋白酶水解得到的桑葉蛋白水解肽，在體外具有很好的還原性，100 μg/mL的桑葉水解肽同40 μg/mL的維生素C的還原力相當(dāng)，具有抗衰老的功效。桑葉中還含有豐富的γ-氨基丁酸（GABA），在干桑葉中的平均含量達(dá)到2.26 mg/g，高于大豆和茶葉中GABA的含量，占到氨基酸總量的1.12%[12]，而γ-氨基丁酸的前體物質(zhì)谷氨酸則占到氨基酸含量的13.70%。γ-氨基丁酸具有極強(qiáng)的生理活性，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的主要抑制性遞質(zhì)，具有延長記憶、改善視覺功能、鎮(zhèn)定神經(jīng)、抗焦慮、降血壓、改善肝功能的作用[13]。

2 桑葉蛋白的功能特性

桑葉蛋白的功能特性主要包括溶解性、持水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性和起泡性[9]。

2.1 pH對桑葉蛋白功能特性的影響

pH對桑葉蛋白的功能特性有明顯的影響。王芳等[14]的研究表明，桑葉蛋白在pH 5左右溶解度最小。這是由于此時(shí)的桑葉蛋白處于兼性離子狀態(tài)，凈電荷為零，蛋白質(zhì)與水之間的作用力最弱，而蛋白質(zhì)之間的作用力最強(qiáng)，最終導(dǎo)致桑葉蛋白的聚集和沉淀。同時(shí)桑葉蛋白的持水性[15]、乳化性及乳化穩(wěn)定性[10]、起泡性[14]也最小。而遠(yuǎn)離等電點(diǎn)時(shí)，蛋白溶解度升高，持水性、乳化性及穩(wěn)定性、起泡性均增大。

2.2 溫度對桑葉蛋白功能特性的影響

溫度對桑葉蛋白的影響更為復(fù)雜一些，當(dāng)溫度低于60 ℃時(shí)，桑葉蛋白的溶解度、持水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性隨溫度的升高而上升，這是因?yàn)橐欢ǚ秶鷥?nèi)的升溫可以促使蛋白質(zhì)分子立體結(jié)構(gòu)的伸展，從而增加蛋白質(zhì)分子與水分子之間的相互作用力，達(dá)到增加溶解度的效果。但高于60 ℃以后，高溫會(huì)使桑葉蛋白變性，發(fā)生聚集與沉淀，因此溶解度、持水性、乳化性及乳化穩(wěn)定性反而隨溫度的升高而降低[14]。4～80 ℃的溫度范圍內(nèi)，桑葉蛋白的起泡性隨著溫度的升高而增大，這是因?yàn)檫m當(dāng)?shù)臒崽幚碓黾恿说鞍踪|(zhì)的膨脹度。

2.3 離子強(qiáng)度對桑葉蛋白功能特性的影響

當(dāng)NaCl的濃度在0～1.0 mol/L的范圍內(nèi)時(shí)，桑葉蛋白的溶解度、持水性、起泡性均與NaCl的濃度成正比。這是由于當(dāng)鹽濃度升高時(shí)，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷隨之增加，蛋白質(zhì)溶解度增加。當(dāng)NaCl的濃度在0.6～0.8 mol/L時(shí)，其乳化性和乳化穩(wěn)定性最好。

2.4 蔗糖質(zhì)量濃度對桑葉蛋白功能特性的影響

在50 g/L的范圍內(nèi)，由于蔗糖的溶解降低了水分的活度，桑葉蛋白的溶解度和起泡性也隨之降低。但蔗糖能夠增加桑葉蛋白的乳化性和乳化穩(wěn)定性。

3 桑葉蛋白提取方式的研究

目前國內(nèi)外葉蛋白研究的重點(diǎn)是提取，以及如何使用最合適的方法和溶劑將蛋白質(zhì)從其他雜質(zhì)中分離出來。目前桑葉蛋白的提取方式主要有直接加熱法、酸堿沉淀法、有機(jī)溶劑法、鹽析法、乳酸發(fā)酵法、結(jié)晶和重結(jié)晶法以及泡沫分離技術(shù)，其中最常用的就是酸堿沉淀法。

在桑葉蛋白的實(shí)際應(yīng)用中，不僅要考慮到桑葉蛋白的質(zhì)量和提取效率，還要考慮成本和損耗等多方面因素。在具體生產(chǎn)過程中，應(yīng)根據(jù)生產(chǎn)目的的不同選擇不同的提取方法。若作為飼料，需大量生產(chǎn)，對產(chǎn)品純度要求不高，考慮成本，可采用加熱法、酸堿沉淀法?？紤]到節(jié)約能源、減少環(huán)境污染，則可使用乳酸發(fā)酵法。若是做生化用品，對蛋白質(zhì)質(zhì)量和純度要求較高，則可采用結(jié)晶和重結(jié)晶或泡沫分離技術(shù)。

3.1 直接加熱法

直接加熱法的優(yōu)點(diǎn)是操作簡單、廉價(jià)，但蛋白質(zhì)的產(chǎn)率和質(zhì)量不高。加熱可使溶液中的葉蛋白迅速絮凝，同時(shí)也可鈍化溶液中的酶，從而使得蛋白質(zhì)的酶解作用停止，減少蛋白質(zhì)的損失。影響葉蛋白提取加熱溫度和時(shí)間的因素有葉蛋白中必需氨基酸及非必需氨基酸含量、含氮物質(zhì)含量以及葉蛋白的消化速率。在一定條件下，溫度越高，葉蛋白得率越高，但當(dāng)溫度過高時(shí)，也會(huì)使得蛋白質(zhì)變性，從而導(dǎo)致葉蛋白的吸水性、乳化性和溶解性的降低。桑葉通過加熱沉淀法提取蛋白質(zhì)的最適溫度為75 ℃[16-17]。

3.2 酸堿沉淀法

酸堿沉淀法具有操作方便、價(jià)格低廉的優(yōu)勢，通常與加熱法結(jié)合成酸堿熱提法來提取蛋白質(zhì)。通常在對材料進(jìn)行浸提之后，用HCl來調(diào)整浸提液pH到4.0～4.5或者是用NH3·H2O或NaOH將浸提液的pH調(diào)整到8.0～8.5，使蛋白質(zhì)絮凝[11，17]。孫崇臻等[10]的研究表明，桑葉蛋白酸法沉淀的最優(yōu)pH為3.5，而酸熱沉淀法的最優(yōu)組合為pH 3.0，加熱溫度75 ℃，提取時(shí)間15 min；同時(shí)柳斌等[18]的研究也得出相似的結(jié)論。

與此同時(shí)，通過輔助方法來提高蛋白得率和質(zhì)量也是酸堿沉淀法提取蛋白質(zhì)的一個(gè)研究熱點(diǎn)。相較于新鮮桑葉，從干桑葉中提取蛋白質(zhì)更為困難，這是因?yàn)楫?dāng)細(xì)胞失水后，細(xì)胞壁縮小的同時(shí)，纖維化增強(qiáng)。屈紅森等[19]在采用酸沉淀法從干桑葉提取蛋白質(zhì)的同時(shí)，利用枯草芽孢桿菌促進(jìn)桑葉中蛋白質(zhì)的釋放和提高桑葉蛋白的品質(zhì)。朱天明等[20]的研究則通過纖維素酶來輔助桑葉蛋白的提取。

3.3 鹽析法

鹽析法簡單安全、價(jià)格低廉，但是通常制得的葉蛋白品綜合利用率和得率都不高[17]。鹽析法主要是利用浸提液中不同物質(zhì)在鹽溶液中的沉淀濃度的不同來進(jìn)行操作的。鹽析法需要在浸提液中加入大量的無機(jī)鹽，桑葉蛋白的溶液飽和濃度為65%[10]。王芳等[21]研究發(fā)現(xiàn)，以NaCl溶液為提取溶劑，再加上超聲波的輔助處理，大大提高了桑葉蛋白的得率。這是因?yàn)槌暡軌蛟诓黄茐奈镔|(zhì)結(jié)構(gòu)的條件下，有效地促進(jìn)細(xì)胞壁的破損。

3.4 乳酸發(fā)酵法

發(fā)酵方法不需要加入強(qiáng)酸強(qiáng)堿，也不用加熱，可節(jié)約能源，但是發(fā)酵時(shí)間較長，并且容易造成營養(yǎng)物質(zhì)的流失，如要進(jìn)行規(guī)?；纳a(chǎn)則需要配置發(fā)酵設(shè)備，生產(chǎn)成本過大[22]。乳酸發(fā)酵法是指利用乳酸菌發(fā)酵產(chǎn)生的乳酸使得葉蛋白絮凝沉淀的方法[23]。乳酸發(fā)酵的酸效應(yīng)使得葉蛋白在pH 3～4出現(xiàn)等電點(diǎn)凝聚。在瑞典、前蘇聯(lián)、西班牙等國家，通過這種方法來進(jìn)行葉蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)[24]。

3.5 結(jié)晶和重結(jié)晶法

結(jié)晶法是某種物質(zhì)通過降溫或蒸發(fā)的方法在浸提液中以晶體狀析出的過程。初次結(jié)晶所獲得的晶體多含雜質(zhì)，通過再次結(jié)晶這可以獲得較純的晶體，這一過程也被稱為重結(jié)晶。變性蛋白不能結(jié)晶，通過結(jié)晶或重結(jié)晶提取出的蛋白能保持天然的狀態(tài)。

3.6 泡沫分離技術(shù)

泡沫分離技術(shù)可用于分離低濃度的產(chǎn)品，且分辨率高，可獲得較高純度的富集液，具有運(yùn)行成本低、操作方便的特質(zhì)。泡沫分離技術(shù)是利用氣泡作為分離介質(zhì)來濃集表面活性物質(zhì)的分離技術(shù)，又被稱為泡沫吸附分離技術(shù)[25]，是根據(jù)被分離物質(zhì)的表面活性的不同，采用無機(jī)鹽和有機(jī)溶劑等分離介質(zhì)來進(jìn)行分離[26]。由于蛋白質(zhì)具有一定的表面活性，因此也可以利用泡沫分離技術(shù)來進(jìn)行蛋白的分離[27]。在劉海彬等[28]的研究中，先用氫氧化鈉溶液作為提取劑，制得桑葉蛋白提取液，在分離溫度25 ℃、稀釋40倍、pH 5.0、離子強(qiáng)度0.18 mol/kg的條件下，桑葉蛋白液中的蛋白回收率為92.50%；冷凍干燥后，蛋白質(zhì)的純度從蛋白提取液固形物中的34.38%提高到泡沫層固形物中的65.51%。

4 桑葉蛋白食品研究現(xiàn)狀及發(fā)展前景

綠葉是人類獲取蛋白質(zhì)最有效、最廉價(jià)的途徑之一。綠葉中的蛋白質(zhì)比植物莖桿部分要高50%～500%。我國植物綠葉資源豐富，目前全年的綠葉產(chǎn)量為20億～25億t，而利用率只有10%～30%。綠葉資源分布既遍布全國，又相對集中[29]。我國綠葉蛋白的研究工作起步比較晚，而國外已有80余年的將葉蛋白作為蛋白飼料的研究歷史。早在1972年法國就建立了葉蛋白的工業(yè)化生產(chǎn)廠[24]，而后，英國、丹麥、新西蘭等國也成立了規(guī)模較大的葉蛋白生產(chǎn)工廠。

目前我國關(guān)于桑葉蛋白的提取研究已經(jīng)比較成熟，其中多為利用酸堿沉淀法提取桑葉蛋白，桑葉蛋白的得率在9%～17%[11，19]，而其中蛋白質(zhì)含量在50%左右。雖然已有大量的關(guān)于桑葉蛋白提取的研究，但是這些研究還局限于實(shí)驗(yàn)室階段，并沒有一套適合工廠擴(kuò)大生產(chǎn)的提取工藝。

國外有研究表明，將桑葉蛋白和其他葉蛋白混合，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的飼料喂養(yǎng)懷孕的母羊，對孕期的母羊有積極良好的作用。在高蛋白飼料方面，預(yù)計(jì)到2020年我國每年蛋白質(zhì)飼料的需求量為7 200萬t，屆時(shí)將有3 600萬t需要從國外進(jìn)口[30]。開發(fā)高桑蛋白的飼料可以在有效利用桑葉資源的同時(shí)，緩解我國高蛋白飼料的短缺狀況[31-32]。

有研究表明，將苜蓿葉蛋白添加到面條或面包中，可以改善面條和面包的口感[33]。國內(nèi)外也有大量的試驗(yàn)證明，在日常飲食中添加葉蛋白能提高人的身體素質(zhì)[34-35]。而目前很少有桑葉蛋白在食品方面的研究及應(yīng)用。在未來的研究中，可以將桑葉蛋白在食品中的研究和應(yīng)用作為發(fā)展方向，在增加食品蛋白質(zhì)的同時(shí)，改善食品的加工特性。

除此之外，桑葉蛋白還可以應(yīng)用到化妝品、洗滌等日用品中。水解后得到的桑葉蛋白水解肽具有較強(qiáng)還原能力，是天然的抗氧化劑[11]。在桑葉蛋白提取過程中還可進(jìn)一步分離制得一系列的副產(chǎn)物，例如維生素E、葉綠素等。這些產(chǎn)物也可在食品及醫(yī)藥應(yīng)用等方面得到更多的應(yīng)用。由此可見，我國桑葉蛋白的開發(fā)前景非常廣闊。

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