宮頸病變組織中抗增殖蛋白表達與HR-HPV相關性研究

周瑩，馮博，王英紅

（石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆 石河子 832000）

宮頸病變組織中抗增殖蛋白表達與HR-HPV相關性研究

周瑩，馮博，王英紅

（石河子大學醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，新疆 石河子 832000）

為探討抗增殖蛋白（Prohibitin，PHB）在宮頸病變組織中的表達與高危型HPV（HR-HPV）的關系。方法：選取采集2014年1月-2015年12月在我院經(jīng)病理診斷為宮頸病變的132例的患者宮頸組織，分為慢性宮頸炎39例，宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ級23例，CINⅡ級-Ⅲ級28例，宮頸鱗癌42例。采用免疫組織化學檢測方法檢測組織中PHB的表達，雜交捕獲二代（HC2）法檢測患者宮頸分泌物中HR-HPV-DNA的載量。結果顯示：PHB在不同宮頸病變組織中有不同程度的陽性表達，PHB的強陽性率隨病變程度的增加逐漸升高，慢性宮頸炎組、CINⅠ級組、CINⅡ-Ⅲ級組、宮頸鱗癌組中PHB的強陽性率分別為35.9%、47.8%、57.1%、71.4%，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。PHB陽性表達、HR-HPV感染載量均與宮頸病變程度呈正相關，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.01）。PHB與HR-HPV之間無相關關系，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。PHB在宮頸鱗癌組的表達與年齡、分化程度、臨床分期不相關，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。由此可知，PHB的過表達及HR-HPV的感染可能從不同途徑促進了宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，PHB可能成為宮頸癌潛在的診斷標記物及治療靶點。

宮頸鱗癌；宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變；抗增殖蛋白(PHB)；人乳頭瘤病毒（HPV）

宮頸癌(cervical carcinoma)是全球女性最常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅廣大女性健康，其中絕大多數(shù)新發(fā)病例出現(xiàn)在發(fā)展中國家。國內(nèi)外研究表明高危型人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染是宮頸癌及宮頸癌前病變的必要條件。

抗增殖蛋白（prohibitin,PHB）是一種高度保守的蛋白，廣泛分布于多種真核生物細胞中，參與細胞的能量代謝、增殖、凋亡和衰老等過程[1-2]。研究顯示，PHB在多種腫瘤中異常表達，調(diào)控細胞增殖、遷移、存活和凋亡[3-6]。常燕及TSAI等[7-8]研究發(fā)現(xiàn)PHB在宮頸癌中表達升高，且與宮頸病變程度呈正相關，但無研究證明PHB與高危型HPV感染有無關系。本研究旨在討論PHB在宮頸病變中的表達及其與高危型HPV感染的相關關系。

1 材料與方法

1.1 病例資料

宮頸組織標本取自2014年1月-2015年12月在新疆石河子市石河子大學第一附屬醫(yī)院就診的患者，經(jīng)陰道鏡下宮頸組織活檢或全子宮切除術獲取，病理診斷為宮頸病變的宮頸組織標本，共132例，患者年齡18-84歲，中位年齡47歲。其中慢性宮頸炎39例，宮頸上皮內(nèi)瘤變（CIN）Ⅰ 級23例，CINⅡ級-Ⅲ級28例，宮頸鱗癌42例。其中宮頸鱗癌組又根據(jù)分化程度、臨床分期的不同進行進一步分組，按照分化程度：高分化6例，中分化31例，低分化5例；按 FIGO臨床分期：Ⅰ期 6例，Ⅱ-Ⅲ期 36例。所有患者在標本采集前均未進行過放療或化療，標本采集前3天內(nèi)無性生活、陰道沖洗及用藥。宮頸組織標本采集的同時或術前采集HPV。所有標本均由兩位高年資病理醫(yī)師診斷確診。

1.2 研究方法

1.2.1 PHB檢測

采用Envision免疫組化法檢測宮頸組織中PHB蛋白的表達，小鼠抗人Prohibitin單克隆抗體（ab1836）購自 Abcam公司，免疫組化 Envision染色試劑盒，購自北京中杉金橋生物科技有限公司。實驗中陰性對照采用PBS代替一抗，陽性對照采用說明書上提供的陽性組織切片。石蠟切片脫蠟水化后，高壓修復抗原8 min后使用3%H2O2甲醇溶液滅活內(nèi)源性過氧化物酶10 min，滴加一抗（1：200）4℃過夜，滴加生物素標記的二抗37℃孵育30分鐘，DAB顯色，蘇木素復染，脫水透明，中性樹膠封片。

1.2.2 HPV采集與檢測

使用第二代雜交捕獲法專用HPV采樣刷采集患者宮頸分泌物及脫落上皮，置于含有保存液的專用小瓶中，標記研究對象編碼，4℃冰箱保存。采用美國Digene公司第二代雜交捕獲技術（Hybird Capture2技術,HC2）進行HR-HPV-DNA的檢測，該檢測方法主要利用基因雜交、信號擴大的原理，檢測試劑盒（5197-1330）購自上海萊特公司，主要采用96孔板法，同時檢測13種的HR-HPV-DNA的載量（包括 16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68型）。具體檢測方法為：（1）將樣本DNA雙鏈釋放并分解為可以雜交的核苷酸單鏈；（2）核苷酸DNA單鏈與RNA探針雜交；（3）特異抗體捕獲DNA-RNA雜交體并固定；（4）聯(lián)有堿性磷酸酶的第2抗體與DNA-RNA雜交體結合；（5）反復沖洗多次至干燥；（6）信號放大，由DML2000微量反應板測量光的強弱，確定DNA-RNA雜交體的含量，即HR-HPV載量。

1.3 結果判定

1.3.1 免疫組化結果判定

顯微鏡下觀察細胞漿中出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細胞。每張切片隨機觀察5個高倍視野，每個視野計數(shù)100個細胞，根據(jù)著色強度及陽性細胞百分比進行綜合評分[3]：陽性細胞著色強度（I）分為四個等級：無染色（0），黃色（1），棕黃色（2）和棕褐色（3）；陽性細胞的百分比（II）分為五個等級：≤5%（0），6%–25%（1），26%-50%（2），51%–75%（3）和＞75%（4）。根據(jù)（I）×（II）的結果，判定 PHB 表達為陰性（0），弱陽性（1-3），中等陽性（4-7）和強陽性（8-12），分別記為（-）、（+）、（++）、（+++）。

1.3.2 HC2法檢測HPV結果判定

儀器判讀的結果≥1.00時，HR-HPV的檢測結果為陽性；＜1.00時為陰性。其中陽性的結果可根據(jù)病毒載量的高低分為三組：低載量組（1.00,100.000）、中載量組（100.00,1000.00）、高載量組（>1000.00），按其感染程度可分別記為（+）、（++）、（+++）。

1.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析。結果采用Kruskal-Walli H檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。相關性研究采用Spearman進行相關分析。

2 結果

2.1 PHB在宮頸病變組織中的表達

免疫組化顯示PHB在慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ-Ⅲ級、宮頸鱗癌中均有不同程度的陽性表達，其陽性表達主要位于細胞質，呈黃色顆粒（圖1）。慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ-Ⅲ級、宮頸鱗癌組中PHB表達強陽性率（+++）分別為35.9%；47.8%、57.1%、71.4%，PHB的強陽性率隨病變程度的增加逐漸升高，通過Kruskal-Walli H檢驗，PHB的表達在宮頸病變組織中的表達有統(tǒng)計學意義（Hc=11.552，P＜0.01），根據(jù)Spearman相關分析顯示，PHB表達的強度與宮頸病變的程度呈正相關（相關系數(shù)rs=0.291，P＜0.01），宮頸病變程度越高，PHB的表達越強，范圍越廣（表 1）。

圖1 PHB在宮頸病變組織中的不同表達程度Fig.1 The expression level of PHB in cervical lesions

圖2 PHB在不同宮頸病變組織中的表達Fig.2 The expression of PHB in different cervical lesions

表1 PHB在宮頸病變組織中的表達Tab.1 the expression of PHB in cervical lesions

2.2 高危型HPV在宮頸病變組織中的表達

不同宮頸病變程度的宮頸組織感染HR-HPV的量不同，宮頸病變程度越高，HPV-DNA載量越高，通過Kruskal-Walli H檢驗，差異有統(tǒng)計學意義（Hc=31.746，P＜0.01），根據(jù)不同宮頸病變組的秩均值及Spearman相關分析顯示，HPV-DNA感染程度與宮頸病變程度成正相關（rs=0.445,P＜0.01），宮頸病變程度越高，HR-HPV感染越多，HPV-DNA載量越高（表2）。

表2 HR-HPV在宮頸病變組織中的表達Tab.2 The expression of HR-HPV in cervical lesions

2.3 PHB與高危型HPV的關系

通過Spearman相關分析，PHB在宮頸組織中的表達與HR-HPV感染之間無明顯相關關系（rs=0.117，P=0.181＞0.05）（表 3）。

表3 PHB的表達與高危型HPV感染的相關關系Tab.3 Correlation between PHB expression and HR-HPV infection

2.4 宮頸鱗癌組織中PHB表達水平及與臨床病理特征的關系

42例宮頸鱗癌組織中PHB無陰性表達，陽性的表達水平與患者年齡、分化程度、FIGO分期均無相關關系，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表4）。

表4 宮頸鱗癌中PHB的表達與臨床病理特征的相關性分析Tab.4 Correlation analysis of the expression of PHB and the clinical pathological characteristics in cervical squamous cell carcinoma

3 討論

據(jù)國際癌癥研究中心（International Agency for Research on Cancer,IARC）研究數(shù)據(jù)顯示[9]，目前宮頸癌在女性惡性腫瘤中發(fā)病率全球排名第四，2012年全世界宮頸癌新發(fā)病例52.8萬，死亡病例26.6萬，其中我國新發(fā)病例6.2萬，死亡病例3萬。盡管近幾年我國已經(jīng)開展了大規(guī)模的宮頸癌篩查，宮頸癌的發(fā)病率和死亡率仍較高，且年齡水平日趨降低。因此，尋找敏感度及特異度強的分子標記物，盡早識別具有高風險進展的癌前病變，優(yōu)化宮頸癌篩查及治療尤為重要。

PHB是廣泛存在于真核細胞生物中的一種高保守蛋白，分布于細胞線粒體內(nèi)膜、細胞核、細胞膜和基質中，主要定位于線粒體內(nèi)膜上，PHB家族包含PHB1和PHB2兩個成員，因其具有抗細胞增殖作用而得名[10]。PHB分布廣泛、結構高度保守、其生物學功能多樣[1]，PHB主要以分子伴侶的形式來維持線粒體結構及功能，通過參與線粒體能量代謝進而參與調(diào)控細胞增殖、分化、凋亡、信號轉導等過程[11]。多項研究顯示，PHB在多種不同的腫瘤組織中異常表達[3-4,6,8,12-14]，推斷其在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，可能成為腫瘤組織潛在的生物標志物及治療靶點。

本研究顯示，PHB在不同宮頸病變程度中呈現(xiàn)不同程度的陽性表達，PHB在慢性宮頸炎組織、CINⅠ級組、CINⅡ-Ⅲ級組、宮頸鱗癌組中強陽性表達率隨宮頸病變程度增加逐漸升高，分別為35.9%、47.8%、57.1%、71.4%，宮頸病變程度越高，PHB的強陽性表達率越高。此結果與常燕[7]研究成果基本相符，PHB在不同分組中呈現(xiàn)不同程度的陽性表達提示PHB參與宮頸上皮細胞正常能量代謝、信號轉導、細胞衰老、凋亡等過程，但隨著宮頸組織病變的進展，PHB表達程度逐漸升高，提示PHB的過表達可能是慢性宮頸炎向宮頸癌逐漸進展的誘因之一，PHB的過表達可能與腫瘤細胞中無氧糖酵解的水平增加促進PHB啟動子中的調(diào)控因子與原癌基因的腫瘤蛋白相結合，進而上調(diào)原癌基因的表達，誘導PHB進一步增多[15]。PHB的表達可做為預示宮頸病變發(fā)生不良結局可能性的指標之一。

PHB的表達與宮頸鱗癌臨床病理特征分析的研究中，PHB的表達與年齡、分化程度、FIGO分期無關，說明PHB在判斷宮頸鱗癌分期及分化程度方面的作用不大。PHB與宮頸鱗癌淋巴轉移、腫瘤大小等方面的有無作用尚需進一步研究。

國內(nèi)外大量研究均顯示HR-HPV持續(xù)性感染是導致宮頸癌前病變及宮頸癌最主要的因素[16]，且HPV病毒載量與宮頸病變程度密切相關[17]。本研究結果顯示,HR-HPV感染的陽性率及病毒載量與宮頸病變程度有關，且呈正相關，宮頸病變程度越高，HPV感染陽性率越高，病毒裁量越高。此結果與國內(nèi)外研究結論相符。HR-HPV持續(xù)高載量感染是導致宮頸惡性病變的重要因素，治療HR-HPV感染仍是預防宮頸病變向宮頸惡性腫瘤進展的主要方向。

PHB的過表達與HR-HPV均與宮頸病變程度呈正相關，但PHB的表達程度與HR-HPV感染之間的相關性分析顯示不相關，由此可認為PHB的過表達以及HR-HPV感染均可促進宮頸癌前病變及宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，但具體導致宮頸病變進一步向不良結局進展的途徑可能不同，相關機制仍需進一步研究證明。

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Expressions of prohibitin in cervical lesions and the relationship with HR-HPV

Zhou Ying,Feng Bo,Wang Yinghong
(Department of Obstetrics and Gynecology,the First Affiliated Hospital of Medical College,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832008,China)

To explore the expressions of PHB in cervical lesions and their relationships with HR-HPV infection,a total of 132 patients diagnosed as cervical lesions by pathological examination in the hospital from January 2014 to December 2015 were selected and divided into chronic cervicitis group(39 patients)，CIN Ⅰ group(23 patients)，CIN Ⅱ-CIN Ⅲ group(28 patients),cervical squamous cell carcinoma group(42 patients).Immunohistochemical method was used to detect the expressions of PHB.HC2 technique was used to detect HR-HPV DNA in cervical secretions.The resalts showed the degree of positive expression of PHB in different cervical lesions group were different.The high-positive expression rates of PHB in chronic cervicitis group，CINⅠ group，CIN Ⅱ-CIN Ⅲ group and cervical squamous cell carcinoma group were 35.9%，47.8%，57.1%，71.4%,respectively.There were statistically significant differences (P＜0.01).The positive expression of PHB and HR-HPV infection were positively correlated with the degree of cervical lesions(P＜0.01) ，but there was no correlation between PHB and HR-HPV(P＞0.05).The expression of PHB in cervical squamous cell carcinoma was not correlated with age，degree of differentiation，F(xiàn)IGO staging.There was no statistically significant difference (P＞0.05).The conclusion is that overexpression of PHB and HR-HPV infection maybe promote the development of cervical cancer in different ways.PHB could become a potential marker for diagnosis and treatment of cervical cancer.

cervical carcinoma;Cervical intraepithelial neoplasia;prohibitin,PHB;human papillomavirus，HPV

R711.74

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.009

1007-7383(2017)02-0182-05

2016-12-25

科技部科技惠民計劃（2013GS650104）

周瑩（1990-），女，碩士研究生，專業(yè)方向為婦科腫瘤學。

*通信作者：王英紅（1960-），女，教授、主任醫(yī)師，從事婦科腫瘤與內(nèi)鏡研究，e-mail：wyhxj920@sina.com。