HPLC法測定丙戊酸鈉血藥濃度柱前衍生化條件的優(yōu)化

胡雪飛，張永軍*，魏麗紅,陳文

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832002）

HPLC法測定丙戊酸鈉血藥濃度柱前衍生化條件的優(yōu)化

胡雪飛1，張永軍2*，魏麗紅2,陳文1

（1石河子大學(xué)藥學(xué)院，新疆 石河子 832002；2石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院，新疆 石河子 832002）

為了研究HPLC法測定丙戊酸鈉血藥濃度衍生時的最佳衍生條件，探討不同衍生條件對血藥濃度的影響，本實驗采用L9（34）正交實驗設(shè)計，以衍生試劑濃度、催化劑濃度、衍生溫度和衍生時間為考察因素，確定最佳衍生條件。結(jié)果顯示，A2B2C3D1為最佳衍生條件，即衍生試劑為2.0 mg/mL，催化劑濃度為20%，衍生溫度為60℃，衍生時間5 min為最佳衍生條件。不同的衍生條件對測定結(jié)果有顯著影響（P＜0.05），且衍生反應(yīng)的主次因素為衍生試劑濃度>衍生溫度>催化劑濃度>衍生時間。由此可知，優(yōu)化后的衍生條件方法回收率高，節(jié)約時間和成本，簡便可行。

衍生條件；丙戊酸鈉；血藥濃度；正交實驗；優(yōu)化

丙戊酸（valproic acid，VPA）鈉是臨床上常用的一線抗癲癇藥，是癲癇綜合征、大發(fā)作、失神性發(fā)作、肌陣攣性發(fā)作的首選。但它在臨床應(yīng)用中，治療范圍窗窄，個體差異較大，血藥濃度易受藥物間相互作用的影響[1]，故丙戊酸鈉需要進(jìn)行血藥濃度監(jiān)測。高效液相色譜（HPLC）法是臨床測定丙戊酸鈉血漿藥物濃度常用的方法之一[2]。由于丙戊酸鈉分子結(jié)構(gòu)中沒有能夠產(chǎn)生紫外吸收的結(jié)構(gòu)，需對樣品進(jìn)行衍生化前處理[3]才能用高效液相色譜法進(jìn)行測定。血漿生物樣品的柱前衍生，直接影響血藥濃度監(jiān)測的結(jié)果，進(jìn)而影響臨床給藥方案的調(diào)整 。目前，文獻(xiàn)報道柱前衍生高效液相色譜（HPLC）法測定丙戊酸鈉血藥濃度較多，但僅僅只是對方法學(xué)進(jìn)行了考察，并未見衍生條件優(yōu)化的相關(guān)報道。因此，本實驗在單因素分析的基礎(chǔ)上采用正交設(shè)計法考察不同條件組合對HPLC測定丙戊酸鈉血藥濃度的影響，并確定出最佳衍生條件。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器

Agilent-1100高效液相色譜儀，包括惠普化學(xué)工作站，G1322A在線脫氣機(jī)，G1311A四元泵，G1314A紫外檢測器，色譜柱：Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，氮吹儀(青島聚創(chuàng)環(huán)保設(shè)備有限公司，型號WD-12型)，高速臺式離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠，型號TGL-20B)，漩渦混合器 (上海琪特分析儀器有限公司，型號QT-1)，標(biāo)準(zhǔn)試劑超純水機(jī)（青島富勒姆科技有限公司，F(xiàn)BZ1002-UP-P）

1.1.2 試劑與藥品

丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院；批號100963-201302；含量99.0% 以上)；2-溴-對硝基苯乙酮（英國SIGMA-ALDRICH，批號#BCBB1161V，含量95%）、環(huán)己烷羧酸（英國SIGMA-ALDRICH，批號#MKBD6586V，含量 98.0%），色譜甲醇（Fisher Scientific，LOT 676535）、色譜乙腈（Fisher Scientific，LOT 082333），硫酸（四川西隴化工有限公司，含量95.0%~98.0%）、正己烷(天津市富宇精細(xì)化工有限公司，含量95.0%)、乙腈（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，含量99.9%)，三乙胺（天津市富宇精細(xì)化工有限公司，含量 99.0%)）。

1.2 色譜條件

色譜柱：Symmetry C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流動相（v:v）：乙腈 - 水（75:25），流速：1.0 mL/min，檢測波長265 nm，柱溫30℃，保留時間12 min，進(jìn)樣量 20 μL，內(nèi)標(biāo)：0.4 mg/mL環(huán)己烷羧酸。

1.3 溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)品溶液：精密稱定12 mg丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品粉末，置10 mL棕色容量瓶中，用超純水定容，得到12.0 mg/mL的丙戊酸標(biāo)準(zhǔn)液。置4℃冰箱保存，臨用時用超純水稀釋成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液。

內(nèi)標(biāo)溶液：精密量取環(huán)己烷羧酸10.0 μL，置25 mL容量瓶中，用0.5 mol/L氨水定容，得到0.4 mg/mL的環(huán)己烷羧酸內(nèi)標(biāo)液，置4℃冰箱保存。

衍生試劑溶液：精密稱定2-溴4-對硝基苯乙酮粉末45.0 mg，置25 mL棕色容量瓶中，用乙腈定容，得到1.80 mg/mL的衍生試劑，4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品處理方法

精密量取血漿200 μL放入4 mL離心管中，加 100 μL的環(huán)己烷羧酸和 100 μL H2SO4（3 mol/L），渦旋1 min，充分混勻后，再加入 2 mL正己烷提取，渦旋1.5 min混勻，以14000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液1 mL，加入200 μL衍生試劑（2-溴-4-基苯乙酮）和20 μL催化劑（純?nèi)野罚?，?0℃水浴中衍生 10 min，N2吹干，干燥后的固體用200 μL乙腈溶解，離心后，取上清液進(jìn)樣（20 μL）。

1.5 方法學(xué)考察

1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

用1.2 mg/mL丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液稀釋成濃度為200、150、100、75、50、25、10 μg/mL系列濃度的丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品。按“1.4樣品處理方法”制備，以丙戊酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，丙戊酸鈉衍生物峰面積與內(nèi)標(biāo)衍生物峰面積的比值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.5.2 單因素衍生條件的考察

（1）衍生試劑濃度的考察

精密稱取150.0 mg 2-溴-4-硝基苯乙酮于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，即得15.0 mg/mL的衍生試劑貯備液。量取適量的貯備液，配制成濃度為 0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/mL的衍生試劑溶液。配置75 μg/mL的丙戊酸鈉對照品血漿，按“1.4樣品處理方法”制備(不加內(nèi)標(biāo))，分別測定上述不同濃度衍生試劑衍生時丙戊酸衍生物的峰面積，以最大的峰面積為參比，計算丙戊酸衍生物的產(chǎn)率。

（2）三乙胺濃度的考察

精密移取適量的純?nèi)野?，用乙腈稀釋，分別配制成體積比為0.2%、20%、40%、60%、80%的三乙胺溶液。用75 μg/mL的丙戊酸鈉對照品血漿，按“1.4樣品處理方法”制備，分別測定上述不同濃度三乙胺作催化劑時，丙戊酸衍生物的峰面積，計算丙戊酸衍生物的產(chǎn)率。

（3）反應(yīng)時間與溫度的考察精密量取75 μg/mL的丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品血漿200 μL，按“1.4樣品處理方法”制備，分別測定衍生溫度在50-65℃，衍生時間5、10、15 min時丙戊酸衍生物的峰面積。計算丙戊酸衍生物的產(chǎn)率。

1.5.3 正交實驗優(yōu)化衍生條件

選擇衍生溫度、衍生時間、衍生試劑濃度、三乙胺濃度4個主要影響因素作為考察因素。根據(jù)單因素考察，每個因素選取3個水平（因素水平表見表1），采用L9（34）正交表進(jìn)行實驗。精密量取濃度分別為100 μg/mL丙戊酸鈉血漿標(biāo)準(zhǔn)品200 μL，根據(jù)L9（34）正交表所列的9個隨機(jī)組合，按“1.4”樣品處理辦法進(jìn)行實驗，所得丙戊酸衍生物面積與內(nèi)標(biāo)面積的比值代入標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算實際測量濃度。每個實驗重復(fù)3次，取平均值。以丙戊酸鈉血藥濃度方法回收率為指標(biāo)，判斷不同衍生方案的最佳組合。方法回收率=測定值/標(biāo)準(zhǔn)值。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

1.5.4 最佳衍生條件的驗證

精密量取濃度100 μg/mL血漿丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)品200 μL，按最佳組合方案，測定丙戊酸鈉的實際濃度，計算方法回收率。

1.5.5 提取回收率與精密度實驗

精密量取線性范圍內(nèi)低、中、高三個濃度（10、75、200 μg/mL）的丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液 200 μL，按“1.4樣品處理方法”制備，與未加空白血漿的同法衍生后的丙戊酸-內(nèi)標(biāo)之比計算提取回收率。1 d內(nèi)重復(fù)測定5次，為日內(nèi)變異；連續(xù)5 d內(nèi)，每天測定1次，為日間變異。

1.5.6 穩(wěn)定性實驗

精密量取線性范圍內(nèi)低、中、高三個濃度的（10、75、200 μg/mL）的丙戊酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液 200 μL，按“1.4樣品處理方法”制備，于 0 h，室溫 24 h，冰箱（4℃）保存48 h，72 h的樣品，分別測定丙戊酸鈉的藥物濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 專屬性

在“1.2”項色譜條件下，以空白血漿、空白血漿+丙戊酸鈉對照品+內(nèi)標(biāo)、癲癇患者服藥后的血漿+內(nèi)標(biāo)，按“1.4樣品方法制備處理后測定，得出的色譜圖如圖1所示，丙戊酸鈉衍生物和環(huán)己烷羧酸衍生物的保留時間分別是6.5 min和9.6 min左右，且分離良好，峰形瘦高，血漿中內(nèi)源性雜質(zhì)雜質(zhì)及環(huán)己烷羧酸不干擾丙戊酸鈉的測定。

圖1 高效液相色譜圖Fig.1 High performance liquid chromatography

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線及定量下限

根據(jù)“1.5”標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品處理辦法制備樣品，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.0047X+0.0015(R2=0.9995，Y表示丙戊酸鈉與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值，X表示丙戊酸鈉的濃度)。結(jié)果表明，丙戊酸鈉血漿藥物濃度在10-200 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，其最低定量濃度為 8.62 μg/mL（S:N=10）。

2.3單因素衍生條件的考察

2.3.1 衍生試劑濃度的考察

對衍生試劑濃度的考察結(jié)果如圖2所示。結(jié)果表明，隨著衍生試劑濃度的增大，丙戊酸衍生物產(chǎn)率也逐漸增加。當(dāng)衍生濃度≥2.0 mg/mL時，衍生產(chǎn)率趨于平穩(wěn)，但基線存在漂移現(xiàn)象。由此可知，衍生衍生濃度≥2.0 mg/mL時，衍生試劑就會變成雜質(zhì)，干擾藥物濃度的測定。

圖2 不同濃度2-澳-4-硝基苯乙酮對產(chǎn)率的影響Fig.2 Effect of different concentrations of 2-bromine-4-ouetopnenone on the derivatization reaction

2.3.2 催化劑濃度的考察

催化劑濃度的考察結(jié)果如圖3所示。結(jié)果表明，隨著三乙胺濃度百分比的增大，丙戊酸鈉衍生產(chǎn)率先增加后減小。在濃度百分比為20%時，丙戊酸鈉衍生產(chǎn)率達(dá)到最大。

圖3 不同濃度三乙胺對衍生化反應(yīng)的影響Fig.3 Effect of different concentrations of triethylamine on the derivatization reaction

2.3.3 反應(yīng)時間與溫度的考察

衍生溫度與時間的考察結(jié)果如圖4所示。由圖4可知，衍生時間10 min優(yōu)于15 min，而5 min和10 min的衍生產(chǎn)率接近，且丙戊酸鈉衍生產(chǎn)率一直在95%以上。表4說明衍生時間對丙戊酸鈉衍生產(chǎn)率的影響不是特別大。由于60℃接近提取溶劑正己烷的沸點，有利于有機(jī)溶劑的揮干，節(jié)約N2揮干的時間，因此，60℃可能是最佳衍生溫度。

圖4 不同溫度、時間對衍生反應(yīng)的影響Fig.4 Effect of different temperatμre and time on the derivative reaction

2.4 正交實驗優(yōu)化衍生條件

正交實驗結(jié)果表2所示。根據(jù)正交實驗可以直觀地看到，不同的衍生條件，其測定值與標(biāo)準(zhǔn)值的偏差很大。通過對9組不同衍生條件所得出的測定值進(jìn)行單樣本 t檢驗，得出 t=38.035；P<0.001，說明不同的衍生條件對HPLC法測定丙戊酸鈉血藥濃度有顯著的影響。丙戊酸鈉的有效血藥濃度范圍為50-100 μg/mL，治療窗比較窄，由表2可知，不同的衍生條件下，血藥濃度測定值的極差是24.84，偏度為 0.475，95%CI（107.70-121.60）。這種在測定時出現(xiàn)的誤差，有可能會導(dǎo)致在調(diào)整劑量時，劑量過小而癲癇不能控制，也有可能調(diào)整劑量過大，而導(dǎo)致不良反應(yīng)的發(fā)生。因此，血藥濃度測定值的準(zhǔn)確性對調(diào)整給藥方案有重大意義。

表2 正交實驗結(jié)果Tab.2 Results of orthogonal design

影響因素方差分析如表3所示。通過方差分析表明，4個因素之間的主次關(guān)系為：衍生試劑濃度(C)>衍生溫度(A)>催化劑濃度(D)>衍生時間(B)。結(jié)合正交實驗結(jié)果和方差分析表，我們可以看出，第五組為最佳組合，即衍生試劑濃度為2.0 mg/mL，催化劑濃度為20%，衍生溫度為60℃，衍生時間為5 min時，方法回收率最高，衍生效果最好。

表3 影響因素方差分析Tab.3 Variance Analysis of main factors

2.5 最佳衍生組合的驗證

最佳衍生組合驗證的結(jié)果見表4。在最佳衍生優(yōu)化組合下，即衍生條件為：衍生試劑濃度為2.0 mg/mL，催化劑濃度為20%，衍生溫度為60℃，衍生時間為5 min，按照“1.4樣品處理方法”制備，結(jié)果顯示，所得實際測定值與真實值（100 μg/mL）偏差較小，方法回收率較高。

表4 最佳衍生組合的驗證Tab.4 validation of the optimal combination of derivatives

2.6 優(yōu)化后標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

按“1.5”的標(biāo)準(zhǔn)曲線處理方法，以2.0 mg/mL的2-溴-對硝基苯乙酮為衍生試劑，20%的三乙胺為催化劑，衍生溫度為60℃，衍生時間為5 min，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。以丙戊酸鈉濃度為橫坐標(biāo)，丙戊酸鈉與內(nèi)標(biāo)峰面積的比值為縱坐標(biāo)，得出標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.00469X+0.00604(R2=0.9995)。結(jié)果表明，丙戊酸血藥濃度在10~200 μg/mL范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系（RSD≤5%，n＝5）。

2.7 提取回收率與精密度

提取回收率和精密度實驗結(jié)果見表5。結(jié)果表明，所建立的HPLC法提取回收率88.48%-96.32%之間，方法回收率在95.00-99.73%之間，日內(nèi)、日間變異均RSD<5%，符合國家生物樣品檢測標(biāo)準(zhǔn)。

表5 回收率和精密度結(jié)果Tab.5 Results of recovery and precision n＝5

2.8 穩(wěn)定性

樣品的穩(wěn)定性實驗如表6所示。由表6可知，日間、日內(nèi)RSD<5%，說明丙戊酸鈉衍生物樣品穩(wěn)定。

表6 丙戊酸鈉的穩(wěn)定性Tab.6 the stability of sodium valproate n=3

2.9 丙戊酸鈉血藥濃度監(jiān)測臨床應(yīng)用

56例服用丙戊酸鈉緩釋片的成年癲癇患者，年齡在18-72歲，根據(jù)患者病情的輕重程度，服藥劑量500-2000 mg/d不等，監(jiān)測患者的穩(wěn)態(tài)血藥濃度濃度（谷濃度）。結(jié)果顯示，在治療窗（50-100 μg/mL）之內(nèi)34例，占總?cè)藬?shù)的60.71%；低于治療窗＜50 μg/mL的患者 12例，占總?cè)藬?shù)的21.43%；高于治療窗＞100 μg/mL的患者10例，占總?cè)藬?shù)的17.86%。由此可以看出，血藥濃度在有效血藥濃度范圍的癲癇患者接近40%左右。為了減少不良反應(yīng)的發(fā)生，提高療效，臨床藥師及醫(yī)生應(yīng)加大血藥濃度監(jiān)測宣傳力度。并且醫(yī)生應(yīng)根據(jù)患者具體的病理生理情況、癲癇控制情況、不良反應(yīng)情況及丙戊酸鈉血藥濃度監(jiān)測結(jié)果，進(jìn)行個體化給藥。

3 討論

丙戊酸鈉作為臨床上最常用的廣譜抗癲癇藥之一[7]，它的治療藥物監(jiān)測結(jié)果的準(zhǔn)確準(zhǔn)確性直接影響個體化給藥的治療方案。臨床上丙戊酸鈉的有效血藥濃度范圍是50-100 μg/mL，有時也可放寬至40-100 μg/mL。大量血藥濃度監(jiān)測結(jié)果表明，當(dāng)濃度<40 μg/mL時，癲癇發(fā)作可能控制未得到很好的控制；當(dāng)濃度>120μg/mL時，出現(xiàn)不良反應(yīng)的幾率會大大增加。因此，血藥濃度監(jiān)測結(jié)果的準(zhǔn)確性將直接影響臨床給藥方案的調(diào)整。尤其是當(dāng)測定結(jié)果在有效血藥濃度邊界范圍，同時又是特殊代謝的患者（如快/慢代謝型患者）或者合并用藥患者 ，根據(jù)血藥濃度減量/加量時，將直接導(dǎo)致患者癲癇的再次發(fā)作或者出現(xiàn)不良反應(yīng)。因此，臨床測定結(jié)果的準(zhǔn)確性十分重要[9]。用HPLC法測定丙戊酸鈉血藥濃度時，測定結(jié)果的不同主要是由柱前衍生反應(yīng)情況的不同造成的。而各文獻(xiàn)報道用HPLC法測定丙戊酸藥物濃度的衍生條件很不一致[10-13]，并且不同衍生條件對測定結(jié)果的影響未見報道。因此，實驗先以丙戊酸衍生產(chǎn)率為指標(biāo)，單因素考察衍生試劑濃度、催化劑濃度、衍生溫度和時間的范圍，再用正交實驗優(yōu)化衍生條件。結(jié)果表明衍生試劑為2.0 mg/mL，催化劑體積比為20%，丙戊酸衍生物產(chǎn)率最大。實驗證明，不同衍生條件對血藥濃度測定結(jié)果具有顯著影響。衍生條件為衍生試劑濃度2.0 mg/mL，催化劑濃度為20%，衍生溫度為10℃，衍生時間為5 min時，測定值最接近真實值，血藥濃度方法回收率最好。影響衍生反應(yīng)的主次因素為衍生試劑濃度>衍生溫度>催化劑濃度>衍生時間。

因此，用柱前衍生HPLC法測定丙戊酸血藥濃度時，應(yīng)當(dāng)注意衍生條件的變化。如果衍生試劑濃度、催化劑濃度、衍生溫度或時間等任一因素改變時，我們應(yīng)該重新建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。當(dāng)然，影響丙戊酸鈉血藥濃度監(jiān)測結(jié)果還包括儀器因素（如色譜柱選擇、柱溫、流動相等）及前處理（如提取回收率、穩(wěn)定性、蛋白去除效率等）等很多方面。由實驗方法學(xué)考察可知，在所選色譜條件下，最佳衍生條件為衍生試劑濃度2.0 mg/mL，催化劑濃度為20%，衍生溫度為10℃，衍生時間為5 min時，所建立的方法穩(wěn)定、可靠，適用于常規(guī)丙戊酸鈉血藥濃度監(jiān)測。準(zhǔn)確的測定結(jié)果能為判斷分析療效及制定個體化給藥方案提供可靠依據(jù)。在日常血藥濃度監(jiān)測過程中應(yīng)注意確保丙戊酸鈉治療藥物監(jiān)測結(jié)果的準(zhǔn)確性，為臨床調(diào)整劑量提供依據(jù)。

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Optimization of derivatization conditions by orthogonal experiment of monitoring serum concentration of sodium valproate

Hu Xuefei1,Zhang Yongjun2*,Wei Lihong2,Chen Wen1
(1 School of Pharmacy,Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China;2 The First Affiliated Hospital of Shihezi University,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

In order to optimize the derivatization conditions when the HPLC method was adopted to monitoring the serum concentration of sodium valproate,and investigate the influence of different derivatization conditions on serum concentration of sodium valproate,L9（34） orthogonal experimental design was used to determine the optimal derivatization conditions,the concentration of derivatization reagent,catalyst concentration,temperature and time was used as study factors.Results showed that A2B2C3D1combination was the optimal derivation conditions,so the best derivation condition was that the concentration of derivatization reagent was 2.0 mg/mL,the catalyst concentration was 20%,the reaction temperature was 60℃,and time was 5 min.Different derivatization conditions had a significant effect on the determination results(P<0.05).The primary and secondary factors for the derivatization reaction were derived reagent concentration> derived temperature> catalyst concentration>derivatization time.These findings in our research showed thatthe optimized derivation condition method had high recovery rate,saves time and cost,and simple and feasible.

Derivative conditions;sodium valproate;serum concentration;orthogonal design；optimization

R927.2

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.008

1007-7383(2017)02-0176-06

2016-11-25

新疆兵團(tuán)工業(yè)高新技術(shù)科技攻關(guān)與成果轉(zhuǎn)化項目（2015AB030）

胡雪飛（1989-）女，碩士研究生，專業(yè)方向為臨床藥學(xué)。

*通信作者：張永軍（1972-），男，主任藥師，從事醫(yī)院藥學(xué)與臨床藥學(xué)研究，e-mail：zyjyjk@sina.com。