Kozak序列對nNOS基因表達及神經(jīng)細胞分化的影響

李巧彥，劉宗智，張婷，田云云，張倩，謝建新，王鐵鵬*

（石河子大學醫(yī)學院生物化學教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000）

Kozak序列對nNOS基因表達及神經(jīng)細胞分化的影響

李巧彥，劉宗智，張婷，田云云，張倩，謝建新，王鐵鵬*

（石河子大學醫(yī)學院生物化學教研室/新疆地方與民族高發(fā)病教育部重點實驗室，新疆 石河子 832000）

為探討Kozak調(diào)控序列對nNOS(neuronal nitric oxide synthase，神經(jīng)型一氧化氮合酶)基因表達的影響，并驗證其在神經(jīng)細胞分化過程中的作用。構(gòu)建了含有經(jīng)典Kozak序列調(diào)控元件及野生型前導(dǎo)序列的人源nNOS表達載體；通過qPCR和western blot技術(shù)檢測不同表達載體在SH-SY5Y細胞中的轉(zhuǎn)錄水平和翻譯效率；利用SH-SY5Y神經(jīng)細胞的誘導(dǎo)分化模型進一步驗證不同的nNOS表達調(diào)控序列對于神經(jīng)細胞分化的影響；通過測量和定量神經(jīng)突起長度，結(jié)合qPCR法定量神經(jīng)細胞分化關(guān)鍵標志物Tau和MAP2的表達來表征神經(jīng)細胞分化程度。結(jié)果顯示，經(jīng)典Kozak調(diào)控元件（-3位A和G）和野生型前導(dǎo)序列（含-3位A）都能顯著提高nNOS載體的表達效率，其中，野生型序列效率更高，但Kozak元件和野生型序列均不影響nNOS轉(zhuǎn)錄。在SH-SY5Y神經(jīng)細胞分化模型中，Kozak元件也能促進分化進程，野生型序列的促分化作用最強。由此可知，通過對比不同調(diào)控序列，獲得了以野生型序列引導(dǎo)的nNOS高效表達載體。Kozak元件對不同基因的調(diào)節(jié)效果差異較大，針對特定基因，有必要通過詳細的對比實驗確認最佳調(diào)控序列。

Kozak 序列；nNOS；神經(jīng)細胞分化；Tau；MAP2

Kozak序列是由美國科學家Marilyn Kozak于1987年首先提出的，其基本內(nèi)容是研究蛋白質(zhì)翻譯起始密碼子ATG周邊堿基序列的保守性及其對蛋白表達效率的影響[1]。在真核細胞中，mRNA分子上的Kozak序列可能影響其與核糖體小亞基的結(jié)合及翻譯起始復(fù)合體的組裝[2]。Kozak序列并沒有絕對的規(guī)則，如果將起始密碼子的AUG分別標記為+1、+2、+3位堿基，Marilyn發(fā)現(xiàn)其前方-3位處出現(xiàn)嘌呤堿（尤其是腺嘌呤A），其后方+4位為鳥嘌呤G的概率較高，且-3位嘌呤堿（A或G）和+4位G的出現(xiàn)可能帶來較高的蛋白表達效率?；谏鲜隼碚摚琄ozak序列元件經(jīng)常被用于構(gòu)建真核基因載體，以獲得高表達效率。

然而，進一步的研究發(fā)現(xiàn)，Kozak序列的變異性較大，一致性的Kozak序列在真核生物中出現(xiàn)的比例并不高，而且對于某些基因，加入Kozak元件后，其蛋白表達效率并沒有野生型序列高[2]。上述發(fā)現(xiàn)對Kozak序列的有效性和傳統(tǒng)的質(zhì)粒構(gòu)建經(jīng)驗提出了挑戰(zhàn)。

在本研究中，我們通過構(gòu)建含有Kozak序列關(guān)鍵堿基元件的表達載體，結(jié)合對比野生型nNOS基因前導(dǎo)序列，確定Kozak元件對nNOS基因表達效率的影響，以期獲得nNOS基因的高表達載體，并應(yīng)用于神經(jīng)細胞分化模型中作進一步印證。

1 材料與方法

1.1 試劑和材料

SH-SY5Y細胞購自中國醫(yī)學科學院細胞資源中心；DMEM培養(yǎng)基、qPCR試劑盒購自 Life Technologies公司；胎牛血清采用以色列BI（Biological Industries）產(chǎn)品；RA（all-trans-retinoic acid，全反式視黃酸）購自Sigma公司；質(zhì)粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司；DNA回收試劑盒購自康維世紀生物科技有限公司；限制性內(nèi)切酶、連接酶購自TaKaRa公司；DNA突變試劑盒購自全式金生物技術(shù)有限公司；nNOS抗體及二抗購自Abcam公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、Western發(fā)光試劑盒購自Thermo Scientific公司；PBS-nNOS cDNA、pcDNA3.0為實驗室自有質(zhì)粒和載體。PCR引物合成及DNA測序由上海生工生物工程有限公司完成；其他生化試劑采用國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 3T3-L1細胞培養(yǎng)、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染及誘導(dǎo)分化

SH-SY5Y神經(jīng)母細胞瘤采用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，其成分為高糖DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，添加10%胎牛血清及雙抗（100 mg/L青霉素和100 mg/L硫酸鏈霉素），細胞傳代采用0.25%胰酶消化，以完全培養(yǎng)基終止消化。細胞轉(zhuǎn)染采用Lonza公司的Nucleofector TM2b電轉(zhuǎn)儀，電轉(zhuǎn)程序為G-004。

1.2.2 nNOS克隆及突變體構(gòu)建

PBS載體上的nNOS cDNA采用EcoR I和Xho I雙酶切后凝膠回收，利用T4連接酶克隆到經(jīng)過相同雙酶切處理的pcDNA3.0載體上。Kozak突變體構(gòu)建按照試劑盒步驟進行，關(guān)鍵的Kozak功能元件及其構(gòu)建的突變引物如表1和表2所示。突變體PCR條件為94℃預(yù)變性5 min；PCR反應(yīng)94℃ 30 s，55℃ 30 s,72℃ 5 min，重復(fù)25個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳回收后，加入DMT酶，37℃處理1 h。DMT酶消化產(chǎn)物轉(zhuǎn)化DMT感受態(tài)細菌，利用氨芐青霉素培養(yǎng)板篩選陽性克隆，經(jīng)酶切檢驗及測序后確認正確克隆。

表1 Kozak功能元件Tab.1 Kozak elements

表2 Kozak元件突變引物Tab.2 Kozak element mutation primers

1.2.3 實時定量qPCR

SH-SY5Y細胞用PBS潤洗3次，利用TrizolTM試劑抽提總RNA，按試劑盒程序進行逆轉(zhuǎn)錄，獲得總cDNA。使用qPCR試劑盒，利用ABI 7500 Fast實時熒光定量PCR儀分析樣本中目的基因mRNA含量，使用的引物信息如表3所示。

PCR反應(yīng)體積為 20μL，成分為：cDNA 2 μL，上、下游引物（10 μmol/L）各 0.8 μL，Mixture(2×)10 μL，H2O 6.4 μL。擴增程序條件為：95 ℃預(yù)變性 5 min；PCR反應(yīng) 95 ℃ 15 s，55 ℃ 15 s,72℃ 40 s，重復(fù)30個循環(huán)。擴增結(jié)果以GAPDH為內(nèi)參[3]，利用 2-△△Ct法做相對定量分析。

表3 實時熒光定量PCR引物Tab.3 Primer sequences of Real-time fluorescent quantitative PCR

1.2.4 Western Blot及定量

細胞總蛋白抽提采用RIPA裂解液，使用BCA法定量蛋白濃度，單泳道上樣蛋白25 μg。SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳采用恒壓法，濃縮膠電壓80V，分離膠電壓120 V。蛋白印跡采用濕轉(zhuǎn)法將蛋白轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素（NC）膜上，恒壓濕轉(zhuǎn)條件為80 V，2 h。采用麗春紅S染色，用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液室溫封閉NC膜1 h，之后加入一抗4℃過夜。次日，TBST洗4次，每次10 min。室溫孵育二抗1 h，TBST洗4次，每次10 min。采用ECL試劑盒進行化學發(fā)光，利用ProteinSimple公司的FluoChem HD-2成像儀采集圖片并分析。組間實驗結(jié)果以目的條帶/內(nèi)參條帶的灰度比值形式做半定量分析。

1.2.5 神經(jīng)細胞誘導(dǎo)分化及突起長度統(tǒng)計

SH-SY5Y細胞轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒（8 μg/組）后，以1×104/cm2的密度接種在33 mm直徑培養(yǎng)皿中[4-5]，48 h后，將細胞培養(yǎng)液換為含有2 μmol/L RA的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)72 h后，采用奧林巴斯IX71倒置顯微鏡拍照記錄細胞可見光形態(tài)。神經(jīng)細胞的突起長度采用ImageJ軟件的NeuronJ插件進行分析，突起長度以μm為單位。

1.2.6 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差（X±S）形式表示，組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗，以P<0.05為顯著性差異標準。

2 結(jié)果

2.1 Kozak元件表達載體構(gòu)建

采用EcoR I/Xho I雙酶切法從PBS-nNOS cDNA質(zhì)粒上獲得nNOS片段，通過T4 DNA連接酶連接，將nNOS的cDNA克隆到pcDNA3.0載體上（圖1a），記做no Kozak-nNOS。為檢驗經(jīng)典Kozak序列-3位嘌呤堿的作用，采用DNA突變試劑盒分別構(gòu)建起始密碼子AUG前-3位為A及G的表達載體，記作Kozak-A-nNOS和Kozak-G-nNOS。為對比野生型調(diào)控序列的作用，將AUG前-6至-1位的堿基突變?yōu)橐吧托蛄蠫TTACC，記作Kozak-WT-nNOS。突變后的質(zhì)粒，無法被EcoR I切割，借以鑒別定點突變是否成功。Kozak-A-nNOS載體的鑒定結(jié)果（圖1b）。

圖1 Kozak元件表達載體構(gòu)建及鑒定Fig.1 Kozak element vector construction and identification

2.2 Kozak序列對nNOS轉(zhuǎn)錄水平的影響

SH-SY5Y細胞分為6組，依次為非轉(zhuǎn)染組、pcDNA3.0轉(zhuǎn)染對照組、no Kozak-nNOS組、Kozak-G-nNOS組、Kozak-A-nNOS組和Kozak-WT-nNOS組。轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，繼續(xù)培養(yǎng)48 h收集細胞，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄PCR法獲得總cDNA，qPCR法檢測nNOS和GAPDH mRNA含量，以nNOS/GAPDH表征各組細胞中nNOS mRNA的相對水平。結(jié)果（圖2）顯示，非轉(zhuǎn)染組的nNOS轉(zhuǎn)錄水平較低，轉(zhuǎn)染nNOS各組的mRNA含量都有顯著提高，但是各kozak元件組的nNOS轉(zhuǎn)錄水平并未出現(xiàn)顯著差異。

圖2 Kozak序列對nNOS轉(zhuǎn)錄活性的的影響Fig.2 The impact of Kozak sequences on nNOS transcriptional activity

2.3 Kozak序列對nNOS翻譯水平的影響

SH-SY5Y細胞仍分為6組，細胞轉(zhuǎn)染48 h后RIPA法裂解細胞，抽提蛋白通過western blot法檢測nNOS蛋白含量。

實驗結(jié)果顯示，no-Kozak-nNOS組的蛋白含量相對非nNOS轉(zhuǎn)染組有顯著升高（圖3）。含有Kozak元件的轉(zhuǎn)染組中，nNOS表達水平由低到高依次為Kozak-G-nNOS、Kozak-A-nNOS、Kozak-WT-nNOS 轉(zhuǎn)染組，三組間的蛋白含量有顯著差異（圖3）。另外，Kozak元件各組nNOS蛋白含量相比no-kozak-nNOS組均有顯著性升高。以上數(shù)據(jù)表明，轉(zhuǎn)染無Kozak序列的nNOS質(zhì)粒能在一定程度上提高蛋白的表達量，但Kozak元件對蛋白表達的提升作用更加明顯。Kozak元件中，-3位為A時的表達效率高于G，而野生型的GTTACC（-6至-1位）序列對蛋白表達的貢獻更加明顯。

圖3 Kozak序列對nNOS翻譯活性的影響Fig.3 The impact of Kozak sequences on nNOS translational activity

2.4 Kozak序列對神經(jīng)突起生長的影響

神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）是神經(jīng)細胞分化的必要條件，其產(chǎn)物一氧化氮能夠促進神經(jīng)細胞系和神經(jīng)干細胞向神經(jīng)元的分化[6-8]。我們采用SH-SY5Y細胞的誘導(dǎo)分化模型，進一步檢驗不同的Kozak元件誘導(dǎo)的nNOS表達對于SH-SY5Y細胞分化的影響。6組細胞分別轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒，鋪板后培養(yǎng)48 h，而后添加RA誘導(dǎo)分化72 h，拍照并統(tǒng)計各組神經(jīng)突起長度。

實驗結(jié)果顯示，no-Kozak-nNOS組的神經(jīng)突起顯著長于非nNOS轉(zhuǎn)染組；Kozak-G-nNOS組的突起長度顯著長于no-Kozak-nNOS組；但是kozak-G-nNOS與kozak-A-nNOS的長度未檢測到顯著差異；Kozak-WT-nNOS組的神經(jīng)突起長度在6組中最長（圖4）。

圖4 Kozak序列對神經(jīng)突起生長的影響Fig.4 The impact of Kozak sequences on neurite outgrowth

2.5 Kozak序列對神經(jīng)細胞分化marker的影響

轉(zhuǎn)染不同質(zhì)粒的SH-SY5Y細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，之后RA誘導(dǎo)分化24 h收樣。采用Trizol法提取總RNA，經(jīng)過逆轉(zhuǎn)錄PCR獲得細胞總 cDNA。通過qPCR法，結(jié)合特異性引物分別檢測神經(jīng)細胞分化標志物 Tau[9-11]和 MAP2[12,13]的 mRNA含量。

實驗結(jié)果表明，與非nNOS轉(zhuǎn)染組相比，no-Kozak-nNOS組能顯著提高Tau的 mRNA含量；Kozak元件各組均能顯著升高Tau和MAP2的轉(zhuǎn)錄水平，其中Kozak-WT-nNOS的提升作用最顯著，而Kozak-A-nNOS和Kozak-G-nNOS組的提升效果差異不顯著（圖 5）。

圖5 Kozak序列對神經(jīng)分化marker的影響Fig.5 The impact of Kozak sequences on neuronal differentiation markers

3 討論

信使RNA分子上的Kozak序列參與其同核糖體小亞基的結(jié)合，能夠輔助啟動相關(guān)基因的表達[1,2]，其中，起始密碼子AUG附近-3位的嘌呤堿基和+4位的G被認為是最關(guān)鍵的堿基序列[14-16]。然而，有研究報道，經(jīng)典的Kozak雖然有效，但其序列變異性較大，在真核生物基因中出現(xiàn)頻率并不高，而且野生型非Kozak形式的基因前導(dǎo)序列往往具有比經(jīng)典Kozak序列更高的促翻譯效率[2]，這些發(fā)現(xiàn)給傳統(tǒng)Kozak序列的作用帶來了不確定性。按照研究需要，我們構(gòu)建nNOS基因的過表達載體，為確定經(jīng)典的Kozak序列元件及野生型前導(dǎo)序列對nNOS表達的影響，我們分別構(gòu)建了-3位為A、G堿基以及野生型前導(dǎo)序列GTTACC(-6至-1位)所引導(dǎo)的nNOS過表達載體。經(jīng)典的關(guān)鍵Kozak序列元件還包括+4位的堿基G，但nNOS基因的+4位本身就是該堿基，故不予考慮。我們的實驗結(jié)果表明，Kozak序列元件和野生型前導(dǎo)序列并不影響nNOS基因的轉(zhuǎn)錄（圖2），但在翻譯環(huán)節(jié)上有顯著的調(diào)節(jié)作用（圖3）。與不含Kozak序列的質(zhì)粒相比，-3位的G能顯著提高nNOS的蛋白表達量，-3位為A時，nNOS的蛋白含量更多，而含有野生型前導(dǎo)序列的組別具有最高的蛋白表達水平。由于野生型序列中-3位堿基本身就是A，說明野生序列中的其他堿基也對促進nNOS蛋白翻譯做出重要貢獻，推測可能與加強核糖體的結(jié)合作用有關(guān)。

神經(jīng)型一氧化氮合酶（nNOS）是神經(jīng)細胞分化的必要因素[6-8]，其在神經(jīng)細胞分化中的重要性在神經(jīng)干細胞和神經(jīng)細胞系的分化模型中都得到證實。為了進一步印證Kozak調(diào)控序列元件和野生型前導(dǎo)序列對nNOS表達的影響，我們利用神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞系的誘導(dǎo)分化模型確認不同調(diào)控序列對于神經(jīng)細胞分化的影響，并以分化細胞的突起長度及分化標志物Tau和MAP2[9-13]的表達水平作為描述其分化水平的依據(jù)。在神經(jīng)突起生長方面，過表達無引導(dǎo)序列的nNOS就可以顯著增加突起長度，-3位G和A堿基的引入，進一步增加神經(jīng)突的生長，野生型前導(dǎo)序列組的神經(jīng)突最長（圖4）。在神經(jīng)分化marker方面，-3位的G和A也能顯著提高Tau和MAP2的含量（雖然G與A組的差別不顯著），野生型序列組的分化marker含量最高。Kozak調(diào)控序列在分化模型中的作用與生化檢測結(jié)果基本一致，即經(jīng)典的Kozak調(diào)控序列能夠增加nNOS蛋白的表達，但野生型引導(dǎo)序列（含-3位Kozak堿基A）的促進效率更高，體現(xiàn)了自然選擇的高效性[2]。據(jù)此，我們選擇野生型的GTTACC作為nNOS表達的前導(dǎo)序列，用于后續(xù)的研究工作。

Kozak序列對于不同基因的引導(dǎo)作用差異較大，有的基因并不具有經(jīng)典的Kozak調(diào)節(jié)序列，甚至非Kozak型翻譯前導(dǎo)序列的效率遠遠高于經(jīng)典的Kozak模式[1-2]，因此，為不同的基因選擇翻譯前導(dǎo)序列必須做詳細的對比實驗，以達到更高的表達效率。本研究以此種思路篩選和優(yōu)化了促進nNOS基因高表達的翻譯引導(dǎo)序列，并在神經(jīng)細胞分化模型中得到驗證。該種方法可以推廣到人體及動植物基因工程研究各領(lǐng)域，以期得到更顯著的表達效率和收益。

[1] Kozak M.An analysis of 5'-noncoding sequences from 699 vertebrate messenger RNAs[J].Nucleic Acids Res,1987,15(20):8125-8148.

[2] Grzegorski S J,Chiari E F,Robbins A,et al.Natural variability of Kozak sequences correlates with function in a zebrafish model[J].PLoS One 2014,9(9):108475.

[3] Soppa U,Schumacher J,Florencio Ortiz V,et al.The Downsyndrome-related protein kinase DYRK1A phosphorylates p27(Kip1)and Cyclin D1 and induces cell cycle exit and neuronal differentiation[J].Cell Cycle，2014,13(13):2084-2100.

[4] Encinas M,Iglesias M,Liu Y,et al.Sequential treatment of SH-SY5Y cells with retinoic acid and brain-derived neurotrophic factor gives rise to fully differentiated,neurotrophic factor-dependent,human neuron-like cells[J].J Neurochem，2000,75(3):991-1003.

[5] Fujibayashi T,Kurauchi Y,Hisatsune A,et al.Mitogenactivated protein kinases regulate expression of neuronal nitric oxide synthase and neurite outgrowth via non-classical retinoic acid receptor signaling in human neuroblastoma SH-SY5Y cells[J].J Pharmacol Sci 2015,129(2):119-126.

[6] Peunova N,Enikolopov G.Nitric oxide triggers a switch to growth arrest during differentiation of neuronal cells[J].Nature，1995,375(6526):68-73.

[7] Luo C X,Jin X,Cao C C,et al.Bidirectional regulation of neurogenesis by neuronal nitric oxide synthase derived from neurons and neural stem cells[J].Stem Cells 2010,28(11):2041-2052.

[8] 薩喆燕，郭試瑜，單立冬，等.一氧化氮促進體外培養(yǎng)大鼠腦室下區(qū)神經(jīng)干細胞的分化 [J].中國應(yīng)用生理學雜志,2010,26(3):359-364.Sa Z Y,Guo S Y,Shan L D,et al.Nitric oxide promotes the differentiation of neural stem cells in vitro derived from the subventricular zone of neonatal rats[J].Chin J Appl Physiol,2010,26(3):359-364.

[9] Yan Y,Zhao J,Cao C,et al.Tetramethylpyrazine promotes SH-SY5Y cell differentiation into neurons through epigeneticregulation ofTopoisomeraseIIbeta[J].Neuroscience 2014(278):179-193.

[10]Graser S,Mentrup B,Schneider D,et al.Overexpression of tissue-nonspecific alkaline phosphatase increases the expression of neurogenic differentiation markers in the human SH-SY5Y neuroblastoma cell line[J].Bone，2015(79):150-161.

[11]Agholme L,Lindstrom T,Kagedal K,et al.An in vitro model for neuroscience:differentiation of SH-SY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons[J].J Alzheimers Dis，2010,20(4):1069-1082.

[12]Xue T,Wei L,Zha D J,et al.Exposure to acoustic stimuli promotes the development and differentiation of neural stem cells from the cochlear nuclei through the clusterin pathway[J].Int J Mol Med，2015,35(3):637-644.

[13]Zogovic N,Tovilovic-Kovacevic G,Misirkic-Marjanovic M,et al.Coordinated activation of AMP-activated protein kinase,extracellular signal-regulated kinase,and autophagy regulates phorbol myristate acetate-induced differentiation of SH-SY5Y neuroblastoma cells[J].J Neurochem，2015,133(2):223-232.

[14]Xu H,Wang P,You J,et al.Screening of Kozak-motiflocated SNPs and analysis of their association with human diseases[J].Biochem Biophys Res Commun，2010,392:89-94.

[15]Kozak M.An analysis of vertebrate mRNA sequences:intimations of translational control[J].J Cell Biol，1991,115(4):887-903.

[16]Kozak M.Recognition ofAUG and alternative initiator codons is augmented by G in position+4 but is not generally affected by the nucleotides in positions+5 and+6[J].Embo J，1997,16(9):2482-2492.

The effect of Kozak sequence on the expression of nNOS and neuronal cell differentiation

Li Qiaoyan,Liu Zongzhi,Zhang Ting,Tian Yunyun,Zhang Qian,Xie Jianxin,Wang Tiepeng*
(The Key Laboratory of Xinjiang Endemic and Ethnic Diseases/Department of Biochemistry/School of Medicine,Shihezi University 832000,Shihezi,Xinjiang 832002,China)

To investigate the regulatory role of canonical Kozak sequence in nNOS expression,and to validate this role in neuronal cell differentiation process.The nNOS expression vectors containing canonical Kozak sequence elements or wild type leader sequence were constructed and the transcriptional and translational efficiency of these vectors in SH-SY5Y cell line was identified by western blot and qPCR methods.The effect of different nNOS leader sequences on neuronal differentiation was further tested in drug induced SH-SY5Y differentiation model.The differentiation degree of neuronal cell was described by both the neurite length quantification and the content of key differentiation markers,Tau and MAP2，through qPCR.Though the canonical Kozak sequence elements(A or G at-3 residue)and the wild type leader sequence(containing A at-3 residue)didn't affect the nNOS transcriptional level,both the two kinds of sequences could significantly increase the expression efficiency of nNOS,with a higher efficiency by the wild type sequence.In the SH-SY5Y differentiation models,Kozak elements could also promote the differentiation process,and a stronger promotional effect was achieved by the wild type sequence.By comparing the effects of different regulatory sequences,we final obtained a high efficiency expression vector containing the wild type leader sequence.Kozak elements may have distinct regulatory roles for some specific genes,so it is necessary to optimize the regulatory sequence through detailed comparison study.

Kozak sequence;nNOS;neuronal cell differentiation;Tau;MAP2

Q786

A

10.13880/j.cnki.65-1174/n.2017.02.005

1007-7383(2017)02-0157-06

2016-12-20

國家自然科學基金項目（81460202），新疆兵團重點領(lǐng)域科技攻關(guān)項目（2014BA041），生物大分子國家重點實驗室開放課題（2013kf07)

李巧彥（1989-），女，碩士研究生，專業(yè)方向為生物化學與分子生物學。

*通信作者：王鐵鵬（1979-），男，副教授，從事醫(yī)學分子生物學研究，e-mail:wangtiepeng2002@163.com。